人在运动过程中伴随着体内水分、碳水化合物、电解质等物质的流失,会在运动后产生疲劳的感觉。运动后疲劳的产生与体内产生过量的自由基有关。在剧烈运动时,人体体内生成的大量自由基导致体内抗氧化与氧化的平衡稳态被破坏[1-2],引起肝脏和骨骼肌线粒体发生脂质过氧化损伤,破坏生物膜正常功能,导致肌肉工作能力下降[3-4]。为了减轻运动后的疲劳,通过补充外源性抗氧化剂可减少机体的氧化损伤,减轻运动后的疲劳。近年的研究发现,动植物来源的一些活性肽具有良好的抗氧化活性及抗疲劳功效[5-8],安全性高,稳定性良好,是制备运动饮料的理想原料。

沙蚕俗称海虫、海蜈蚣等,是一种食疗兼优的药膳[9]。近年的研究发现双齿围沙蚕的超高压提取物[5]及酶解产物(胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶)均具有良好的DPPH自由基、超氧阴离子自由基、及羟自由基清除作用,具有很强的抗氧化活性;且双齿围沙蚕酶解产物的小分子肽得率较高[10],是一种制备小肽运动饮料的理想原料,因此本研究拟利用湛江地区养殖的双齿围沙蚕为实验原料,以低于5 kDa的碱性蛋白酶酶解产物作为目标肽段,进行沙蚕运动饮料的研制,并探究沙蚕运动饮料的体内抗疲劳功效,为双齿围沙蚕功效食品的研发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜双齿围沙蚕,遂溪腾飞生物科技有限公司;罗汉果多糖,河南天宸生物科技有限公司;安琪酵母,安琪酵母发展有限公司;白砂糖、柠檬,广东海洋大学商中小卖部;氢氧化钠、碱性蛋白酶、无水乙醇、氯化钠、磷酸二氢钾、磷酸二氢钠(以上均为分析纯)、硝酸(优级纯),广东光华科技股份有限公司;DPPH,广州市齐云生物科技有限公司;平板计数培养基、马铃薯葡萄糖琼脂培养基、结晶紫中性红胆盐琼脂、煌绿乳糖胆盐肉汤培养基,北京陆桥技术股份有限公司;尿素氮、乳酸、肝糖原试剂盒,南京建成生物工程研究所;昆明小鼠,广西医科大学。

1.2 仪器与设备

FM-100雪花制冰机,宁波新芝生物科技股份有限公司;BM255搅拌机,广东美的精品电器制造有限公司;BSA124S-CW万分之一电子天平,赛多利斯科学仪器北京有限公司;HH-4数显恒温水浴锅,上海梅香仪器有限公司;AUY220电子天平、UV-2550紫外分光光度计,日本岛津公司;CR22GⅡ高速冷冻离心机,日本日立公司;LD-50G-D超纯水机,重庆利迪实验仪器设备有限公司;DHG-9240A电热鼓风干燥箱,上海-恒科学仪器有限公司;SKY-1102C摇床,SUKUN;PHS-3C pH计,上海精密科技有限公司;YXQ-LS-50G立式压力蒸汽灭菌锅,上海博讯实业有限公司;Mini pellicon超滤装置,美国Minipore。

1.3 实验方法

1.3.1 实验原料的预处理

新鲜沙蚕匀浆后以料水比为1∶5(g∶mL)的比例加水,按3 000 U/g原料比例加入碱性蛋白酶后调节pH至8.5,于摇床中50 ℃水温酶解7 h后,沸水浴灭酶10 min,高速离心机8 000 r/min离心20 min后取上清液,依次过8 kDa与5 kDa的分子质量超滤膜,所获得的透过5 kDa超滤膜的小于5 kDa的沙蚕酶解产物即为沙蚕运动饮料的原料。

1.3.2 沙蚕运动饮料辅料的确定

参考GB 15266—2009《运动饮料》,筛选几种沙蚕运动饮料的辅料以及电解质种类,测定添加辅料1[小于5 kDa的沙蚕酶解产物50%、酵母0.08%、罗汉果多糖0.02%、白砂糖5%、柠檬汁1.2%、氯化钠0.05%、磷酸二氢钾0.05%、磷酸二氢钠0.1%(均为质量分数)和水补足余量]、辅料2[小于5 kDa的沙蚕酶解产物50%、罗汉果多糖0.02%(均为质量分数)和水补足余量]和不添加辅料[小于5 kDa的沙蚕酶解产物50%(质量分数)和水补足余量]对DPPH自由基清除作用的影响。

