金针菇(Flammulina velutipes)学名毛柄金钱菌,广泛分布于自然界,是常见的食药两用菌。金针菇富含蛋白质、维生素、膳食纤维、矿物质、多糖、黏多糖、构菌素、火菇素等,营养价值较高,具有抗肿瘤、抗疲劳、抑菌消炎和抗病毒等功效,深受人们喜爱[1]。然而,金针菇由于含水量较高,采后蒸腾作用和呼吸作用旺盛,常常会出现褐变、失水、腐烂等现象,导致金针菇品质劣变[2],缩短其贮藏期,严重制约了金针菇的销售运输,阻碍了金针菇产业的发展。因此,开发安全高效的金针菇贮藏保鲜方法对于金针菇产业的发展具有重要意义。
褪黑素(melatonin,MT),又名N-乙酰-5-甲氧基色胺、松果腺素、抑黑素、美拉酮宁等,是一种存在于生物体内的吲哚胺类化合物,具有抗炎、抗氧化作用,可参与调节果蔬的生长、分化、成熟、衰老、防御等多种生理活动,延缓采后果蔬的衰老进程,延长其贮藏期[3]。BOONSIRIWIT等[4]研究发现MT处理能降低绿芦笋木质素含量,抑制其木质化进程,维持绿芦笋较高采后品质。WANG等[5]研究表明MT处理能抑制荔枝果实在贮藏过程中发生褐变,保持荔枝较好的外观品质。SHARAFI等[6]研究认为MT处理能抑制冷藏期间甜樱桃果实褐变和腐烂,延缓甜樱桃衰老过程。BHARDWAJ等[7]表明MT处理能缓解芒果果实低温贮藏过程中冷害发生,维持芒果较优的低温贮藏品质。综上,MT处理对于维持采后果蔬贮藏品质具有较好的作用。然而,目前关于MT对金针菇贮藏保鲜效果的研究鲜有报道。因此,本试验采用不同浓度MT处理金针菇,研究MT对低温贮藏过程中金针菇品质及褐变的影响,以期为MT在金针菇贮藏保鲜的应用提供理论依据。
本试验用金针菇采购于河南省洛阳市耀恒食用菌有限公司,挑选新鲜、色泽洁白、无损伤、无开伞、形态完整的金针菇,备用。
MT、盐酸羟胺、α-萘胺、对氨基苯磺酸、四氯化钛、甲硫氨酸、氮蓝四唑、核黄素、H2O2、2,6-二氯靛酚钠、酚酞、乙二胺四乙酸二钠,国药集团化学试剂有限公司;愈创木酚、聚乙烯吡咯烷酮 (polyvinyl pyrrolidone,PVP),北京索莱宝科技有限公司;没食子酸、L-苯丙氨酸、邻苯二酚,上海源叶生物科技有限公司。
HWS-300智能恒温恒湿箱,浙江托普云农科技股份有限公司;UV-1800紫外可见分光光度计,日本岛津公司;TGL-20M 台式高速冷冻离心机,湖南湘仪实验室仪器开发有限公司;DDSJ-308A 电导率仪,上海精密科学仪器有限公司;WYT 手持折光仪,成都光学厂;HH-2 型电热恒温水浴锅,北京科伟永兴仪器有限公司。
1.3.1 材料处理
将金针菇分别用50、100、200 mmol/L MT溶液常温(约25 ℃)浸泡10 min,以浸泡蒸馏水为对照,散开置阴凉处自然风干8 h,之后装入干净塑料筐中,每筐约1 000 g,筐外套0.05 mm厚聚乙烯薄膜袋,袋不封口,置于4 ℃恒温恒湿箱中贮藏12 d。每3 d取样一次,用于各种指标的测定。
1.3.2 褐变度测定
参考牛耀星等[8]方法并略微修改。5 g金针菇样品(菌柄和菌盖混合物,下同)加入5 mL 20 mmol/L K3PO4缓冲液(pH 7.8)冰浴研磨,4 ℃、10 000 r/min离心15 min后测定上清液在420 nm下吸光度值,结果以A420 nm表示。
1.3.3 呼吸强度的测定
采用碱液吸收法测定[9]。取150 g金针菇放入玻璃干燥器中,封盖密闭0.5 h,采用0.2 mol/L草酸溶液滴定,计算出金针菇的呼吸强度,结果以mg/(kg·h)表示。
1.3.4 失重率测定
采用称重法,每组金针菇样品约100 g,测定贮藏前后金针菇的质量,计算质量损失,以质量损失占初始质量的百分比表示。
1.3.5 可溶性固形物和抗坏血酸含量测定
5 g金针菇样品挤压得到汁液,采用手持折光仪测定可溶性固形物含量,结果以质量分数(%)表示。
