食醋的生产及消费在我国历史悠久,是一种深受消费者青睐的调味品。我国传统食醋生产以固态发酵为主[1]。固态发酵是一种粗放式发酵方式,使用的酒曲微生物菌群丰富,酒曲以及环境中诸多产风味化合物的微生物参与了醋的生产过程,所以固态醋的风味较好[2-3]。但固态工艺存在生产环境差、发酵周期长、劳动强度大、机械化程度低、产品品质不稳定、规模扩大受到限制等不足。随着科学技术的不断进步,目前液态食醋工艺已逐步成为主要的食醋生产方式,该工艺糖化、发酵剂分别采用淀粉酶制剂和酿酒酵母,再接种醋酸菌进行深层通风醋酸发酵,基本属于纯种发酵工艺。与传统固态发酵工艺相比,尽管克服了固态工艺的诸多不足,但参与发酵过程的微生物只有酿酒酵母和醋酸菌,所以使得构成产品风味的有机酸和风味化合物含量偏低,产品的整体风味不足[4]。因此,强化液态食醋发酵功能微生物,改善提升液态食醋风味品质已成为当前的研究热点。
本研究旨在分离筛选适应于食醋生产环境的产香微生物,应用于液态食醋生产,改善提升液态发酵醋的风味品质。本文从酒曲样品中,以产酯能力为筛选指标,分离获得一株产香酵母菌株-光滑假丝酵母HQ9,研究考察了其在液态食醋酿造中的应用情况。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
大米、酒曲,山东淄博玉兔食品有限公司;有机酸标准品、2-辛醇(色谱级),上海麦克林生化科技有限公司;液化酶、糖化酶,诺维信生物技术有限公司;其他试剂来自国药集团。除另有说明,所有试剂均为分析纯。
酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)JM12、醋酸杆菌(Acetobacter aceti)SFC-YT19,实验室保藏菌株。
1.2 培养基
YPD液体培养基(g/L):蛋白胨10.0,葡萄糖20.0,酵母提取物10.0,118 ℃灭菌20 min。
YPD固体培养基(g/L):蛋白胨10.0,葡萄糖20.0,酵母提取物10.0,琼脂20.0,118 ℃灭菌20 min。
产酯培养基(g/L):葡萄糖150.0,蛋白胨10.0,酵母提取物10,118 ℃灭菌20 min。
醋酸菌液体发酵培养基(g/L):葡萄糖10.0,酵母提取物10.0,118 ℃灭菌20 min,灭菌后加入无水乙醇60.0。
1.3 仪器与设备
湘仪L530离心机,湖南湘仪实验室仪器开发有限公司;分光光度计,上海尤尼科仪器有限公司;Alphaclean1300洁净工作台,力康精密仪器(上海)有限公司;恒温摇床,上海知楚仪器有限公司;GC7890B气相色谱仪,CYCLODEX-B色谱柱,美国Agilent公司;UltiMate 3000液相色谱仪,HPX-87H色谱柱,美国Thermo Scientific公司;固相微萃取(solid phase micro extraction,SPME)装置,Supleco公司;Trace130-TraceIS气相色谱质谱联用仪,赛默飞世尔科技有限公司;FlavourSpec风味分析仪,山东海能科学仪器有限公司。
1.4 实验方法
1.4.1 产香酵母的分离和筛选
取酒曲样品加入无菌生理盐水充分振荡,稀释后涂布于YPD固体培养基,30 ℃恒温培养24～48 h。挑取具有典型酵母形态特征的单菌落,纯化后低温保存备用[5]。将保存菌株转接活化1次,接种于产酯培养基中,30 ℃、120 r/min摇床培养72 h,发酵液离心去菌体,上清液通过人工嗅闻、总酯测定等方法,筛选香气浓郁和产酯高的菌株。
1.4.2 菌株形态观察和鉴定
将筛选获得的产香酵母菌株接种于YPD固体培养基,30 ℃培养24 h,观察菌落和菌体形态。同时将活化的菌种接种YPD液体培养基,30 ℃、120 r/min培养24 h,离心收集菌体,用生理盐水洗涤2次,委托派森诺生物科技公司进行ITS rDNA测序,测序结果在NCBI数据库进行序列同源性BLAST比对。
1.4.3 菌株生长环境适应性
将供试菌株的甘油管菌种在YPD液体培养基中转接活化一次,然后按5%(体积分数)的接种量接种于不同的测试用YPD培养基中,30 ℃、120 r/min摇床培养24 h,发酵液适当稀释后600 nm处测定OD值。通过细胞生长情况考察菌株生长最适温度和pH以及对葡萄糖和乙醇耐受性[6]。
