益生元是人体无法消化吸收的食物成分,多为多糖、寡糖或其他天然植物成分,可促进宿主体内活性微生物的生长或繁殖[1]。益生元具有改善免疫调节、抵抗病原体、影响新陈代谢、增强健康的作用,还具有调整肠道微生态、促进钙的吸收以及降血脂的功能,能够对宿主造成有益的影响[2]。此外,益生元在肠道经过益菌微生物发酵后,能够产生短链脂肪酸、维生素和其他碎片分子[3]。
柑橘类水果是最普遍被食用的一种世界大宗型水果,其中含有大量有益的次生代谢产物[4]。柑橘果皮作为柑橘加工的主要副产物,占鲜果的1/3左右,通常不会被利用,造成环境污染。然而,柑橘皮含有大量的生物活性成分,如类黄酮、类柠檬素、精油和果胶[5]。其中柑橘果胶(citrus pectin,CP)是从柑橘属水果中提取的一种酸性杂多糖,其分子质量为50～300 kDa。果胶丰富的结构特性赋予其多样化的生物功能,如抗氧化、抗炎、生物活性传递、抗癌、益生元、吸附重金属等[6-7]。柑橘果胶分子质量巨大,虽然具有高度多样性的结构,但溶解性较低,导致其生物利用度下降[8]。化学修饰法通过化学方法将其他活性基团引入多糖链,增强天然多糖生物活性,是解决天然多糖水溶性差和生物活性低的常用方法,其中成本低、反应产物无毒性的羧甲基化修饰是提高多糖水溶性最常用的化学修饰方法[9]。李雪晖等[10]制备的羧甲基化南瓜多糖具有更强的抗氧化能力且能提高其对α-葡萄糖苷酶的抑制活性。TANG等[11]制备的羧甲基化广金钱草多糖显著提高原多糖的抗氧化能力与修复受损细胞能力。李霞等[12]制备的羧甲基化木聚糖具备更为显著的益生元作用。然而,关于羧甲基化CP的生物活性相关研究鲜有报道。本实验以CP为原料,探究羧甲基化柑橘果胶(carboxymethyl citrus pectin,CCP)对4种益生菌的益生元作用,在医药保健等领域开发新一代益生元产品、充分利用农业食品废弃物和改善环境方面具有重大意义。
1 材料与方法
1.1 试剂与仪器
CP、低聚果糖(fructo-oligosaccharides,FOS),上海源叶生物科技有限公司;嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)GIM1.540、德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus)GIM1.155、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)GIM1.191、短乳杆菌(Lactobacillus brevis)GIM1.773,广东省微生物菌种保藏中心;MRS培养基、二硝基水杨酸、氯乙酸、NaOH、α-淀粉酶、胰蛋白酶及其他试剂,分析纯,市售。
SQP电子天平,赛多利斯科学仪器有限公司;UV760CRT型紫外可见分光光度计,上海傲谱分析仪器有限公司;LRH-250-Z振荡培养箱,韶关市泰宏医疗器械有限公司;3 500 Da透析袋,北京瑞达恒辉科技发展有限公司;Nicolet IS10型傅立叶红外光谱仪,美国Thermo Fisher公司;LDZX-50KBS型立式压力蒸汽灭菌器,上海申安医疗器械有限公司;ALPHA1-2 LD冷冻干燥机,德国Martin Christ 公司。
1.2 实验方法
1.2.1 CCP的制备
在50 mL异丙醇和20 mL 5 mol/L的NaOH溶液中加入0.24 g CP,在冰浴条件下搅拌3 h。在50 mL异丙醇与20 mL 5 mol/L的NaOH溶液中加入6 g氯乙酸,搅拌均匀。将NaOH-氯乙酸溶液缓慢滴入反应体系,于60 ℃条件下搅拌3 h,结束反应。待溶液冷却至室温,以1 mol/L的HCl溶液调至pH 7.0,蒸馏水透析24 h。减压浓缩后冻干,制得CCP[12]。
1.2.2 取代度的测定
取代度测定采用滴定法[13],取10 mg CCP溶于3 mL 70%(体积分数)乙醇,静置5 min后将10 mL蒸馏水、50 mL 0.5 mol/L NaOH溶液依次加入其中。待样品完全溶解,以0.5 mol/L HCl溶液滴定,采用酚酞显示点,计算1 g CCP所需HCl的毫摩尔数(A),计算如公式(1)所示:
A=[V0c0-(V2-V1)c]/m
(1)