1.3.3 沙蚕运动饮料杀菌条件的确定

参考饮料杀菌的方法筛选3种杀菌方法:

a)巴氏杀菌:温度为80～85 ℃,杀菌时间30 min;

b)煮沸杀菌:温度为95～100 ℃,杀菌时间为20 min;

c)高压蒸汽灭菌:压力103 kPa,温度为121 ℃,杀菌时间为15 min。

将配制好的饮料灌装排气后分别采用以上方法杀菌,杀菌后的饮料分别检测其对DPPH自由基的清除能力及其杀菌效果,从而确定最优的杀菌条件。

1.3.4 小于5 kDa的沙蚕酶解产物添加量的确定

在其他辅料添加量不变的情况下(白砂糖5%、罗汉果多糖0.02%、柠檬汁1.2%、氯化钠0.05%、磷酸二氢钾0.05%、磷酸二氢钠0.1%,均为质量分数),添加不同量的小于5 kDa沙蚕酶解产物(35%、40%、45%、50%,质量分数)配制饮料,水补充余量,配制好的饮料灌装排气后采用高压蒸汽灭菌后分别检测其对DPPH自由基的清除能力。

1.3.5 沙蚕运动饮料口感的确定

参考尤久勇[11]的实验方法,筛选来自不同人群的15个人设计正交试验进行饮料调试,以10分制按表1所示的评分标准确定沙蚕酶解产物、糖和酸的添加量。

1.3.6 DPPH自由基清除能力的确定

采用比色法测定DPPH自由基的清除作用[12]。分别吸取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL的样品溶液,蒸馏水补足至1 mL,加入3 mL DPPH溶液,摇匀静置20 min后,8 000 r/min离心10 min,取上清液于517 nm处测定其吸光度,DPPH自由基清除率的计算如公式(1)所示:

DPPH自由基清除率

(1)

式中:A0是DPPH空白对照组,即0 mL样品管的吸光度;Ai为其余样品管的吸光值。

计算出DPPH自由基清除率后再利用IC50软件计算出各样品的IC50值。

1.3.7 理化性质的检测

可溶性固形物按GB/T 12143—2008《饮料通用分析方法》规定的方法(20 ℃时折光计法)测定,钾含量、钠含量采用火焰原子吸收光谱法按GB 5009.91—2017《食品安全国家标准 食品中钾、钠的测定》测定。

1.3.8 微生物指标的检测

菌落总数的检验方法参照GB 4789.2—2022《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》;取样方法参照GB 4789.1—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 总则》;大肠菌群数的检验方法参照GB 4789.3—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 大肠菌群计数》中的平板计数法;霉菌、酵母的检测方法参照GB 4789.15—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 霉菌和酵母计数》。

1.3.9 抗疲劳功效的研究

1.3.9.1 小鼠的饲养及分组

小鼠适应5 d后,进行适应性游泳训练,剔除游泳能力特强或者游泳能力特弱的小鼠后将小鼠随机分成阴性对照组、阳性对照组、低剂量组、中剂量组、高剂量组5组,每组小鼠16只。

1.3.9.2 灌喂

每天灌喂一次。阴性对照组以蒸馏水灌喂,每次灌喂剂量为0.3 mL/10 g体重;阳性对照组以红牛饮料灌喂,每次灌喂剂量为0.3 mL/10 g;低剂量组、中剂量组、高剂量组均以沙蚕运动饮料进行灌喂,灌喂剂量分别为0.2 mL/10 g体重、0.3 mL/10 g体重、0.4 mL/10 g体重,连续灌喂30 d。

1.3.9.3 小鼠游泳训练

灌喂完成1～2 h后让小鼠在100 cm×50 cm×60 cm的泳池中进行游泳训练,水温保持在25 ℃,游泳时间60 min左右后逐渐加强至90 min,训练完成后用毛巾将小鼠擦干。每周2次,训练至第30天。

1.3.9.4 力竭游泳

饲养灌喂30 d后进行小鼠负重游泳实验,将被选的8只实验小鼠尾尖绑上小鼠体重5%的铅坠,在灌喂30 min后按批次投入游泳箱中并驱使小鼠不停的游动,且水温保持在30 ℃,直至小鼠沉入水中5.0 s不能浮出水面即可判断为力竭[13]。记录小鼠游泳力竭的时间和序号。