1.4.4 菌株HQ9在液态食醋酿造中的应用研究
种子液制备:将HQ9酵母菌接种到YPD培养基中,30 ℃振荡培养24 h。离心收集菌体,重悬于无菌生理盐水中,调整细胞浓度约1×108 cells/mL;酿酒酵母JM12按照相同的方法制备种子液;醋酸杆菌SFC-YT19接入醋酸发酵液体培养基中,30 ℃、200 r/min摇床培养24 h,制成醋酸菌种子液。
酒精发酵[7]:将大米和水按照1∶3(g∶mL)的比例混合,室温浸泡16～18 h,打浆。混合米浆中加入适量中温α-淀粉酶,88～90 ℃液化30 min,分装后灭菌,冷却至60 ℃后加入150 U/g糖化酶,自然冷却至室温分别接种5%(体积分数)制备的HQ9和JM12种子液,30 ℃下静置发酵6～8 d,制得米酒。
醋酸发酵:酒精发酵结束后,取发酵醪过滤除掉大米残渣,清液加适量的无菌水调整酒精度为6%～7%,按10%接种量接入醋酸杆菌SFC-YT19种子液,于30 ℃,200 r/min摇床培养至酸度达到4～8 g/100 mL时,加入2% NaCl终止培养,制得米醋。
1.5 分析方法
1.5.1 总酯含量测定
发酵液总酯含量测定参考CHEN等[8]的方法。取1 mL除菌体后的发酵液加入9 mL去离子水,滴加1～2滴酚酞,用0.1 mol/L NaOH标准溶液(C)滴定至粉红色,加入10 mL 0.1 mol/L NaOH标准溶液(Va)置于30 ℃下皂化过夜,再用0.1 mol/L H2SO4标准溶液(C1)反向滴定至红色刚刚消失。记录消耗的H2SO4溶液体积Vb,空白培养基作对照。以乙酸乙酯计,总酯含量的计算如公式(1)所示:。
总酯含量
(1)
式中:88.12为乙酸乙酯的摩尔质量分数,g/mol。
1.5.2 总酸含量测定
总酸参考GAO等[9]的方法进行测定。将除菌体后的醋酸发酵液适当稀释,用0.01 mol/L的NaOH标准溶液进行滴定,总酸以乙酸计。
1.5.3 乙醇浓度测定
发酵液离心去菌体,取2 mL清液按1∶1比例加入乙酸乙酯萃取,用正丁醇作为内标。用气相色谱分析,FID检测器,CYCLODEX-B色谱柱;氮气作为载气(1.5 mL/min);进样口和检测器温度均为220 ℃;柱温为50 ℃(5 min),以30 ℃/min逐级增加升温为240 ℃(3 min)。内标法定量。
1.5.4 葡萄糖和有机酸含量测定
发酵液离心去菌体,取上清液适当稀释,采用HPLC分析,色谱柱HPX-87H,流动相0.05 mol/L H2SO4。色谱条件:进样量20 μL,流速0.6 mL/min。葡萄糖糖分析采用示差检测器(RID-10A),检测温度为65 ℃;有机酸分析采用UV检测器(UltiMateTM 3 000 VWD),检测波长为210 nm,检测温度为35 ℃。采用外标法定量。
1.5.5 米醋中挥发物分析
参考吕想等[10]的方法,采用顶空-气相色谱-离子迁移(headspace gas chromatography ion mobility spectrometry, HS-GC-IMS)测定食醋中挥发性物质。醋酸发酵液离心去菌体,取5 mL清液加入碳酸氢钠中和,加入顶空样品瓶中在60 ℃下500 r/min孵育15 min,在85 ℃下自动进样500 μL。MXT-5毛细管柱(15 m,0.53 mm ID,1 μm FT);柱温60 ℃;载气/漂移气N2(99.999%)。IMS温度:45 ℃,以正离子模式;载气体积流量为0～2 min,2 mL/min;2～20 min,2～100 mL/min;20～30 min,100 mL/min;漂移气流量为150 mL/min。采用正构酮C4～C9校准液计算各物质的保留指数(retention index, RI),基于NIST的RI和IMS数据库对挥发性化合物进行定性。
1.5.6 感官评价
所用米醋样品均由10名专业评委组成得小组进行评估(5名女性和5名男性),他们被认为对区分气味敏感。在向评委展示之前,样品被倒入玻璃杯中,随机编号。所有评委根据米醋的味道和香气,使用0(非常差)～8(优秀)等级评分[11]。
