六堡茶,我国特有的一种黑茶,因产于广西壮族自治区梧州市苍梧县六堡镇而得名,距今已有1 500年历史[1]。六堡茶是以苍梧县群体种、大中叶种及其分离、选育的品种、品系茶树[Camellia sinensis (L.) O.Kuntze]的毛茶为原料,经特定的加工工艺(筛分、拼配、汽蒸或不汽蒸、渥堆、汽蒸、压制成型或不压制、陈化等)制成的茶叶[2-3],其中微生物发酵在其品质形成中发挥了关键的作用[4],造就了其独特的“红、浓、陈、醇”,并带有陈香、槟榔香或参香风味的品质,以及特殊的保健功效,产品远销香港、东南亚国家和地区,备受广大消费者的青睐[5-8]。
槟榔香是六堡茶特有的、极具辨识度的独特风味,也是六堡茶独特魅力所在。作为六堡茶独特的茶韵,槟榔香必须要在良好的仓储环境下经历一定年限的陈化才能形成,所以槟榔香大多存在于六堡陈茶和老茶中,新茶很少有槟榔香出现[9]。刘泽森等[10]采用顶空固相微萃取(headspace solid-phase microextraction, HS-SPME)结合气相GC-MS对不同年份槟榔香六堡茶进行研究,发现随着贮藏年份的增加,槟榔香六堡茶中香气越加浑厚,这可能与六堡茶中陈香类物质如雪松醇、杜松烯和花果香类物质如β-芳樟醇、氧化芳樟醇含量随着陈化时间的延长而升高有关。目前对六堡茶槟榔香的研究主要集中在对其感官理化分析和挥发性香气物质组成分析方面。黄林杰等[6]采用动态顶空结合气相GC-MS对槟榔香六堡茶挥发性物质进行分析,初步确定槟榔香主要挥发性成分为α-雪松醇、β-芳樟醇、(Z)-芳樟醇氧化物、水杨酸甲酯、苯甲酸甲酯、α-雪松烯、奈和甲氧基苯类化合物。LI等[11]采用HS-SPME结合GC-MS对槟榔香六堡茶进行研究,发现普勒酮、萘、1-甲基萘、2-甲基萘、2-庚酮、二氢-β-紫罗兰酮和2-戊基呋喃可能是形成六堡茶槟榔香的重要香气化合物。目前研究均为对槟榔香六堡茶挥发性香气物质的分析,对其关键香气物质组成深入研究较少,值得进一步挖掘。
HS-SPME是一种集取样、萃取、浓缩和进样为一体的挥发性物质提取技术,具有操作简单、样品用量少、无需使用溶剂、萃取样品后可直接色谱进样等优点,现已广泛应用于各种茶叶香气的分析中[11-13]。本研究采用HS-SPME联合气相色谱-嗅闻仪-质谱仪(gas chromatography-olfactometry-mass spectrometry, GC-O-MS)和气味活力值(odor activity value, OAV)对槟榔香六堡茶关键香气物质进行研究,以期为揭示六堡茶槟榔香特征风味形成机理提供理论和数据支撑。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
槟榔香六堡茶(5个样品,均仓储5～7年),梧州中茶茶业有限公司,茶叶经粉碎过2.0 mm圆孔筛,冰箱保存备用;氯化钠(分析纯),天津化学试剂一厂;六堡茶香气化合物标准品(纯度≥95%),上海思域化工科技有限公司;内标物(正癸醇,≥99.5%),上海腾准生物科技有限公司;C8～C32连续正构烷烃溶液(500 mg/L,溶解剂为氯仿),美国AccuStandard公司,用于气味化合物保留指数的计算。
1.2 仪器与设备
7890B-5977A气相色谱-质谱联用仪、HP-5MS石英毛细管色谱柱(30 m×0.25 mm,0.25 μm),美国Agilent公司;OPD Ⅲ嗅闻仪,哲斯泰(上海)贸易有限公司;固相微萃取装置和固相微萃取头(65 μm PDMS/DVB),美国Supelco公司;IT-09A恒温磁力搅拌器,上海一恒科学仪器有限公司;YP1200电子天平,上海精科电子有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 HS-SPME程序
