青稞,俗称裸大麦,属禾本科植物,是青藏高原的第一大作物,有着悠久的种植历史。随着全球经济快速发展,人们生活质量得到改善,但同时也面临着糖尿病、冠心病等慢性病的挑战,而青稞因具有“三高两低”(高蛋白、高纤维、高维生素、低糖、低脂肪)的饮食结构[1],并集食用、药用、饲用、酿造于一身[2-4],具有极高的营养和食疗价值,近年来深受广大消费者青睐。
据报道,萌发使种子中贮存的各种物质被转化和提升以供新生命利用,其营养物质和药用价值显著增加[5],谷类作物在经浸泡萌发后,酶活性显著增加,加快了活性物质的积累并提高了其抗氧化能力[6]。谷物也是重要的微量营养素——锌的来源,在多种用于富集锌含量的化学形式中,硫酸锌因其成本低、溶解度大而被广泛使用[7]。ARNAO等[8]发现1.0 mmol/L硫酸锌对大麦根系的褪黑素含量有显著提高作用。ZHANG等[9]发现在苹果发育阶段喷施硫酸锌可显著提高苹果的可溶性糖含量。朱雪丰[10]、CAO[11]发现喷施适宜浓度的硫酸锌有利于提高植物的抗氧化能力。赵爽等[12]发现,硫酸锌提高了不结球大白菜的酚类物质含量,但对芽苗会造成生长胁迫。梁雨荷等[13]发现,青稞在萌发期间,总黄酮含量呈上升趋势,但β-葡聚糖含量呈下降趋势。曾晴等[14]发现,适当浓度的盐胁迫可以提高发芽大豆的γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)的富集量。
由于青稞生长环境特殊、分布范围有限,目前国内外关于青稞的研究甚少,且主要集中于青稞籽粒的营养成分测定及活性成分提取等方面,胁迫萌发处理对青稞影响的研究鲜有报道。因此本实验重点研究了不同浓度硫酸锌胁迫对萌发青稞的褪黑素、β-葡聚糖等含量及抗氧化能力的影响。这些研究有助于了解青稞功能成分与抗氧化能力之间的关系,并为青稞功能性食品的开发提供了数据支撑和理论参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
本实验所使用青稞品种为藏青2000,由西藏自治区农牧科学院提供。
高锰酸钾、硫酸锌、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、Folin-酚、无水碳酸钠、芦丁标准品(纯度≥98%)、没食子酸标准品(纯度≥98%)、无水葡萄糖、蒽酮,国药集团化学试剂有限公司;3,5-二硝基水杨酸、6-羟基-2,5,7,8-四甲基色烷-2-羧酸(6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid,Trolox,纯度≥98%)、DPPH、ABTS,上海阿拉丁生化科技有限公司;PLANT MT ELISA KIT、PLANT β-GLUCANS ELISA KIT、PLANT GABA ELISA KIT上海桥杜生物科技有限公司。实验用水为超纯水。
1.2 仪器与设备
YRG-150种子发芽箱,上海合恒仪器设备有限公司;LGJ-12真空冷冻干燥机,北京松源华兴科技有限公司;FW100高速粉碎机,天津市斯泰特仪器有限公司;D3024R台式高速冷冻型微量离心机,北京大龙兴创实验仪器有限公司;酶标仪SPECTRAMAX M5,上海赛默飞世尔仪器有限公司;UV-5200紫外可见分光光度计,上海元析仪器有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 种子萌发
称取约300 g藏青2000种子,用1 g/L高锰酸钾溶液消毒5 min,纯水洗净并浸泡10 h使种子水合,在不同浓度硫酸锌溶液(0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L)下萌发7 d(25 ℃,避光),同时记录其萌发率与麦苗生长情况。每24 h取长势一致的青稞麦苗,经真空冷冻干燥,粉碎后过80目筛,低温贮存备用。种子(Seed)经10 h浸泡,对照组为水萌发(即硫酸锌浓度为0 mmol/L)。
1.3.2 样品提取液的制备