式中:V0,消耗NaOH的体积,mL;V1,空白样品测定消耗HCl的体积,mL;V2,样品测定消耗HCl的体积,mL;c0,加入的NaOH浓度;c,加入的HCl浓度,mol/L;m,测定所用样品的质量,g。
CCP取代度(degree of substitution,DS)计算如公式(2)所示:
DS=0.162A/(1-0.058A)
(2)
式中:A,1 g样品所需HCl的物质的量,mmol。
1.2.3 傅里叶变换红外光谱检测
以1∶100(质量比)称取CP和CCP分别与KBr混合研磨,压片,在4 000～400 cm-1波长处对样品进行红外光谱扫描。
1.2.4 模拟人体抗消化性实验
模拟唾液消化的测定。取0.191 g NaCl、0.373 g KCl、0.033 g CaCl2溶于250 mL水,用1 mol/L的HCl溶液将混合溶液pH值调至6.9得到模拟唾液。称取α-淀粉酶0.086 g加入100 mL模拟唾液中溶解,磁力搅拌20 min后用漏斗过滤,滤液中再加入100 mL的模拟唾液溶液混匀。分别配制1 mg/mL CCP、CP和FOS溶液,按照V(多糖溶液)∶V(模拟唾液)=1∶1添加模拟唾液,于37 ℃恒温振荡器中反应,以模仿口腔环境。在0 h和0.5 h采集样品,沸水浴5 min使α-淀粉酶灭活。还原糖的测定采用二硝基水杨酸比色法,总糖含量的测定采用苯酚-硫酸法[14]。根据公式(3)计算水解度。
水解度/%=A/(B-C)×100
(3)
式中:A,某时间点取样测得的还原糖含量,g/L;B,溶液中的总糖含量,g/L;C,模拟消化前的还原糖含量,g/L。
模拟胃液消化的测定。缓冲溶液的配制:称取2.06 g Na2HPO4,3.59 g NaH2PO4,2 g NaCl,0.05 g KCl,0.025 g CaCl2·2H2O,0.045 g MgCl2·6H2O,溶于250 mL蒸馏水。以1 mol/L HCl溶液将3份上述缓冲液的pH值分别调至1、2、3得到不同pH下的模拟胃液。在10.0 mL不同pH下的模拟胃液中分别加入100 mg CCP、CP和FOS,37 ℃恒温水浴加热。在反应进行至4 h和6 h时,3组样品溶液中各取1.0 mL反应溶液测定还原糖和总糖的含量。根据公式(3)计算水解度。
模拟小肠液消化的测定。取3.4 g KH2PO4溶于200 mL水中,用4 g/L的NaOH溶液调pH值至6.8。称取胰蛋白酶2.5 g,溶至调节pH后的溶液中并定容至250 mL,使胰蛋白酶的终质量浓度为0.01 g/mL,置于36 ℃恒温水浴搅拌混匀得到模拟小肠液[12]。
配制1 mg/mL CCP、CP和FOS溶液,将多糖溶液与模拟小肠液1∶1(体积比)混合均匀,在反应进行至4 h和6 h时,3组样品溶液中各取1.0 mL反应溶液测定溶液中的还原糖和总糖的含量。根据公式(3)计算水解度。
1.2.5 CCP对肠道益生菌生长速率的影响
取200 μL甘油保存的菌种接种于液体培养基中37 ℃培养48 h,活化2次。配制CCP、CP和FOS质量浓度分别为5、10、15、20、30 g/L的液体培养基,分别接种1%充分活化的菌悬液,在37 ℃条件下培养48 h后检测培养基中菌悬液的OD600值和pH值[15],以FOS作为阳性对照。配制最佳浓度的CCP和相同浓度的CP、FOS培养基,分别接种1%充分活化的菌悬液,37 ℃下振荡培养48 h。前24 h间隔2 h,后24 h间隔6 h,于无菌环境下检测菌悬液pH值并取100 μL菌悬液转移至比色皿中测定OD600值,实验以FOS作为阳性对照。以培养时间为横坐标,OD600值为纵坐标,绘制4种益生菌生长曲线,拟合曲线方程,计算益生菌的最大生长速率和延滞期。以时间为横坐标,pH值为纵坐标,绘制微生物产酸曲线。
1.3 数据分析
所有实验重复3次,实验结果均以平均值±标准误差的形式表示,采用Origin 9.8软件绘图。
2 结果与分析
2.1 红外光谱结果分析
由图1可知,CP和CCP具有果胶的特征峰,在3 420 cm-1左右有一个O—H的振动吸收峰,在2 926 cm-1附近有糖类C—H的伸缩振动峰,1 620 cm-1左右有羧酸盐—COO—的不对称伸缩振动峰,这属于糖水化物的特征吸收峰[16],1 300 cm-1左右有C—O—C拉伸,1 000 cm-1左右有C—O拉伸。羧甲基化CP在1 616、1 419、1 313 cm-1附近分别出现了C
