石榴(Punica granatum L.)属于石榴科石榴属落叶灌木或乔木,也被称作安石榴、山力叶、丹若等,我国种植石榴的历史悠久,自西汉张謇出使西域引入至今已有2 000多年的历史[1],因其较强的环境适应能力,石榴在我国分布十分广泛[2],我国石榴种质资源丰富,主产区有陕西、新疆、山东、河南、四川、云南等,陕西石榴栽植以临潼为主产区,主要品种有临选1号、大红甜等[3],新疆产区栽植地主要集中在喀什、和田等地,品种主要为酸石榴、甜石榴[4]。
长期研究证明,石榴作为一种健康食品,具有改善血压、抗衰老、预防炎症和癌症的功效[5-6],这与石榴较高的抗氧化能力和丰富的酚类物质[7]有关,而且石榴从果皮到籽都有极高的利用价值[8-9]。目前我国石榴消费以鲜食为主,对于深加工产品及相关研究较少,且对于适宜加工品种尚不明确[10]。目前已有关于石榴不同品种基本理化指标和品质评价的研究[11-12],缺少关于香气组成方面的对比研究,风味关系到果汁的受欢迎程度,是加工中的重要参考指标,因此研究不同石榴品种的香气差异具有重要意义。
本研究以来自新疆的2个和陕西的8个主要栽培品种为研究对象,对其主要品质指标进行检测分析,运用主成分分析(principal component analysis,PCA)法,对不同品种的品质进行分析;在风味物质方面,采用顶空固相微萃取结合气相色谱/质谱(headspace-solid phase microextraction-gas chromatography/mass spectrometry,HS-SPME-GC/MS)技术进行检测,对不同石榴品种的香气组成进行分析评价。通过对比不同石榴品种的基本品质指标和特征性香气,旨在筛选适于果汁加工的石榴品种,为石榴果汁加工产业应用提供理论参考。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
本试验所用黑钻、净皮甜、骊山红、临选1号、临选2号、大红甜、临潼星、大黄皮石榴采购于陕西临潼石榴红生态科技园,千籽红、赛柠檬石榴采购于和田地区策勒县策勒林木良种科技繁育示范基地,由专业人员采摘和筛选出成熟果实。选取新鲜的、无病害的果实,洗去表面灰尘,去皮后将果肉榨汁,将制取的新鲜石榴汁置于-20 ℃条件下储藏,备用。
BSA124S-CW型分析天平,德国塞利多斯公司;17-1650-01-1161型紫外可见分光光度计,北京普析通用仪器有限责任公司;Aglient 7890B型气相色谱仪、毛细管色谱柱(HP-INNOWAX 60 m×0.25 mm×0.25 μm)、Aglient 5977B型质谱仪,美国Agilent公司;聚二甲基硅氧烷/碳筛/二乙苯烯(polydimethylsiloxane/carboxen/divinylbenzene,PDMS/CAR/DVB)萃取头,美国Supelco公司。
1.2 实验方法
1.2.1 主要品质指标测定
出汁率测定:称取约2 kg新鲜石榴,榨汁后称量所得果汁质量与果实质量之比即为出汁率;单果重测定:选取新鲜洗净的完整石榴,使用天平称量其质量;百粒重测定:随机选取并称量100粒石榴果粒;可溶性固性物测定参照GB/T 12143—2008《饮料通用分析方法》中可溶性固形物含量测量方法进行;总酸测定参照GB 12456—2021《食品安全国家标准 食品中总酸的测定》中pH电位法进行;总糖测定参照SB/T 10203—1994《果汁通用试验方法》中直接滴定法进行;总酚测定采用Folin-Ciocalteu法[13];总花色苷测定采用pH示差法[14];色泽测定参考王飞等[15]的方法,参照GB/T 7621—2008《均匀色空间和色差公式》中的方法计算得L*、a*、b*;使用过氧化物酶(peroxidase,POD)和多酚氧化酶(polyphenol oxidase,PPO)活性检测试剂盒(比色法)检测不同品种石榴汁样品中的酶活性。每个指标测定重复3次,取平均值。
1.2.2 挥发性风味物质测定
顶空固相微萃取方法:参考CHEN等[16]的方法并稍作修改。称取5.0 mL石榴果汁样品,置于10 mL顶空进样瓶中,随后加入1.00 g NaCl和10 μL内标溶液(4-甲基-2-戊醇,乙醇溶,0.126 3 g/10 mL),放入磁力搅拌转子,用带有聚四氟乙烯隔垫的聚乙烯瓶盖拧紧后置于磁力搅拌台,使样品瓶在40 ℃下平衡30 min。随后将老化后(270 ℃,30 min)的DVB/CAR/PDMS(50/30 μm)三相萃取头插入样品瓶顶空部分,令萃取头顶端距离样品液面约1 cm,在40 ℃恒温下继续搅拌吸附30 min,待样品瓶中的香气物质在气、液、固三相中达到平衡,将萃取头拔出,备检测使用。每个品种重复3次。