根据朱雪洋等[15]的方法制备的样品提取液用于褪黑素、β-葡聚糖、γ-氨基丁酸、总黄酮、总酚含量及抗氧化能力的测定。根据高俊凤[16]的方法制备的样品提取液用于还原糖、可溶性糖含量的测定。
1.4 测定指标及方法
1.4.1 功能成分的测定
1.4.1.1 褪黑素含量的测定
褪黑素含量(melatonin content,MTC)采用双抗体一步夹心法免疫吸附试验(enzyme linked immune sorbent assay,ELISA)测定,操作步骤严格按照PLANT MT ELISA KIT试剂盒说明书进行。以标准品浓度为横坐标,吸光值为纵坐标绘制标准曲线。
1.4.1.2 β-葡聚糖含量的测定
β-葡聚糖含量(β-glucans content,GC)测定方法同1.4.1.1节操作步骤严格按照PLANT β-GLUCANS ELISA KIT试剂盒说明书进行。以标准品浓度为横坐标,吸光值为纵坐标绘制标准曲线。
1.4.1.3 γ-氨基丁酸的测定
GABA测定方法同1.4.1.1节操作步骤严格按照PLANT GABA试剂盒说明书进行。以标准品浓度为横坐标,吸光值为纵坐标绘制标准曲线。
1.4.1.4 总黄酮、总酚含量的测定
总黄酮含量(total flavonoid content,TFC)的测定根据WANG等[17]的方法略作修改。50 μL提取液加20 μL 5%(质量分数)亚硝酸钠溶液静置6 min,加20 μL 10%(质量分数)硝酸铝溶液静置6 min,加200 μL 4%(质量分数)氢氧化钠溶液避光反应15 min,510 nm处测定吸光值。以芦丁浓度为横坐标,吸光值为纵坐标绘制标准曲线。
总酚含量(total phenolic content,TPC)的测定根据SHEN等[18]的方法略作修改。在30 μL提取液中添加20 μL Folin-酚试剂静置反应6 min,再加入100 μL 7%(质量分数)碳酸钠溶液,调整最终体积为290 μL。避光反应60 min于765 nm处测定吸光值。以没食子酸浓度为横坐标,吸光值为纵坐标绘制标准曲线。
1.4.1.5 还原糖、可溶性糖含量的测定
3,5-二硝基水杨酸法[16]测定还原糖含量(reducing sugar content,RSC)、蒽酮-硫酸法[16]测定可溶性糖含量(soluble sugar content,SSC)。以葡萄糖含量为横坐标,吸光值为纵坐标绘制标准曲线。
1.4.2 抗氧化能力的测定
参考孟想等[19]的方法对样品分别进行了DPPH自由基清除能力、ABTS阳离子自由基清除能力和铁还原/抗氧化能力(ferric reducing/antioxidant power,FRAP)的测定。以Trolox浓度为横坐标,吸光值为纵坐标绘制标准曲线,结果以生育酚的水溶性维生素E的衍生物Trolox当量计(mg Trolox equivalent/g)。
1.5 统计分析
样品组均设3组重复,以平均值±标准差表示。使用SPSS 20.0软件进行显著性分析;Origin 2021软件进行绘图。
2 结果与分析
2.1 硫酸锌胁迫对萌发青稞萌发率、水分含量、根长及芽长的影响
图1为不同浓度硫酸锌胁迫下青稞从萌发前(种子,seed)到第7天生长情况。青稞种子在第1天生长出根,第2天萌发出幼苗。根是植物最先感知生长环境的器官,硫酸锌胁迫能够抑制作物根和根上部分生长,造成植物生长发育迟缓,致使幼苗主根变短、芽苗变短。
图1 硫酸锌胁迫下青稞幼苗生长情况
Fig.1 Growth of highland barley seedlings under zinc sulfate stress
注:每张小图中硫酸锌浓度从左往右依次为0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L。