O、C—O、COO—的特征吸收峰[17],证明CP羧甲基化修饰成功。根据滴定法计算得出CCP取代度的毫摩尔数(A)=2.333,DS=0.437 1。
图1 羧甲基化柑橘果胶红外光谱图
Fig.1 Infrared spectra of carboxymethylated citrus pectin
2.2 CCP对抗消化性实验结果分析
2.2.1 CCP模拟唾液消化实验结果分析
如表1所示,在模拟唾液消化实验中,FOS、CP和CCP在反应0.5 h后测得的水解度分别为5.66%、2.18%、2.61%,CPP在模拟唾液中的水解度高于CP,可能是CP经过羧甲基化修饰后分子质量变小,溶解度增加,导致其水解度有了小幅度的上升,但仍低于FOS,较低的水解度说明CP经过羧甲基化修饰后在抵抗模拟唾液消化方面仍具有良好的作用。
表1 CCP在模拟唾液、胃液和小肠液中的水解度 单位:%
Table 1 CCP hydrolysis degree in simulated salivary, gastric and intestinal conditions
组别0.5 h后水解度(模拟唾液)4 h后水解度(模拟胃液)6 h后水解度(模拟胃液)pH 1pH 2pH 3pH 1pH 2pH 34 h后水解度(模拟小肠液)6 h后水解度(模拟小肠液)FOS5.66±0.0483.03±0.0472.71±0.0391.13±0.0063.22±0.0292.61±0.0350.88±0.0073.11±0.0063.54±0.009CP2.18±0.0182.13±0.0391.74±0.0412.15±0.0695.53±0.0423.51±0.0412.92±0.0283.36±0.023.77±0.008CCP2.61±0.0172.04±0.0041.73±0.0312.58±0.0225.62±0.0064.11±0.0322.76±0.0061.09±0.0091.78±0.013
2.2.2 CCP模拟胃液消化实验结果分析
人体胃酸的pH值一般为1～3,食物进入胃之后停留时间为4～6 h[18]。CCP要作为益生元被肠道益生菌所利用,必须经过胃部的消化才能到达肠道。设计实验模拟pH 1～3的胃液,对CCP进行4～6 h的模拟消化反应,分析CCP在益生元方面的潜力。如表1所示,在反应4 h时,CCP在pH 3的模拟胃液中水解度高于pH 1,但在反应6 h后,pH 3条件下的CCP水解度与反应4 h时相仿,在pH 1的模拟胃液中,CCP的水解度达到了最高,总的来说,随着反应时间的延长与pH值的降低,CCP在模拟胃液中的水解度呈上升的趋势。模拟胃液pH值为1时,在反应6 h后,FOS、CP和CCP的水解度均达到最大值,分别为3.22%、5.53%和5.62%。CCP在模拟胃液环境中水解度低于6%,说明其能较好地抵抗胃液的消化。结果与余茂元[19]的抗消化性实验结果一致。
2.2.3 CCP模拟小肠液消化实验结果分析
如表1所示,在模拟小肠液消化实验中,FOS、CP和CCP在反应4 h和6 h的水解度分别为3.11%、3.36%、1.09%和3.54%、3.77%、1.78%。CCP的最大水解度低于2%,且低于FOS和CP,表明CP在经过羧甲基化修饰后在小肠消化环境中具有更好的抗消化性。综上所述,在模拟人体对抗消化性实验中,CCP证明了其拥有较好的抵抗人体唾液、胃液和小肠液消化的能力。
2.3 CCP对益生菌增殖的影响
如图2所示,将不同质量浓度FOS、CP和CCP添加至4种益生菌液体培养基培养48 h后,所有培养基的OD600值都出现了不同程度的上升,说明培养基中活细菌数量在增大,细菌能够分解利用3种样品进行增殖。在以CCP为碳源的培养基中,植物乳杆菌、德氏乳杆菌保加利亚亚种和嗜热链球菌在5～30 g/L随着质量浓度增大OD600值也在不断增大,3种益生菌的增殖最佳质量浓度都为30 g/L。在短乳杆菌培养基中,OD600值在5～15 g/L随质量浓度升高而增大,在15 g/L达到最大值后OD600值不再上升,因此对短乳杆菌来说,15 g/L是其增殖的最佳质量浓度。这也证明了多糖添加量并不是越多越好,可能是当多糖添加量过大,多糖浓度过高时,会导致液体培养基的渗透压过高,进而导致细菌脱水死亡,抑制了细菌的增殖[18]。在CCP的最佳浓度下,可以看出以CCP为碳源的培养基OD600值与FOS组相仿,高于CP组,说明CP经过羧甲基化修饰后,能够更加便于被益生菌分解利用,从而促进益生菌的增殖。