1.6 统计分析
使用Origin 2023软件(OriginLab,Northampton)对数据作图;IMS仪器软件Gallery Plot插件绘制指纹图谱;SPSS 22软件进行数据单因素方差显著性分析。数值表示为均数±标准差[12]。
2 结果与分析
2.1 产香酵母的分离、筛选及鉴定
从几种食醋发酵常用大曲中通过平板分离共筛选到24株酵母菌,随后对菌株发酵产酯能力进行考察。通过感官嗅闻选择其中6株香气愉悦且特征鲜明的菌株,对其发酵液中总酯和乙醇含量进行分析,结果见表1。由表1看菌株HQ9总酯产量最高,达到(7.46±0.87) g/L,和文献报道的生香酵母相比总酯产量比较高[13-14]。另外,HQ9还具有较好的酒精生产能力,乙醇产量达到(61.02±0.81) g/L。而菌株JQ6乙醇产量最高,达(68.24±0.57) g/L,但产总酯仅为(2.69±0.45) g/L,综合分析,从改善产品风味品质角度,选择HQ9酵母菌株为进一步研究的对象。
表1 筛选菌株产酯、产醇和香气评价
Table 1 Screening strain ester production, alcohol production and aroma evaluation
酵母感官特征总酯产量/(g/L)乙醇产量/(g/L)LQ6酱菜味 5.02±0.88d35.78±0.40eHQ9果香味 7.46±0.87a61.02±0.81bJQ6酒香味 2.69±0.45e68.24±0.57aJQ8葡萄味 5.34±0.63c54.2±0.33cSQ5甜面包味6.22±0.82b25.10±0.91fSQ7香木头味2.74±0.59e52.10±0.79d
注:结果表示为平均值±标准偏差(P<0.05)(n=3)。
菌株HQ9在YPD固体培养基上30 ℃培养24 h后,其结果如图1所示。菌落呈现圆形、乳白色、表面凸起、光滑,边缘整齐,菌体细胞呈圆形或椭圆形,出芽繁殖,通过ITS rDNA序列测定和分析HQ9菌株初步鉴定为光滑假丝酵母(Candida glabrata)。
图1 菌株HQ9的菌落形态及显微形态
Fig.1 Colony morphology and micromorphology of strain HQ9
2.2 菌株HQ9生长特性
米醋生产过程酵母的生长代谢与环境密切相关。食醋酿造酒精发酵阶段属于高糖、高乙醇含量以及偏酸性环境,用于生产过程强化的微生物菌株需要具有对生产环境条件的适应和耐受能力。菌株HQ9在不同起始葡萄糖质量浓度下的生长情况如图2-a所示,在起始糖质量浓度150 g/L时,菌体浓度最高,且在300 g/L糖质量浓度高渗环境中仍能生长,说明菌株具有一定高渗透压耐受性。如图2-b所示,随着培养基乙醇浓度增加HQ9生长虽然逐步受到抑制,但在200 g/L的高质量浓度乙醇环境中仍能生长,表明HQ9能够很好地适应酒精发酵环境。菌株HQ9在不同温度下生长情况如图2-c所示,菌株HQ9生长温度范围较宽,最适生长温度为30～35 ℃,但在40 ℃仍能很好的生长;同时,菌株HQ9 pH值适应性考察结果见图2-d,pH值适应范围较宽,最适生长pH为4.0～5.0,当pH为2.0～3.0仍然生长良好,说明菌株HQ9具备良好的耐酸能力。
a-葡萄糖质量浓度;b-乙醇质量浓度;c-温度;d-pH值
图2 不同条件下酵母菌株HQ9的生长情况
Fig.2 Growth of yeasts strains HQ9 at different conditions
a-葡萄糖消耗速率;b-乙醇生成速率
图3 米醋酒精发酵过程中葡萄糖和乙醇含量的变化
Fig.3 Changes of the content of glucose and alcohol in rice vinegar during alcohol fermentation
2.3 菌株HQ9在液态米醋酿造中的应用
2.3.1 米醋的制备