1.3.9.5 血液、肝脏采集

饲养灌喂30 d后进行小鼠血样及肌肉的采集。小鼠灌喂30 min后按批次放入游泳池中并驱赶使小鼠不停地游泳,水温保持在25 ℃,每组游泳90 min后将小鼠身体擦干立即进行眼球取血,3 000 r/min离心10 min进行血清分离,用于血清尿素氮、血乳酸测定,并解剖小鼠采集完整肝脏,用锡纸包裹放入-80 ℃超低温冰箱保存备用,用于测定肝糖原[13]。

1.4 数据统计分析

所有实验至少重复3次,数据以平均数±标准差表示,采用SPSS 19.0软件(SPSS Inc.,Chicago,IL,USA)进行统计学分析,GraphPad Prism6进行绘图。参数数据的分析采用Tukey秩后检验进行显著性分析(单因素方差分析);非参数数据采用bonferroni校正后的Wilcoxon-Mann-Whitney U检验进行显著性分析(Kruskal-Wallis检验),P<0.05表示具有显著性差异,P<0.01表示具有极显著性差异。

2 结果与分析

2.1 辅料对DPPH自由基清除作用的影响

在没有灭菌情况下,测定添加辅料1(小于5 kDa的沙蚕超滤组分50%、酵母0.08%、罗汉果多糖0.02%、白砂糖5%、柠檬汁1.2%、氯化钠0.05%、磷酸二氢钾0.05%、磷酸二氢钠0.1%和水补足余量)、添加辅料2(小于5 kDa的沙蚕超滤组分50%、罗汉果多糖0.02%和水补足余量)和不添加辅料(小于5 kDa的沙蚕超滤组分50%和水补足余量)对DPPH自由基清除作用的影响,结果如图1所示,添加辅料不会抑制沙蚕原料清除DPPH自由基的活性,反而增强了清除自由基的能力,同时也证明了罗汉果多糖是辅料中的活性物质之一。

2.2 灭菌方式对沙蚕运动饮料的DPPH自由基清除作用的影响

为了了解不同的灭菌方式对饮料的DPPH自由基清除作用的影响,选择了3种不同的灭菌方式(巴氏杀菌:温度为80～85 ℃,杀菌时间30 min;煮沸杀菌:温度为95～100 ℃,杀菌时间为20 min;高压蒸汽灭菌:压力121 kPa,温度为121 ℃,杀菌时间为15 min)与未灭菌的饮料进行DPPH自由基清除作用的对比,结果如图2所示,3种灭菌方式对沙蚕饮料灭菌后其DPPH自由基清除率均显著提高,其中高压蒸汽灭菌(121 ℃,15 min)后沙蚕饮料DPPH自由基清除效果最好。由此确定沙蚕运动饮料的灭菌方式为高压蒸汽灭菌(121 ℃,15 min)。

2.3 小于5 kDa的沙蚕酶解产物添加量对沙蚕运动饮料DPPH自由基清除作用的影响

沙蚕饮料中小于5 kDa的沙蚕酶解产物的添加量对沙蚕运动饮料DPPH自由基清除作用的影响如图3所示,添加小于5 kDa的沙蚕酶解产物的浓度为35%～45%时饮料的DPPH自由基清除作用呈现出随添加量的增加而增强的趋势,添加量为45%～50%时饮料的DPPH自由基清除作用变化不大。

2.4 饮料调试正交试验

对沙蚕运动饮料的主料(小于5 kDa的沙蚕酶解产物)和影响口感的部分辅料(白砂糖、罗汉果多糖、柠檬汁)的含量进行筛选,采用正交试验,具体方案如表2所示,以确定其对饮料口感的影响。由表3正交试验结果可以看出,沙蚕运动饮料主料和部分辅料的最佳组合水平为6号(A2B2C1D4),即沙蚕酶解产物添加量40%、白砂糖添加5%、罗汉果多糖添加0.02%、柠檬汁添加1.2%。从Rj值可看出影响饮料感官的因素主要为白砂糖,其次是沙蚕酶解产物,最后是柠檬汁。确定沙蚕运动饮料主料及部分影响口感辅料的含量后,根据运动饮料国标中对电解质含量的要求,选用0.05%磷酸二氢钾、0.1%磷酸二氢钠与0.05%的NaCl作为电解质的主要来源,同时加入沙蚕酶解产物0.2%的酵母于37 ℃发酵30 min去除其中的腥味。对确定最佳配方的运动饮料进行抗氧化活性的测定,其DPPH自由基的清除率为94.1%,IC50值为0.8 mg/mL,具有良好的抗氧化活性。