气相色谱-质谱条件:参考LAN等[17]的方法并稍作修改。高纯He流速1 mL/min;进样口温度250 ℃,热解析时间8 min。柱温箱的升温程序为:60 ℃保持1 min,然后以3 ℃/min的速度升温至220 ℃,保持2 min。质谱电离方式为EI,离子源温度230 ℃,电离能70 eV,四级杆温度150 ℃,质谱接口温度280 ℃,质量扫描范围30～350 u。每个样品做3次重复。
定性定量方法:定性分析在Agilent化学工作站(Agilent Technologies, Inc.)离线软件上进行。定量分析采用外标法。以蒸馏水配制含有100 g/L葡萄糖和10 g/L苹果酸的基质,用于稀释溶于乙醇的各种标准品母液,配制成连续梯度的工作液,对工作液进行相同条件下的HS-SPME-GC-MS分析,以香气标准品浓度为y轴,香气标准品与内标的峰面积比值为x轴绘制标准曲线。对于有标准品的香气化合物使用相应的标准曲线进行定量,对于没有标准品的香气化合物使用C原子数相近、化学结构相似的标准品的标准曲线进行定量。
香气活性值(odor activity value, OAV)计算如公式(1)所示:
OAV=ρ/T
(1)
式中:ρ,化合物在样品中的质量浓度,μg/L;T,对应化合物在溶液中的感觉阈值,μg/L。
1.3 数据分析
使用Excel 2016进行数据处理;使用IBM SPSS Statistics 25进行显著性分析,显著性水平为P<0.05;使用SMICA 14.1进行PCA;使用MetaboAnalyst 2.0(http://www.metaboanalyst.ca/)进行热图分析。
2 结果与分析
2.1 不同品种石榴主要品质指标测定结果
测定10个品种石榴果汁的出汁率、单果重、百粒重、pH、可溶性固形物、总酸、总糖等指标,结果见表1。在出汁率方面,大红甜、大黄皮、千籽红、赛柠檬出汁率较低,在30%左右,说明其含水率较低,其他品种出汁率在40%以上,临潼星出汁率最高,可达50.62%,较高的出汁率有利于果汁加工。黑钻单果重最高,每个果实质量可达640 g,千籽红单果质量最低,只有300 g左右。来自新疆的两个品种籽粒较小,千籽红百粒重最低,赛柠檬次之。黑钻和千籽红可溶性固形物含量接近17 °Brix,最高的为赛柠檬,含量为17.87 °Brix,其他品种的石榴汁可溶性固形物含量在14 °Brix左右。赛柠檬作为酸石榴品种,总酸含量最高(24.03 g/L),黑钻次之,其余品种总酸含量都在5.00 g/L以下。来自新疆的石榴品种千籽红和赛柠檬的总糖含量显著高于其他品种,这可能与新疆独特的气候条件有关[18]。酚类化合物是石榴中的重要营养成分,具有一定的抗氧化作用[19],总酚含量最高的为黑钻(1.13 g/L),赛柠檬次之(0.93 g/L)。总花色苷含量最高也是黑钻,高达50.46 mg/L,显著高于其他品种,除黑钻外含量较高的还有千籽红、大黄皮和赛柠檬。在CIELAB颜色体系中,L*表示明暗度,即L*越高说明亮度越高,a*代表红绿色,b*代表黄蓝色,前者越高说明样品越偏向红色调,后者越高说明样品越偏向黄色调[20],黑钻具有最高的a*和最低的L*、b*,呈现出黑宝石般的深红色,其次为千籽红,也呈现较深的红色调,其余品种L*、a*、b*差异较小,色泽相近,均呈大红色、鲜红色。PPO和POD广泛存在于各种水果中,其活力的大小关系到氧化反应的快慢[21],千籽红的2种酶活力均为最高,表明其果汁最有可能发生氧化褐变,不利于加工后保存,黑钻的PPO活力(5.67 U/mL)显著低于其他品种,氧化褐变反应较慢。
表1 十个品种石榴果汁主要品质指标
Table 1 Main quality indexes of 10 varieties of pomegranate juice