10 g金针菇样品用20 g/L草酸研磨定容至100 mL,参照侯权等[9]方法测定抗坏血酸含量,结果以mg/100 g表示。
1.3.6 ·O2-产生速率测定
参考王霆等[10]方法测定。5 g金针菇样品加入5 mL 100 mmol/L磷酸缓冲液[pH值为7.8,内含0.1 mmol/L 乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid,EDTA)溶液和体积分数1% PVP]冰浴研磨后离心(4 ℃、10 000 r/min离心15 min)得上清液。1 mL上清液加入1 mL 50 mmol/L pH值为7.8 磷酸缓冲液和1 mL 1 mmol/L盐酸羟胺溶液,37 ℃保温60 min后加入1 mL 7 mmol/L α-萘胺溶液和1 mL 17 mmol/L对氨基苯磺酸溶液,显色10 min,测定530 nm处吸光度值,以NaNO2溶液作标准曲线计算·O2-生成速率,结果以nmol/(min·g)FW表示。
1.3.7 H2O2含量测定
参考王霆等[10]方法测定。5 g金针菇样品加入5 mL预冷丙酮,冰浴研磨后离心(4 ℃、10 000 r/min离心15 min)得上清液。1 mL上清液加入0.1 mL 10%四氯化钛-盐酸溶液和0.2 mL浓氨水,将得到沉淀加入3 mL浓硫酸溶解,测定410 nm处吸光度值,结果以μmol/g FW表示。
1.3.8 超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性测定
采用氮蓝四唑光还原法测定[10]。5 g金针菇样品加入5 mL 100 mmol/L pH值为7.8硼酸硼砂缓冲液(含体积分数为1% PVP),冰浴研磨后离心(4 ℃、10 000 r/min离心15 min)得酶液。0.1 mL 酶液加入 3 mL 50 mmol/L 磷酸缓冲液(pH值为7.8,含0.13 mol/L 甲硫氨酸,0.75 mmol/L 氮蓝四唑,0.2 mmol/L 乙二胺四乙酸二钠及0.02 mmol/L 核黄素),光照反应20 min后测定560 nm下吸光值。以每分钟每克金针菇反应体系对氮蓝四唑光化还原的抑制为50%为1个SOD活性单位U,结果以U/(min·g)FW表示。
1.3.9 过氧化物酶(peroxidase,POD)活性测定
参照KHADEMI等[11]方法测定并稍作修改。5 g金针菇样品加入5 mL 100 mmol/L 磷酸缓冲液(pH值为7.0,含体积分数为10% PVP、1 mmol/L EDTA溶液、2 mmol/L二巯苏糖醇)冰浴研磨后离心(4 ℃、12 000 r/min离心20 min)得酶液。0.5 mL酶液加入3 mL愈创木酚溶液(25 mmol/L)和200 μL H2O2溶液(0.5 mol/L),在470 nm下测定吸光度。以每克金针菇鲜样每分钟增加0.01个吸光度值为1个POD活性单位U,结果以U/(min·g)FW表示。
1.3.10 过氧化氢酶(catalase from micrococcus lysodeikticus,CAT)活性测定
参照刘云芬等[12]方法并略作修改。5 g金针菇样品加入5 mL 50 mmol/L磷酸缓冲液(pH值为7.8、体积分数为1% PVP),冰浴研磨后离心(4 ℃、12 000 r/min离心20 min)得酶液。0.2 mL酶液加入2.8 mL H2O2溶液(20 mmol/L),在240 nm下测定吸光度变化。以每克金针菇鲜样每分钟减少0.01个吸光度值为1个CAT 活性单位U,结果以U/(min·g)FW 表示。
1.3.11 总酚含量测定
采用盐酸-甲醇法测定[13]。2 g金针菇样品加入体积分数为1% HCl-甲醇溶液,研磨后定容至25 mL,避光提取30 min,测定760 nm下吸光值,以没食子酸作标准曲线,计算总酚含量,结果以mg/100 g表示。