以酿酒酵母JM12为对照,比较研究考察了菌株HQ9酒精发酵进程,2株菌株发酵过程葡萄糖消耗和乙醇生产速率分别见图3-a和图3-b。结果显示,酿酒酵母JM12酒精发酵能力更强、速度更快,6 d内酒精发酵基本结束,产率达到(11.75±1.8)%;HQ9发酵速度略慢,但仍有较高的乙醇产率,达到(10.65±2.8)%,并且产酯类物质能力较好达到160.97 μg/kg,能够满足醋酸发酵需求,具有应用于液态米醋生产的良好潜力。酒精发酵完成后,过滤去除米渣,滤液加入无菌水调整酒精度为6%～7%,接入醋酸杆菌SFC-YT19摇床培养至酸度达到4～8 g/100 mL结束发酵离心去菌体,然后对醋酸发酵液进行分析。
2.3.2 米醋有机酸分析
米醋总酸和有机酸含量液相色谱分析结果如表2所示。结果表明,生香酵母可代谢产生风味有机酸类,有机酸又可被转化生成酯类、醛类等风味物质,影响食醋整体品质。菌株HQ9酒精发酵获得的醋酸发酵液总酸含量和醋酸含量比菌株JM12稍低,但其他有机酸含量较JM12有所增加。单纯醋酸刺激性强,柠檬酸、苹果酸、琥珀酸等不挥发酸的存在可以缓和醋酸刺激性,使食醋的味道更柔和丰富[15]。
表2 米醋样品中有机酸种类和含量 单位:g/L
Table 2 Types and contents of organic acids in rice vinegar samples
有机酸种类JM12HQ9乳酸 2.132.82草酸 0.671.24柠檬酸1.381.65苹果酸0.390.43琥珀酸0.530.78甲酸 0.060.05醋酸 33.2728.41总酸 46.3341.83
2.3.3 菌株HQ9对米醋挥发性物质的影响
采用HS-GC-IMS技术分析2种食醋样品中的挥发性风味物质。将菌株HQ9应用发酵米醋,样品中共检测到55个共有香气成分,其中醇类7种、酯类13种、醛类6种、酮类9种、酸类2种,呋喃类2种和其他4种,未定性12种(未定性未列出),结果见表3。菌株JM12酒精发酵米醋样品酯类中除乳酸乙酯含量较高外,其他酯类含量大多都低于HQ9酒精发酵样品,7种醇类物质只有异丁醇高于HQ9,而醛类和酮类物质JM12含量相对高些,6种醛类化合物有苯甲醛等3种高于HQ9,9种酮类化合物有3-羟基丁酮等6种高于HQ9发酵,所以酿酒酵母JM12酒精发酵所制得米醋样品的醇和酯含量低于HQ9,醛酮类物质含量高于HQ9发酵。醇类和酯类是食醋中占比最大的风味物质,酯类物质可以产生强烈的水果香味和花香味[16],适量高级醇可以增加食醋香气浓厚感[17],丰富了食醋香味层次。结果如图4、图5所示,从2种食醋样品的挥发物指纹图谱比较和主成分差异性分析也可以看出2组米醋风味差异明显。
图4 不同米醋样品中挥发性化合物的指纹图谱
Fig.4 Fingerprints of volatile compounds in different rice vinegar samples
图5 不同米醋样品的主成分分析图
Fig.5 Principal component analysis of different rice vinegar samples
表3 米醋挥发性成分种类及含量变化
Table 3 The variation of volatile components species and content in rice vinegar
类别序号化合物峰面积JM12HQ9酯类e1乙酸异戊酯44.32±15.887 220.64±136.68e2胡萝卜酸乙酯116.40±6.0549.34±8.9e3乳酸乙酯-D1 790.61±8.99407.43±5.04e4乙酸乙酯6 317.69±121.5810 248.63±238.47e5乳酸乙酯-M450.00±13.55209.66±3.92e62-甲基丙酸乙酯79.06±10.3210.20±2.43e7乙酸异丁酯30.26±6.773 781.28±110.86e8乙酸丙酯22.69±3.84172.71±3.9e9乙酸甲酯118.17±3.74480.74±5.95e102-氧代戊酸甲酯179.41±4.92467.48±1.86e11乙酸丁酯5.89±2.98188.68±6.21e12丙酸异丙酯10.17±5.33330.76±43.19e13丙烯酸乙酯47.22±10.781 640.62±20.99醇类o12-苯乙醇2 