主要品质指标石榴品种黑钻净皮甜骊山红临选1号临选2号大红甜临潼星大黄皮千籽红赛柠檬出汁率/%43.74±0.51c40.23±0.47d41.40±0.89cd47.51±1.94b46.59±1.04b28.82±0.74f50.62±2.45a30.94±1.07ef33.43±1.37e33.01±0.92e单果重/g640.00±52.74a465.60±38.54bc488.20±23.29bc500.00±72.56bc282.40±32.45e549.60±49.82ab426.20±47.37cd365.80±25.72de279.00±38.33e421.60±123.71cd百粒重/g62.00±1.73bc58.33±1.53d63.67±1.53ab64.00±1.00ab63.67±1.15ab59.67±1.53cd65.00±1.73a57.67±1.15d53.67±1.53e57.00±1.00d可溶性固形物/°Brix16.80±0.17b11.47±0.06i14.13±0.06e13.77±0.06f14.33±0.06d14.00±0.00e13.33±0.06h13.60±0.00g16.50±0.00c17.87±0.06a总酸/(g/L)10.33±0.25b2.46±0.51e1.47±0.13f3.95±0.25c2.50±0.20e2.90±0.20de2.55±0.27e3.31±0.15d4.11±0.08c24.03±0.15a总糖/(g/L)134.20±1.20c119.70±1.50d146.90±0.70b144.70±2.30b143.10±0.50b145.20±5.20b139.60±2.40bc141.00±3.60bc176.80±1.40a169.80±0.00a总酚/(g/L)1.13±0.11a0.32±0.04f0.38±0.01ef0.59±0.05cd0.42±0.00ef0.58±0.03cd0.50±0.01de0.47±0.00de0.68±0.01c0.93±0.04b总花色苷/(mg/L)50.46±0.36a6.94±0.01f4.76±0.08i12.69±0.02d5.40±0.04h12.32±0.04e6.27±0.08g18.73±0.25c21.25±0.17b18.65±0.13cL*13.96±0.17i60.83±0.38b59.27±0.08c49.05±0.16d64.02±0.11a45.08±0.61e59.00±0.16c44.03±0.42f22.95±0.09h37.59±0.05ga*76.28±0.26a46.33±0.03h51.23±0.10g56.91±0.04e56.01±0.03f57.15±0.06e58.85±0.01c58.13±0.01d65.43±0.08b58.83±0.01cb*7.17±0.25j25.83±0.06e18.62±0.15h29.52±0.07d15.84±0.14i30.11±0.02c24.02±0.08f34.63±0.09b22.48±0.08g49.67±0.11aPOD活力/(U/mL)2.74±0.90c2.22±0.59c6.07±1.78b1.85±0.46c2.67±0.80c2.44±0.22c2.30±0.71c2.44±0.80c6.52±1.48a2.59±0.46cPPO活力/(U/mL)5.67±1.33g16.33±0.88bc13.78±0.51cd11.89±3.24de17.33±1.45ab7.78±0.77fd9.89±1.64ef14.44±1.26bcd20.44±1.50a14.11±2.22bcd
注:表中同行不同字母表示P<0.05时同一指标下不同样品具有显著性差异。
2.2 不同品种石榴主要品质主成分分析
对以上不同品种石榴汁的主要品质指标数据进行PCA,提取到4个特征值>1的主成分,如表2所示,主成分1、主成分2和主成分3的贡献率分别为43.1%、23.7%和14.2%,累计方差贡献率达到81%。
表2 主成分的特征值及贡献率
Table 2 Eigenvalues and contribution rate of the principal components
主成分特征值贡献率/%累计贡献率/%15.1743.143.122.8423.766.831.714.28141.048.6389.650.5394.4994.160.232.796.8