1.3.12 苯丙氨酸解氨酶(phenylalanineammonialyase,PAL)活性测定
参考王锋等[14]方法测定。5 g金针菇样品加入5 mL 0.1 mol/L硼酸硼砂缓冲液(pH值为8.8,内含5% PVP,2 mmol/L EDTA溶液和5 mmol/L β-巯基乙醇溶液),低温研磨后离心(4 ℃、10 000 r/min离心15 min)得酶液。反应体系为3 mL硼酸缓冲液(50 mmol/L,pH 8.8)、0.5 mL L-苯丙氨酸溶液(20 mmol/L)和0.5 mL酶提取液,37 ℃保温60 min,加入0.1 mL 6 mol/L HCl溶液终止反应,在290 nm下则定吸光值,以每克金针菇每分钟增加0.01个吸光值为1个PAL活性单位U,结果以U/(min·g)FW表示。
1.3.13 多酚氧化酶(polyphenol oxidase,PPO)活性测定
采用张雨等[13]方法。5 g金针菇样品加入5 mL 0.1 mol/L乙酸-乙酸钠缓冲液(pH值为5.5,体积分数为4% PVP),冰浴研磨后离心(4 ℃、10 000 r/min离心20 min)得酶液。反应体系为4 mL醋酸-醋酸钠缓冲液(50 mmol/L,pH值为5.5)、1 mL 邻苯二酚溶液(50 mmol/L)和0.5 mL酶提取液,在420 nm下测定吸光值,以每克金针菇每分钟增加0.01个吸光值为1个PPO活性单位U,结果以U/(min·g)FW表示。
各个指标均做3次平行,采用Origin 2017软件进行绘图,采用SPSS 24.0软件进行差异显著性分析(P<0.05为差异显著)。
褐变是造成果蔬商品价值降低的主要原因,褐变度能反映采后果蔬褐变程度[12]。MT处理对金针菇贮藏品质及褐变度的影响见图1和图2。由图1和图2可知,贮藏前3 d,3个MT处理组和对照组褐变度没有明显差异,贮藏3 d后,金针菇褐变度均呈不断上升趋势,对照组褐变度上升速度最快,且在贮藏6~12 d期间褐变度显著高于3个MT处理组(P>0.05)。贮藏第6天时,对照组金针菇褐变度为2.043,菇体开始出现明显的褐变现象,3个MT处理组金针菇外观褐变程度较轻,品质较好;贮藏第9天时,100 mmol/L MT处理组金针菇褐变度为1.855,贮藏12 d时,200 mmol/L MT处理组金针菇褐变度为1.862,均低于对照组第6天时的褐变度,说明100和200 mmol/L MT处理能有效延缓金针菇的褐变,维持其较好贮藏品质,其中200 mmol/L MT处理对金针菇褐变的抑制效果最好。
图1 MT处理对金针菇贮藏品质的影响
Fig.1 Effect of melatonin treatment on storage quality of Flammulina velutipes
图2 MT处理对金针菇褐变度的影响
Fig.2 Effect of melatonin treatment on browning degree of Flammulina velutipes
呼吸强度是果蔬采后贮藏过程中的一个重要指标,降低呼吸强度可延缓金针菇采后衰老进程[9]。从图3可知,随着贮藏时间的增加,对照和处理组金针菇呼吸强度均呈先升高后下降再升高的趋势,3个MT处理组在整个贮藏期间均显著低于对照组(P<0.05)。对照组金针菇在第3天出现呼吸高峰,而50、100、200 mmol/L MT处理延缓了金针菇呼吸高峰的出现,使其在第6天出现;贮藏第12天时,3个MT处理组的呼吸强度分别比对照组降低了10.27%、20.91%和27.74%,这说明MT处理能有效延迟金针菇呼吸高峰,显著降低其呼吸强度,其中200 mmol/L MT处理抑制效果最好。
图3 MT处理对金针菇呼吸强度的影响
Fig.3 Effects of melatonin treatment on respiratory rate of Flammulina velutipes