2.5 沙蚕运动饮料对小鼠体重的影响

小鼠在灌喂沙蚕运动饮料期间的体重变化可反映运动饮料对其健康状况的影响,小鼠体重过快增加或减少均不利于其健康。沙蚕运动饮料对小鼠体重的影响如表4所示,小鼠在灌喂周期内体重均呈平稳增长趋势,各组间小鼠体重增加状况不存在显著性差异,结合在动物实验期间小鼠没有出现异常和死亡情况,也不见异常行为特征,表明沙蚕运动饮料中不存在影响小鼠生长状况的特殊成分。

2.6 沙蚕运动饮料对小鼠运动耐力的影响

2.6.1 沙蚕运动饮料对负重游泳时间的影响

负重游泳是一种评估抗疲劳实验的运动模型[14],小鼠负重游泳时间的长短可反映其疲劳程度。由图4可以看出,灌喂沙蚕运动饮料1个月后小鼠负重游泳时间与灌喂剂量呈正相关关系,负重游泳时间随着灌喂饮料剂量的增大而延长,高剂量组的负重游泳时间与阴性对照组相比呈现显著性延长(P<0.01),且长于阳性对照组,表明沙蚕运动饮料可提高小鼠的运动耐力,具有显著延长小鼠力竭游泳时间的功效。

2.6.2 沙蚕运动饮料对肝糖原的影响

肝糖原是提供机体运动能量的物质之一,其消耗和代谢副产物的堆积被认为是造成疲劳的原因[15],当肝糖原贮存量较少时会导致供能不足,使机体容易产生疲劳感[16]。不同剂量的沙蚕饮料均可以显著提高小鼠体内的肝糖原含量(P<0.01)(图5),且高剂量的沙蚕饮料提高小鼠肝糖原的含量高于红牛饮料,表明沙蚕运动饮料可能是通过提高机体肝糖原的贮存量使机体达到抗疲劳功效。

2.6.3 沙蚕运动饮料对血清尿素氮的影响

血清尿素氮可反映出机体蛋白质的代谢情况,运动时体内蛋白质及氨基酸的分解代谢能力增强,使代谢产物血清尿素氮含量增高[17]。血清尿素氮含量与运动耐受力呈负相关关系,血清尿素氮增幅越大则表明机体的运动负荷能力越差[18]。不同剂量的沙蚕饮料均可以显著降低小鼠血清中的血清尿素氮含量(P<0.01)(图6),表明沙蚕运动饮料可能在运动过程中减缓小鼠运动时蛋白质的分解,抑制血清尿素氮的产生提高机体运动耐受能力,从而达到抗疲劳的目的。

2.6.4 沙蚕运动饮料对血乳酸的影响

机体剧烈运动时,体内的糖通过无氧酵解为机体获取能量,所产生的大量血乳酸堆积在体内,破坏体内酸碱平衡,导致肌肉出现酸痛,机体运动耐力下降[19]。不同剂量的沙蚕饮料均可以一定程度的降低小鼠血乳酸的含量,其中低剂量的沙蚕运动饮料可显著降低小鼠血乳酸的含量(P<0.01)(图7),表明沙蚕运动饮料可以抑制小鼠运动时血乳酸的产生或清除血乳酸,减少血乳酸在体内的积累量,起到一定的抗疲劳作用。沙蚕运动饮料降低血乳酸的水平与其剂量不呈剂量依赖性,低剂量沙蚕运动饮料呈现最好的降血乳酸的效果,推测灌喂低剂量的沙蚕运动饮料可能通过糖异生途径,促进了乳酸向肝糖原的转化,使得低剂量组小鼠的血乳酸含量降低,但具体原因有待未来进一步深入研究。

2.7 产品质量评价

2.7.1 感官指标

色泽:饮料呈黄色,与原料颜色相符;滋味气味:滋味适口,无其他异味;状态:澄清透明、状态均匀、无外来异物。

2.7.2 理化指标

配制好的沙蚕运动饮料经折光计法测得其可溶性固形物含量为6.0%,通过火焰原子吸收分光光度法测定以后确定钠含量与钾含量分别为749 mg/L和196 mg/L,符合运动饮料理化指标。