a-短乳杆菌;b-植物乳杆菌;c-德氏乳杆菌保加利亚亚种;d-嗜热链球菌
图2 不同浓度CCP多糖对益生菌生长的影响
Fig.2 Effects of different concentrations of CCP polysaccharides on the growth of probiotics
如图3所示,以CCP为碳源的培养基中,短乳杆菌、植物乳杆菌、德氏乳杆菌、嗜热链球菌分别在培养18、24、20、22 h后细菌浓度达到最大值。随着培养时间加长,细菌浓度上下浮动,但变化不大。在相同浓度下,CCP对4种益生菌促进增殖的效果高于CP,这说明CCP对益生菌的生长有良好的促进作用,是一种具有发展潜力的益生元,这与探索CPP最佳浓度对益生菌增殖影响的实验结果一致。
a-短乳杆菌;b-植物乳杆菌;c-德氏乳杆菌保加利亚亚种;d-嗜热链球菌
图3 最佳浓度多糖对益生菌增殖的影响
Fig.3 Effect of optimal concentration of polysaccharide on the proliferation of probiotics
CCP对益生菌的增殖作用高于CP,低于FOS,可能有以下几种原因:1)聚合度低的多糖作为碳源更容易被益生菌分解利用,而聚合度低的多糖一般分子质量较小,所以聚合度低的FOS对4种益生菌的增殖效果比CP和CCP明显[20],而羧甲基化修饰过程中存在使得多糖部分降解的可能[21],使得CCP分子质量变小。2)羧甲基为亲水基团,能够提升多糖的亲水性,使多糖溶解度增加并提升多糖活性,使得CCP更好地被益生菌分解利用,所以其益生元作用要优于CP[17]。但多糖的益生元作用不仅仅受聚合度以及水溶性的影响,多糖的结构、组成、提取方式或纯度都会对其益生元作用造成一定的影响,所以CCP的益生元效果优于CP的具体原因有待进一步研究。
益生菌在利用糖类物质生长代谢时,会产生酸性代谢产物,引起培养基pH的变化。从图4的pH值变化曲线可以看出,3种多糖培养基在培养12～20 h出现了pH值大幅下降,说明此时菌体的生长旺盛,酸性代谢产物开始大量产生,在20～30 h达到最大。20 h之后细菌生长达到生长稳定期,pH值基本保持不变。在图4中可以看出,在pH值稳定后,FOS培养基pH值最低,CCP培养基pH值次之,CP培养基pH值最低,证明CCP能够更好地被益生菌分解利用。
a-短乳杆菌;b-植物乳杆菌;c-德氏乳杆菌保加利亚亚种;d-嗜热链球菌
图4 四种益生菌生长48 h pH值变化
Fig.4 pH value changes of four probiotics in 48 hours
3 结论
本研究制得CCP,通过模拟人体消化实验和益生菌增殖影响实验,探究其在人体消化环境中的抗消化性和其对4种人体常见肠道有益菌的益生元作用。红外光谱图分析表明CP羧甲基化修饰成功;模拟人体消化实验结果表明,CCP在模拟唾液、胃液和小肠液中的水解度分别低于3%、6%和2%,证明其在人体消化道具有较好的抗消化性,能顺利进入肠道被肠道益生菌分解利用;CCP促进短乳杆菌增殖的最佳质量浓度为15 g/L,对另外3种实验益生菌为30 g/L,在培养4种不同益生菌的培养基中,测得OD值有不同程度的上升,pH值有不同程度的下降,CCP对4种益生菌的促进增殖作用弱于FOS,但优于CP,表明CP在经过羧甲基化修饰后能够更好地被肠道益生菌分解利用。研究可知,羧甲基化CP在对人体肠道益生菌的促进增殖作用优于CP,是一种具有发展潜力的益生元,大量的柑橘果皮资源使得羧甲基化CP在医药保健等领域开发新一代益生元产品具有极大地潜力,同时在充分利用农业食品废弃物和改善环境方面具有重大意义。
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