图2为不同浓度硫酸锌胁迫对萌发青稞萌发率、水分含量、根长和芽长的影响。结果表明,同一萌发时间下,青稞的萌发率随着硫酸锌浓度的增加而略有降低;同一硫酸锌浓度下,萌发率随着时间的延长先增加后不变;0～2 d为萌发高峰期,第4天达到平衡,未萌发的种子不再继续萌发。同一萌发时间内,硫酸锌浓度越大,水分含量越低、根越短、芽越短;同一硫酸锌浓度下,萌发时间越长,水分含量越高、根越长、芽越长。
a-萌发率;b-水分含量;c-根长;d-芽长
图2 硫酸锌胁迫对萌发青稞萌发率、水分含量、根长及芽长的影响
Fig.2 Effects of zinc sulfate stress on germination rate, moisture content, root length, and bud length of germinating highland barley
2.2 硫酸锌胁迫对萌发青稞褪黑素含量的影响
如图3所示,随着时间的延长,在不同浓度硫酸锌胁迫下,萌发青稞褪黑素含量先上升后下降。其中,0.8 mmol/L硫酸锌胁迫萌发第6天时褪黑素含量达到最大为(13.227±0.119) ng/g,是种子的2.50倍、同条件下对照组的1.35倍。种子萌发后逐渐生长出根和芽苗,形成了大量的细胞质和叶绿体,而细胞质和叶绿体是植物产生褪黑素的重要场所[20],所以褪黑素合成加快。第7天褪黑素含量降低可能是由于人工模拟的生长环境在生长后期不能给予青稞最佳生长条件,缺乏光照、土壤等生长因素,不利于褪黑素的合成。此外,ZHANG等[21]的研究表明,盐胁迫诱导了萌发青稞蛋白质组的全面变化,改变了与褪黑素相关的蛋白质的表达与丰度,与渗透胁迫反应相关的蛋白质及代谢产物显著增加,这可能是盐胁迫下萌发青稞褪黑素含量增加的原因。
图3 硫酸锌胁迫对萌发青稞褪黑素含量的影响
Fig.3 Effect of zinc sulfate stress on melatonin content in germinating barley
2.3 硫酸锌胁迫对萌发青稞β-葡聚糖含量的影响
如图4所示,随着时间的延长,在不同浓度硫酸锌胁迫下,萌发青稞β-葡聚糖含量先降低后缓慢升高。其中,低浓度硫酸锌会加快萌发青稞的β-葡聚糖含量降解,但当硫酸锌浓度达1.0 mmol/L时却能够有效抑制其降解。李婷玉等[22]也发现,在Zn2+胁迫下,青稞萌发后β-葡聚糖含量发生降解,但降解量随着金属离子浓度的增加而降低。种子在萌发前期中β-葡聚糖含量降低是因为萌发使种子分泌大量赤霉素,合成葡聚糖酶,水解青稞细胞间的β-葡聚糖[23];而萌发后期麦苗萌发完全,葡聚糖合成酶活性高于葡聚糖酶,β-葡聚糖含量有增加趋势。
图4 硫酸锌胁迫对萌发青稞β-葡聚糖含量的影响
Fig.4 Effect of zinc sulfate stress on β-glucan content in germinating highland barley
2.4 硫酸锌胁迫对萌发青稞GABA含量的影响
如图5所示,随着时间的延长,在不同浓度硫酸锌胁迫下,萌发青稞GABA含量先上升后下降。其中,0.8 mmol/L硫酸锌胁迫萌发第6天时GABA含量达到最大为(30.280±0.891) μmol/g,是种子的2.15倍、对照组的1.40倍。据报道[24],植物中GABA的富集与胁迫应激反应有关,盐碱等逆境胁迫下GABA含量会迅速积累。萌发前期种子中的蛋白酶未被充分激活,而随着萌发时间的延长,蛋白质被水解形成了谷氨酸,谷氨酸在谷氨酸脱羧酶的作用下生成GABA,GABA在GABA转氨酶的催化下转化为琥珀酸半醛,最后形成琥珀酸[25],故而在萌发期间GABA含量呈先上升后下降趋势。
图5 硫酸锌胁迫对萌发青稞GABA含量的影响
Fig.5 Effect of zinc sulfate stress on GABA content in germinating barley
2.5 硫酸锌胁迫对萌发青稞总黄酮、总酚含量的影响