失重率是衡量果蔬贮藏期间品质变化及质量损失的重要指标之一,降低金针菇的水分含量会导致其品质劣变[2]。从图4可知,贮藏前3 d,金针菇失水较缓慢,贮藏3 d后,对照组失重率急剧上升,而MT处理组的上升趋势则相对较缓慢,在贮藏6~12 d期间,MT处理组失重率显著低于对照,且组间差异显著(P<0.05),这说明MT处理对减少金针菇的水分散失具有重要的作用。贮藏第12天时,对照组金针菇失重率是50、100、200 mmol/L MT处理组的1.21倍、1.55倍和2.12 倍,说明MT浓度越高抑制金针菇失水的效果越明显,200 mmol/L MT处理的金针菇贮藏品质最好。
图4 MT处理对金针菇失重率的影响
Fig.4 Effects of melatonin treatment on weight loss rate of Flammulina velutipes
金针菇可溶性固形物和抗坏血酸含量是衡量金针菇贮藏品质的重要指标。由图5可知,金针菇可溶性固形物和抗坏血酸含量在贮藏过程中均呈逐渐下降趋势,这可能是由于可溶性固形物作为呼吸底物参与呼吸作用,抗坏血酸作为抗氧化剂参与抗氧化作用而导致的。50、100、200 mmol/L MT处理能显著抑制金针菇可溶性固形物和抗坏血酸含量的下降,且在贮藏6~12 d期间与对照有显著差异(P<0.05)。贮藏末期,200 mmol/L MT处理组的可溶性固形物、抗坏血酸含量分别是对照组的1.12倍和1.24倍,说明200 mmol/L MT处理能有效维持金针菇贮藏品质。
a-可溶性固形物;b-抗坏血酸
图5 MT处理对金针菇可溶性固形物和抗坏血酸含量的影响
Fig.5 Effects of melatonin treatment on soluble solid content and ascorbic acid content of Flammulina velutipes
·O2-和H2O2在果蔬中积累能加剧细胞膜脂过氧化反应,加速果蔬衰老和褐变的发生。由图6-a可知,对照组·O2-产生速率在贮藏前6 d上升缓慢,贮藏6 d后大幅上升,这可能是由于低温伤害和衰老进程引起金针菇膜脂过氧化反应加剧而引起的。100、200 mmol/L MT处理组·O2-增加较为缓慢,显著低于对照组·O2-的产生速率(P<0.05),尤其是200 mmol/L MT处理组·O2-产生速率在整个贮藏过程变化不大,这说明200 mmol/L MT处理抑制金针菇中·O2-产生的效果最显著。由图6-b可知,3个MT处理组与对照组H2O2含量随贮藏时间的延长几乎均呈直线升高,且对照组显著高于3个MT处理组(P<0.05)。贮藏第12天时,200 mmol/L MT处理组H2O2含量分别比对照组、50、100 mmol/L MT处理组降低了24.19%、17.62%和11.12%。这说明MT处理能有效抑制金针菇H2O2的积累,200 mmol/L MT处理的效果最优。
a-·O2-产生速率;b-H2O2含量
图6 MT处理对金针菇·O2-产生速率和H2O2含量的影响
Fig.6 Effects of melaton treatment on superoxide anion production rate and hydrogen peroxide content of Flammulina velutipes
抗氧化酶能清除果蔬体内自由基,减轻自由基对果蔬组织的伤害,对于延缓果蔬的衰老和品质变化具有重要作用[15]。由图7-a可知,金针菇SOD活性在贮藏前6 d急剧下降,贮藏6~12 d期间变化不大。3个MT处理组SOD活性均显著高于对照组(P<0.05),贮藏12 d后,对照组SOD活性最低,200 mmol/L金针菇SOD活性最高,是对照组的1.25倍,这说明MT处理能够有效提高金针菇SOD活性,200 mmol/L处理组提升金针菇SOD活性的效果最好。