2.7.3 微生物指标

沙蚕运动饮料微生物指标符合GB/T 7101—2022《食品安全国家标准 饮料》,大肠杆菌、霉菌、酵母及菌落总数均未检出。

3 结论

本研究以双齿围沙蚕小分子酶解产物(<5 kDa)为原料,以DPPH自由基清除率作为评价指标考察不同辅料、不同含量的沙蚕小分子酶解产物、不同的灭菌方式对饮料抗氧化活性的影响并结合感官评价确定了沙蚕运动饮料的最佳配方为:沙蚕小分子酶解产物(<5 kDa)含量40%、白砂糖含量5%、罗汉果多糖含量0.02%、柠檬汁含量1.2%、磷酸二氢钾含量0.05%、磷酸二氢钠含量0.1%、NaCl含量0.05%(均为质量分数),在此条件下配制得到的沙蚕运动饮料呈黄色、色泽均一、澄清透明、滋味适口,其(质量浓度为2.25 mg/mL)DPPH自由基的清除率为94.1%,IC50值为0.8 mg/mL,小鼠灌喂沙蚕运动饮料30 d后可显著延长小鼠的负重游泳时间,提高小鼠肝糖原的含量并能显著降低小鼠血清尿素氮含量及血乳酸的含量,具有显著的抗疲劳功效。

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Research on sports beverage of Nereis succinea and its effects on anti-fatigue

ZHU Guoping1,2, CHEN Zihao3, YE Ning4*

1(College of Food Science and Technology, Guangdong Ocean University, Zhanjiang 524088, China)

2(Guangdong Key Laboratory of Aquatic Products Processing and Safety, Key Laboratory of Aquatic Products Deep Processing of Guangdong Universities, National R&D Center of Shellfish Processing Technology (Zhanjiang), South China Sea Biological Resources Development and Utilization Collaborative Innovation Center, Zhanjiang 524088, China)

3(Suixi Tengfei Biological Technology Company Limited, Suixi 524300, China)

4(College of Fisheries, Guangdong Ocean University, Zhanjiang 524088, china)

ABSTRACT A sports beverage was developed using small molecular weight hydrolysates (less than 5 kDa) of Nereis succinea.The effects of different auxiliary ingredients, different amounts of small molecular weight hydrolysates in Nereis succinea, and different sterilization methods on the DPPH free radical scavenging activity of the drink were investigated, and the optimal formula for Nereis succinea sports drink was determined by sensory evaluation.The anti-fatigue effect of the Nereis succinea sports drink was also explored.Experimental results showed that the optimal formula for the Nereis succinea sports drink was as follows:40% of the Nereis succinea small molecular weight hydrolysates (less than 5 kDa) content, 5% of white sugar, 0.02% of mogroside polysaccharide, 1.2% of lemon juice, 0.05% of potassium dihydrogen phosphate, 0.1% of sodium dihydrogen phosphate, and 0.05% of NaCl.At a concentration of 2.25 mg/mL, the DPPH free radical scavenging rate was 94.1% and the IC50 value was 0.8 mg/mL.Animal experiments showed that high-dose of Nereis succinea sports drink obviously (P<0.01) prolonged the load swimming time of mice, and low-, medium-, and high-dose of Nereis succinea sports drink significantly increased the content of liver glycogen (P<0.01) and significantly reduced the serum urea nitrogen content of mice (P<0.01).Meanwhile, low-dose of Nereis succinea sports drink obviously reduced the content of blood lactic acid in mice (P<0.01) and showed a significant anti-fatigue effect.

Key words Nereis succinea; small molecular weight hydrolysates; sports beverage; antioxidant; anti-fatigue

DOI：10.13995/j.cnki.11-1802/ts.035112

引用格式：朱国萍,陈自豪,叶宁.沙蚕运动饮料的制备及其对小鼠运动耐力的影响[J].食品与发酵工业,2024,50(8):204-210.ZHU Guoping,CHEN Zihao,YE Ning.Research on sports beverage of Nereis succinea and its effects on anti-fatigue[J].Food and Fermentation Industries,2024,50(8):204-210.

第一作者：博士,高级实验师(叶宁教授级高级工程师为通信作者,E-mail:2590713@qq.com)

基金项目：湛江市科技局项目(2014A03015);广东海洋大学博士启动费(060302042202)

收稿日期：2023-02-13,改回日期：2023-03-23