图6为不同浓度硫酸锌胁迫对萌发青稞总黄酮、总酚含量的影响。结果表明,随着时间的延长,在不同浓度硫酸锌胁迫下,萌发青稞的总黄酮、总酚含量先下降后上升。1～3 d总黄酮、总酚含量降低的原因可能是由于前3 d是胚根生长的关键期,胚根中的总黄酮、总酚含量较低,故而影响到整棵麦苗的总黄酮、总酚含量。李有媛等[26]也发现不同品种的芹菜基部与其他部位相比含有的总黄酮、总酚含量最低。萌发后期总黄酮、总酚含量的增加可能是由于青稞芽苗的迅速增长激活了葡萄糖苷酶催化糖苷的分解,加快了黄酮及酚类物质的生物合成。其中,0.8 mmol/L硫酸锌胁迫萌发第7天时总黄酮含量达到最大为(1.479±0.032) mg/g,是种子的2.03倍、对照组的1.28倍;0.6 mmol/L硫酸锌胁迫萌发第7天时总酚含量达到最大为(7.179±0.170) mg/g,是种子的1.87倍、对照组的1.12倍。研究发现[27],盐分会诱导植物氧化胁迫,促使植物产生氧化应激反应,而黄酮及酚类化合物具有强大的抗氧化性能,故适当浓度的盐胁迫会促进萌发青稞中总黄酮、总酚含量的增加。
a-总黄酮含量;b-总酚含量
图6 硫酸锌胁迫对萌发青稞总黄酮、总酚含量的影响
Fig.6 Influence of zinc sulfate stress on the contents of total flavonoids and total phenols in germinated barley
a-还原糖含量;b-可溶性糖含量
图7 硫酸锌胁迫对萌发青稞还原糖、可溶性糖含量的影响
Fig.7 Effect of zinc sulfate stress on reducing sugar and soluble sugar content of germination barley
2.6 硫酸锌胁迫对萌发青稞还原糖、可溶性糖含量的影响
图7为不同浓度硫酸锌胁迫对萌发青稞还原糖、可溶性糖含量的影响。结果表明,随着时间的延长,在不同浓度硫酸锌胁迫下,萌发青稞的还原糖、可溶性含量先上升后达到动态平衡。萌发提高了谷物种子中的酶活力,难溶的大分子淀粉在酶的作用下被分解成小分子糖,从而导致还原糖、可溶性糖含量显著增加。而当多糖物质被水解后,还原糖、可溶性糖作为谷物幼苗生长的能源物质被逐渐消耗,因此在萌发后期达到动态平衡甚至有下降趋势。其中,对照组萌发第6天时还原糖含量达到最大为(19.079±0.073)%,是种子的112.23倍;0.4 mmol/L硫酸锌胁迫萌发第7天时可溶性糖含量达到最大为(25.479±0.735)%,是种子的7.78倍、对照组的1.24倍。与对照组相比,硫酸锌胁迫降低了萌发青稞还原糖含量,这可能是因为硫酸锌胁迫抑制了萌发青稞胚根的生长,故而向外输出糖分的速率有所下降。而当植物为缓解因盐胁迫而带来的生理代谢不平衡等伤害时,会在细胞内积累可溶性糖等渗透调节物质以维持植物细胞正常生理功能[28],故适当浓度的硫酸锌胁迫有助于提高萌发青稞的可溶性糖含量。
2.7 硫酸锌胁迫对萌发青稞抗氧化能力的影响
本实验分别采用了DPPH法、ABTS法和FRAP法分析了硫酸锌胁迫对萌发青稞抗氧化能力的影响。如图8-a、图8-c所示,随着时间的延长,在不同浓度硫酸锌胁迫下,萌发青稞的DPPH自由基清除能力与FRAP还原能力均呈先下降后上升趋势,与总酚含量的变化规律一致。其中,0.6 mmol/L硫酸锌胁迫萌发第7天时DPPH自由基清除能力与FRAP还原能力均达到最大,分别为(0.713±0.007)、(1.308±0.006) mg Trolox equivalent/g;是种子的1.40、2.05倍;对照组的1.20、1.14倍。如图8-b,随着时间的延长,在不同浓度硫酸锌胁迫下,萌发青稞的ABTS阳离子自由基清除能力总体呈上升趋势。0.8 mmol/L硫酸锌胁迫萌发第7天时ABTS阳离子自由基清除能力达到最大,为(1.863±0.011) mg Trolox equivalent/g,是种子的1.86倍、对照组的1.07倍。
a-DPPH自由基清除能力;b-ABTS阳离子自由基清除能力;c-FRAP还原能力
图8 硫酸锌胁迫对萌发青稞抗氧化能力的影响