636.46±14.5 3 511.46±47.41 o22-庚醇34.46±1.14199.88±11.95o3异辛醇(2-乙基己醇)30.86±2.4649.10±1.12o4异丁醇246.88±3.2410.33±4.15o5异戊醇(3-甲基丁醇)40.80±7.25403.21±1.6o64-甲基-2-戊醇24.90±1.38438.51±32.89o71-戊烯-3-醇194.67±130.661 821.33±5.47醛类a1苯甲醛3 316.79±2.91 865.43±30.03a22-甲基丁醛368.17±6.2714.88±3.77a3乙醛644.86±46.881 695.71±384a4丙醛2 184.41±39.889 444.93±55.76a52-丁烯醛173.33±15.923 485.95±5.78a6(E)-2-甲基-2-丁烯醛827.80±4.2392.93±11.49酸类s12-甲基丁酸60.63±7.89 174.99±3.29 s23-甲基戊酸38.27±10.66203.28±1.99酮类k1香芹酮152.44±1.29 100.69±11.56k25-甲基-3-庚酮13.43±10.03123.49±1.4k32-已酮653.53±16.93398.82±6.77k4甲基异丁基甲酮1 853.28±66.641 158.14±7.5k53-羟基-2-丁酮5 033.35±54.132 381.08±126k62-丁酮860.89±27.28144.87±5.95k73(2H)-呋喃酮48.45±8.630.86±0.02k84-甲基-2-戊酮122.63±11.7712.63±2.56k92,3-戊二酮55.41±14.061 634.98±7.97其他类t12-乙基呋喃88.24±5.26 392.00±13.38t22-甲基二氢-3(2H)-呋喃酮450.89±11.76916.84±11.8t3乙硫醚269.41±2.4155.87±5.98t4二丙硫醚138.05±4.6390.85±1.04t52-甲基吡嗪70.97±1.74392.35±0.11t61-庚烯92.91±6.251 255.77±16.17
2.3.4 感官品评
在仪器分析的基础上,本文对HQ9菌株发酵酒精制得的米醋样品进行了感官品评,结果如图6所示,2种米醋样品外观色泽差异不明显,而口感和香气方面,菌株JM12酒精发酵米醋样品酸味刺激性较强,香气稍显单薄。相比之下,以HQ9酒精发酵米醋样品具有苹果果香,花果香更浓郁,口感和味道都优于菌株JM12样品组。
图6 米醋感官品评结果
Fig.6 Sensory evaluation results of rice vinegar
3 结论
酒精发酵是食醋酿造的关键工艺之一,传统食醋多采用酿酒曲作为发酵剂,为了简化工艺、提高效率,也可以使用酿酒酵母进行纯种发酵,采用普通酿酒酵母酒精发酵速度快,但酒体香气单薄,严重影响食醋的品质。筛选具有优秀产酯能力的菌株进行酒精发酵或辅助发酵是改善食醋风味品质的重要手段之一[18-20]。本文采用人工嗅闻结合仪器分析从酿酒曲中筛选到一株光滑假丝酵母菌株HQ9,以含15%葡萄糖的培养基进行摇甁培养,菌株HQ9产总酯达(7.46±0.87) g/L,研究发现该菌株同时具有乙醇发酵能力,乙醇产率达(61.02±0.81) g/L,对30%(体积分数)葡萄糖浓度的高渗透压、20%(体积分数)乙醇浓度等环境具有良好的耐受性,能够很好地适应液态食醋的生产环境。以酿酒酵母JM12为对照,考察了HQ9用于米醋发酵对食醋风味的影响。有机酸分析结果显示,HQ9酒精发酵所制米醋样品醋酸含量略低,但柠檬酸、苹果酸和琥珀酸等非挥发性酸含量较高,酸味更柔和。挥发性风味物质分析发现JM12酒精发酵米醋样品醛酮类物质含量高于HQ9发酵样品,但醇和酯含量均低于HQ9。感官评价显示HQ9酒精发酵所制得米醋香气浓郁、酸味柔和、整体味道愉悦,可以明显提升液态米醋的感官品质和风味。研究结果表明,产香酵母HQ9菌株具有良好的工业化应用潜力。
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