由图1可知,主成分1与出汁率、百粒重、L*具有明显正相关关系,主成分2与总糖、总酸、可溶性固形物含量、b*具有明显正相关关系,主成分3与POD、a*具有明显正相关关系。其中赛柠檬和千籽红得分落在主成分2的较高正向区间,表明总酸、总糖含量明显区别于其他品种,千籽红POD活力较高,与主成分3正相关;黑钻得分落在主成分1和2的负向区间,这与其较高的总酚和总花色苷含量有关,且a*较高,是色泽方面比较突出的品种;而其他品种主要与主成分1成正相关关系,且重叠现象明显,说明PCA不能将这7种有效区分。
a-PCA得分图;b-载荷图
图1 不同品种石榴果汁主要品质指标PCA得分图和载荷图
Fig.1 PCA score diagram and loading diagram of main quality indexes of different varieties of pomegranate juice
注:A-黑钻;B-净皮甜;C-骊山红;D-临选1号;E-临选2号;F-大红甜;G-临潼星;H-大黄皮;I-千籽红;J-赛柠檬(下同)。
2.3 不同品种石榴挥发性风味物质分析
经过GC-MS对10个不同品种石榴汁中的香气物质进行定性、定量分析,共鉴定出34种香气成分,其中醇类物质种类最多,有15种,醛类7种,酮类6种,酯类4种,其他物质2种。所有物质均在已有的石榴香气研究中被报道[22]。
在10个石榴品种中,所有品种共有的香气物质有15种,以醇类为主,其中黑钻品种香气种类最为丰富,鉴定出27种化合物,其中包括特有香气物质7种;大黄皮中香气物质种类最少,仅有20种。
OAV是指香气物质含量与其嗅觉阈值之比[23],常用来表示某香气物质对整体香气的贡献程度,易被人所感知,对样品的香气特征贡献较大[24],因此在风味研究中对香气结果进行OAV分析具有重要意义。
如表3所示,在石榴汁中发现11种挥发性成分OAV>1,其中包含4种醇类、5种醛类、1种酮类和1种酯类,这些物质都已作为石榴的特征性香气成分在已有研究中被报道[25-26],其中正辛醛、正己醇、壬醛和(E, E)-2,4-壬二烯醛OAV较高,对石榴汁的香气组成贡献较大,分别能带来一定的柑橘味、水果香、玫瑰香和脂肪味。在10个石榴品种中,黑钻、千籽红和临选1号都具有最多的OAV>1的香气物质种类,均为7种,说明黑钻和临选1号的特征性香气物质最丰富,其中OAV较高的正己醇、壬醛和2-己烯醛能够呈现果香和花香。
表3 不同品种石榴中OAV>1的挥发性化合物
Table 3 Volatile compounds with OAV higher than 1 in different varieties of pomegranate juice
化合物阈值/(μg/L)香气描述词OAV黑钻净皮甜骊山红临选1号临选2号大红甜临潼星大黄皮千籽红赛柠檬正己醛50绿色、木本、草<1<1<1<1<1<1<1<11.71 <12-己烯醛19.2水果、苹果、李子<1<1<12.39 <1<1<1<15.59 5.51 己酸乙酯5甜、菠萝、水果<1<1<12.00 2.00 2.00 <1<12.12 2.07 正辛醛0.587绿色、柑橘、橙子<147.13 39.10 37.70 37.66 <1<1<1<1<16-甲基-5-庚烯-2-酮68绿色、苹果、香蕉3.14 <1<1<1<1<1<1<1<1<1正己醇5.6水果、甜、绿色22.72 15.13 27.94 95.12 1.49 19.95 21.69 28.23 156.71 72.47 壬醛1.1玫瑰、橙子46.05 74.03 27.24 30.54 24.93 37.06 34.26 34.62 33.60 30.20 1-辛烯-3-醇1.5蘑菇、泥土、鸡肉1.43 1.22 1.14 1.15 1.15 1.13 1.14 1.14 1.16 1.14 正庚醇5.4紫罗兰、牡丹1.01 1.15 <1<1<1<1<1<1<1<1芳樟醇2.4柑橘、玫瑰、蓝莓1.73 1.69 1.46 1.59 1.52 1.56 1.46 1.38 1.74 2.33 (E,E)-2,4-壬二烯醛0.1脂肪、鸡肉、土豆9.28 <1<1<1<1<1<1<1<1<1
注:香气描述词来源于网站:www.flavornet.org/flavornet.html。
2.4 不同品种石榴挥发性风味物质PCA和热图分析
为进一步对比不同石榴品种的挥发性化合物含量的差异,对10个品种的石榴果汁的挥发性化合物数据进行PCA。提取到5个特征值大于1的主成分,如表4所示,提取前3个主成分,主成分1、主成分2和主成分3方差贡献率分别为40.5%、22.3%和15.6%,累计方差贡献率达到78.3%,说明这3个主成分可以解释原始数据78.3%的信息,具备较高的代表性。