a-SOD;b-POD;c-CAT
图7 MT处理对金针菇SOD、POD和CAT活性的影响
Fig.7 Effects of melatonin treatment on SOD, POD and CAT activity of Flammulina velutipes
由图7-b可知,金针菇POD活性在贮藏前3 d急剧上升,之后总体上呈缓慢上升趋势。在贮藏6~12 d,3个MT处理组POD活性均显著高于对照(P<0.05),且3个MT处理组间也有显著差异(P<0.05)。贮藏末期,3个MT处理组POD活性分别较对照组上升了6.33%、12.74%和19.31%,这表明MT处理能够显著提高金针菇POD活性,200 mmol/L处理组POD活性的增加最为明显。
由图7-c可知,金针菇CAT活性在贮藏前6 d急剧上升,贮藏第6天时CAT活性达到最大值,此时200 mmol/L MT处理组CAT活性显著高于其他3组(P<0.05),之后,金针菇CAT活性急剧下降,且3个MT处理组CAT活性均显著高于对照(P<0.05),说明MT处理能显著提高金针菇CAT活性。贮藏末期,200 mmol/L MT处理组CAT活性较对照组升高了26.72%,说明200 mmol/L MT处理提高金针菇CAT活性的效果明显。
酚类物质作为反应底物参与酶促褐变生成醌,醌进一步氧化聚合形成褐色素,导致果蔬发生褐变[13]。如图8所示,贮藏前3 d,对照组和3个MT处理组金针菇总酚含量均呈上升趋势,贮藏第3天达到高峰值,之后总酚含量急剧下降,这可能是由于贮藏前期金针菇切根处理的机械损伤和贮藏温度降低对其产生了胁迫作用,诱导了酚类物质的大量合成,之后随着金针菇酶促褐变加剧,更多酚类物质参与了酶促褐变的发生,导致酚类物质含量下降,这与刘宏等[16]研究结果一致。贮藏6~12 d期间,3个MT处理组总酚含量均显著高于对照(P<0.05),贮藏第12天时,3个MT处理组总酚含量分别是对照组的1.36倍、1.81倍和2.06倍,说明MT处理能显著维持金针菇较高的总酚含量,减缓金针菇褐变。
图8 MT处理对金针菇总酚含量的影响
Fig.8 Effects of melatonin treatment on total phenolic content of Flammulina velutipes
PAL影响果蔬酚类物质合成,与果蔬褐变关系密切[17]。由图9-a可知,金针菇PAL活性随贮藏时间延长呈先升高后降低的趋势,贮藏第6天时达到PAL活性高峰,3个MT处理组PAL活性显著低于对照组(P<0.05),对照组PAL活性分别是50、100、200 mmol/L褪黑素处理组的1.13倍、1.24倍、1.43倍。说明MT处理能显著抑制贮藏期间金针菇PAL活性,减缓金针菇苯丙烷代谢速率,有效减轻褐变的发生,且200 mmol/L MT处理效果最好。
a-PAL;b-PPO
图9 褪黑素处理对金针菇PAL和PPO活性的影响
Fig.9 Effects of melatonin treatment on PAL and PPO activity of Flammulina velutipes
PPO是果蔬中酶促褐变的主要酶类,其活性高低影响果蔬褐变发生程度[18]。由图9-b可知,对照组和50 mmol/L MT处理组PPO活性变化趋势一致,均在贮藏第9天出现PPO活性高峰,之后PPO活性下降;100 mmol/L MT处理组在贮藏第6天出现高峰,之后PPO活性下降,200 mmol/L MT处理组PPO活性一直呈上升趋势。贮藏过程中,对照组金针菇PPO活性始终高于3个MT处理组,且在贮藏6~12 d期间不仅对照和MT处理间有显著差异,而且3个MT处理组间也有显著差异(P<0.05),贮藏12 d时,对照组PPO活性分别比50、100、200 mmol/L MT处理组高8.57%、25.81%和39.55%。这表明褪黑素处理能有效抑制金针菇PPO活性,抑制酶促褐变的发生,其中200 mmol/L MT处理组对金针菇PPO活性抑制效果最好,金针菇褐变程度最轻,品质最好。