Fig.8 Effect of zinc sulfate stress on antioxidant capacity of germinating barle
尽管3种分析方法的机理并不完全相同,但结果一致表明:与对照组相比,0.6～0.8 mmol/L的硫酸锌对萌发青稞的抗氧化能力有提升作用。在已有文献中发现了类似的结果,如BOUDALI等[29]发现2 mmol/L硫酸锌可以显著提高大花蕙兰叶片和根的抗氧化能力。
2.8 硫酸锌胁迫对萌发青稞还原糖、可溶性糖含量的影响
表1为硫酸锌胁迫下萌发青稞功能成分及抗氧化能力的相关性分析结果。其中,褪黑素、GABA、还原糖和可溶性糖含量均与ABTS阳离子自由基清除能力显著正相关(P<0.01);还原糖含量与FRAP还原能力显著正相关(P<0.01);总黄酮、总酚含量均与DPPH自由基清除能力、ABTS阳离子自由基清除能力、FRAP还原能力显著正相关(P<0.01)。这说明褪黑素、GABA、还原糖和可溶性糖含量是萌发青稞ABTS阳离子自由基清除能力的主要贡献者;总黄酮和总酚含量是萌发青稞主要的抗氧化活性物质。
表1 硫酸锌胁迫下萌发青稞功能成分及抗氧化能力的相关性分析
Table 1 Correlation analysis of functional constituents and antioxidant capacity of germinated barley under zinc sulfate stress
MTCGCGABATFCTPCRSCSSCDPPHABTSFRAPMTC1-0.397∗∗0.904∗∗0.748∗∗0.649∗∗0.653∗∗0.671∗∗0.0940.831∗∗0.392∗GC1-0.508∗∗-0.146-0.234-0.714∗∗-0.798∗∗0.200-0.415∗∗-0.006GABA10.762∗∗0.687∗∗0.751∗∗0.796∗∗0.0800.877∗∗0.356∗TFC10.914∗∗0.571∗∗0.580∗∗0.595∗∗0.844∗∗0.811∗∗TPC10.705∗∗0.684∗∗0.643∗∗0.786∗∗0.889∗∗RSC10.951∗∗0.0730.760∗∗0.429∗∗SSC10.0840.741∗∗0.387∗DPPH10.331∗0.821∗∗ABTS10.572∗∗FRAP1
注:**表示在 0.01 水平(双侧)上显著相关;*表示在 0.05 水平(双侧)上显著相关。
3 结论
随着时间的延长,在不同浓度硫酸锌胁迫下,萌发青稞的萌发率先增加后不变,水分含量、根长及芽长均呈上升趋势;且硫酸锌浓度越大,萌发率及水分含量越低,根长及芽长越短,相关分析结果表示四者间显著正相关(P<0.01,R2=0.594～0.920)。褪黑素、GABA含量先增加后降低;还原糖、可溶性含量先上升后达到动态平衡;β-葡聚糖、总黄酮及总酚含量先降低后升高。其中,0.4 mmol/L硫酸锌胁迫萌发第7天时可溶性糖含量达到最大为(25.479±0.735)%,是对照组的1.24倍;0.6 mmol/L硫酸锌胁迫萌发第7天时总酚含量达到最大为(7.179±0.170) mg/g,是对照组的1.12倍;0.8 mmol/L硫酸锌胁迫萌发第6天时褪黑素与GABA含量达到最大、第7天时总黄酮含量达到最大,分别为(13.227±0.119) ng/g、(30.280±0.891) μmol/g、(1.479±0.032) mg/g,分别是对照组的1.35、1.40和1.28倍。
抗氧化能力结果显示,0.6、0.8 mmol/L的硫酸锌胁迫使得萌发青稞具有更好的抗氧化能力。以上结果揭示了萌发是改善种子品质的一种加工方式,硫酸锌作为一种化学形式的胁迫可有效提高萌发青稞的褪黑素、GABA、总黄酮和总酚等功能性成分的含量及抗氧化能力,表示萌发青稞可以作为一种天然的抗氧化食品原料,这也为青稞功能性相关食品的开发提供了数据支撑和理论参考。
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