表4 主成分的特征值及贡献率
Table 4 Eigenvalues and contribution rate of the principal components
主成分特征值贡献率/%累计贡献率/%112.140.540.526.6822.362.734.6715.678.341.715.784.051.555.289.2
由图2可知,PCA得分图直观体现了各品种石榴的香气组成差异。来自陕西的6个品种(临选1号、临选2号、骊山红、大黄皮、临潼星、大红甜)离散程度较低,说明这些品种的香气结构比较相似,可以归为一类;黑钻区分于其他品种的主要成分为正庚醇、2-庚醇、1-戊醇、苯乙酮、6-甲基-5-庚烯-2-酮和苯甲酸乙酯等香气物质,这些物质主要呈现出花香、果香、樱桃、香蕉、薄荷以及面包等味道;赛柠檬和千籽红与主成分2和主成分3呈正相关关系,主要与正己醇、叶醇、2-己烯醛、正己醛和芳樟醇等香气物质相关,这些物质主要呈现出果香、青草味、苹果、李子、柑橘、玫瑰等味道;净皮甜与主成分2呈负相关关系,和辛醛、仲辛酮、壬醇、壬醛等高度关联,这些物质呈现出柑橘、橙子、玫瑰、木兰花等味道。因此可以说,黑钻果香更明显,赛柠檬和千籽红带有更多青草味,净皮甜的风味中柑橘、橙子特征更突出。
a-PCA得分图;b-载荷图
图2 不同品种石榴果汁挥发性化合物PCA得分图和载荷图
Fig.2 PCA score diagram and loading diagram of volatile compounds of different varieties of pomegranate juice
对不同石榴品种的香气物质进行聚类分析,得到图3,可将香气物质大致分为4类。第Ⅰ类主要有萘、6-甲基-5-庚烯-2-酮、4-甲基-2-戊酮、1-戊醇、(E,E)-2,4-壬二烯醛、2-庚醇等,这些物质在黑钻中含量较高;第Ⅱ类包括2-己烯醛、甲酸己酯、正己醇、正己醛、叶醇、糠醛、己酸乙酯、芳樟醇,这些物质在赛柠檬和千籽红中含量较高;第Ⅲ类包括苯甲酸甲酯、辛醇、1-辛烯-3-醇、苯乙烯、2-壬酮、正庚醇、α-萜烯醇和香叶基丙酮,这些物质是临选1号、临选2号、骊山红、大黄皮、临潼星、大红甜中的主要香气物质;第Ⅳ类包括壬醛、壬醇、正辛醛、仲辛酮、苯乙醇,是净皮甜中的主要香气成分。
图3 不同品种石榴果汁挥发性化合物热图
Fig.3 Heatmap of volatile compounds of different varieties of pomegranate juice
3 结论与讨论
石榴果实的加工适宜性受多重因素的影响,本研究通过对10个石榴品种的主要品质指标和香气组成进行测定和分析,以更好了解不同石榴果汁品质特性,对新疆地区未来石榴引种、产品深加工、产业发展升级起到一定参考意义。
结果表明,不同石榴品种在主要品质指标和香气组成上存在明显差异。临潼星具有最高的出汁率(50.6%)和百粒重(64.78 g),黑钻石榴品种具备最高的总酚、总花色苷含量和最低的多酚氧化酶活性,分别为1.13 g/L、50.46 g/L和5.67 U/mL,一定程度上说明其具备较高的营养价值和较为耐储存;新疆石榴品种千籽红和赛柠檬的总糖含量位居第一和第二,分别为176.8 g/L和169.8 g/L,同时二者的可溶性固形物含量、总酚含量和总花色苷含量也位居前列。通过PCA,基于以上品质特征对不同品种进一步区分,验证了各品种与各项指标的相关性。
通过SPME-GC-MS对10个品种石榴的香气物质进行鉴定和分析,共检测到33种香气成分,其中共有物质15种,醇类和醛类是石榴的主要香气成分。黑钻品种香气种类最多。进一步进行OAV分析、PCA和热图分析,发现11种OAV>1的特征香气成分,包括正己醛、正己醇、壬醛等,它们主要为石榴贡献了果香、花香、生青味等香气,通过PCA和热图分析,对不同品种石榴的香气进行区分,发现千籽红和赛柠檬在香气构成上具有一定的相似性,陕西品种中黑钻和净皮甜与其他品种表现出明显的差异性。
因此,陕西品种黑钻具有高出汁率、耐储存、高花色苷、果香丰富等特点,适合作为NFC果汁的原料;新疆品种千籽红和赛柠檬单果重和出汁率较低,果香较弱,但因其高糖、高酸、高花色苷的特点,适合开发复配果汁饮料或果酒。
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