金针菇采后贮藏期间极易发生褐变、失水等现象,导致其品质劣变,影响其商品价值和食用品质[2]。本研究结果表明,MT处理能显著抑制金针菇褐变度和失重率的增加,呼吸强度的上升,可溶性固形物和抗坏血酸含量的下降,说明MT处理能抑制金针菇褐变的发生,维持其较好的贮藏品质,且200 mmol/L MT处理的效果最好,这与先前乔沛等[19]和王锋等[14]采用MT处理采后荔枝和甜樱桃的研究结果一致。
正常情况下果蔬体内自由基的产生和清除处于动态平衡,然而,果蔬在衰老和逆境胁迫下会积累自由基,破坏细胞膜结构,导致细胞膜功能丧失,促进果蔬衰老及褐变的发生。采后果蔬酶促清除系统和非酶促清除系统能够降低自由基积累,维持细胞内稳态,延缓采后果蔬衰老和褐变的发生。朱玲玲等[20]研究发现MT处理能维持采后青花菜较高的SOD、POD、CAT及其同工酶活性,提高其抗氧化能力,延缓其衰老进程。邓淑芳等[21]研究表明MT处理能促进枸杞果实总酚和类黄酮等物质积累而提高活性氧清除能力,维持枸杞较好贮藏品质。黄鸿晖等[22]认为MT处理维持草莓品质与其提高抗氧化酶活性、维持较高谷胱甘肽和抗坏血酸含量有关。研究发现MT处理能抑制龙眼和石榴果皮褐变的发生,这与MT提高龙眼和石榴果皮中活性氧清除能力有关[23-24]。贾乐等[25]研究表明MT处理减轻香菇褐变的发生与其提高总酚、抗坏血酸含量和活性氧清除能力有关。本试验研究结果表明,MT处理能显著提高金针菇SOD、POD和CAT活性,同时也显著抑制了总酚含量的下降,维持了金针菇体内较高的抗氧化酶活性和抗氧化物质含量,提高了金针菇的抗氧化能力,降低了金针菇·O2-生成速率和H2O2含量,减轻了活性氧对细胞膜的破坏,抑制了酚类物质和PPO的接触,抑制了金针菇褐变的发生,保持了较好的贮藏品质,本研究结果与BHARDWAJ等[26]、王锋等[14]研究结果一致。
PAL和PPO是引起果蔬酶促褐变的关键酶,PAL是苯丙烷代谢途径的关键酶,能促进果蔬酚类物质合成,在一定程度上PAL活性增加会促进果蔬酶促褐变的进行;PPO是果蔬中酶促褐变的主要酶类,能将果蔬中酚类物质氧化成醌,导致褐变的发生,PPO活性越高,果蔬发生褐变程度越大,PAL和PPO的协同作用,促进了果蔬褐变的发生[27]。有研究认为采用6-苄氨基嘌呤、24-油菜素内酯处理能抑制果蔬中PAL和PPO活性,能在一定程度上减少褐变底物的合成,减轻果蔬酶促褐变的发生,保持果蔬较好的贮藏品质[12,28]。代恵芹等[29]、王锋等[14]认为MT处理降低双孢蘑菇、甜樱桃果实的褐变与其抑制PPO等褐变相关酶活性有关。本研究结果显示,MT处理能显著抑制金针菇PAL和PPO等褐变相关酶活性,减轻金针菇酶促褐变的发生,提高其贮藏品质。这与千春录等[30]采用MT处理水蜜桃抑制果实褐变的研究结果类似。
本研究结果表明,MT处理显著降低了金针菇的褐变度和失重率,显著提高了金针菇体内SOD、POD、CAT等抗氧化酶活性和总酚含量,显著增强了金针菇抗氧化能力,有效抑制了金针菇体内·O2-自由基和H2O2的产生和积累,减轻了自由基对金针菇细胞膜的破坏;同时,MT处理还能显著抑制金针菇PAL和PPO活性而降低金针菇褐变的发生,从而维持金针菇较好的贮藏品质。与50、100 mmol/L MT处理相比,200 mmol/L MT处理对于降低金针菇褐变、维持金针菇品质的效果最优。本研究结果不仅为揭示MT提高金针菇贮藏保鲜的机理提供了依据,而且对于指导MT用于其他果蔬贮藏保鲜提供了参考。
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