槟榔香六堡茶挥发性香气物质采用HS-SPME配置65 μm PDMS/DVB萃取头进行富集,富集条件参考先前的报道[14-15],详情如下:精确称取1.0 g六堡茶样品、2.0 g氯化钠放置20 mL顶空瓶中,加入转子、50 μL内标物(66.5 μg/mL)和5.0 mL煮沸超纯水,迅速拧紧瓶盖。将顶空瓶放置于60 ℃恒温水浴杯中,平衡5 min,插入HS-SPME萃取头,恒速搅拌吸附60 min,然后迅速将HS-SPME萃取头插入气相色谱进样口,解析附4 min,同时启动仪器数据采集。
1.3.2 仪器条件
仪器条件参考先前的研究[13]。GC-O条件是安捷伦GC(7890B)配置氢火焰离子化检测器(flame ionization detector, FID)和嗅闻仪,安捷伦HP-5MS石英毛细管色谱柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)用于挥发性物质的分离。升温程序:初始温度40 ℃(保持5 min),以3 ℃/min升至180 ℃,然后以10 ℃/min升高到250 ℃,保持5 min;GC进样口温度、进样模式和载气(He>99.999%)流速分别为250 ℃、不分流模式和1.0 mL/min。嗅闻仪条件:空气流量为60 mL/min,传输线温度为250 ℃。色谱柱流出成分在毛细管末端以1∶1的分流模式分别进入检测器和嗅闻仪。
GC-MS条件:色谱柱型号、升温程序、GC进样口温度、进样模式和载气流速均与GC-O分析相同,进样方式为自动进样。质谱条件为EI源,电子能量70 eV;接口温度为280 ℃;离子源温度为230 ℃;四极杆温度为150 ℃;发射电流为34.6 A;扫描方式:全扫描;质量扫描范围:35～450 aum;溶剂延迟时间:3.0 min。挥发性香气化合物的鉴定是基于NIST 17数据库的匹配、化合物保留指数(保留指数是C8～C32连续正构烷烃相同色谱条件下分析后计算所得)和香气化合物标准品。
1.3.3 嗅闻分析
嗅闻分析由4名(1名男士和3名女士)具有2年以上茶叶感官审评经验的茶叶研究人员组成,平均年龄28岁。4名嗅闻分析人员来自于湖南农业大学和云南天士力帝泊洱生物茶集团有限公司,无抽烟史,且要求实验期间不允许使用化妆品。嗅闻分析时要求每位人员记录嗅闻到的气味和气味强度。其中气味强度采用数字进行量化,其中0、1、5、9分别代表未嗅闻到气味、气味强度微弱、气味强度中等和气味强度高。实验过程中至少有2名人员在同一保留时间处嗅闻到相同的气味为有效结果,最终每个化合物的气味强度为4名人员嗅闻到的气味强度的平均值。
1.4 数据处理
采用气味化合物标准品峰面积/内标物的峰面积为纵坐标(y),以气味化合物标准品浓度/内标物浓度为横坐标(x)建立每种气味化合物标准曲线,对每种气味化合物进行定量分析。在气味化合物定量分析的基础上,参考GB/T 23776—2018《茶叶感官审评方法》中的黑茶审评方法,3 g茶样,茶水比1∶50(g∶mL)计算每种气味化合物的浓度,结合已报道每种气味化合物在水中的阈值(https://www.vcf-online.nl/VcfHome.cfm),计算气味活力值(OAV=化合物浓度/化合物阈值)。使用MS Excel 2010(Microsoft,USA)对数据进行处理和统计分析。
2 结果与分析
2.1 六堡茶气味化合物鉴定
采用GC-O和GC-MS对槟榔香六堡茶进行分析,经数据库比对、保留指数和化合物气味,从槟榔香六堡茶中嗅闻、鉴定出37种呈现气味的化合物(表1)。气味强度(odor intensity, OI)中等以上的化合物有19种,其中酮类化合物气味强度相对较高,二氢-β-紫罗兰酮和β-紫罗兰酮气味强度最高,均为9(气味强度高),其次为脱氢二氢-β-紫罗兰酮(OI=7.57)、α-紫罗兰酮(OI=7.38)和(Z)-茉莉酮(OI=5.24)。二氢-β-紫罗兰酮、β-紫罗兰酮、脱氢二氢-β-紫罗兰酮和α-紫罗兰酮均为类胡萝卜素衍生出的芳香化合物,呈现出“木质”气味,曾被鉴定存在于各类茶叶中,对茶叶特征香气的形成起关键作用[16]。(Z)-茉莉酮呈现“茉莉花”气味,曾被报道是Chin Shin乌龙茶和四季茶的关键香气化合物,相对含量高达7.00%～12.15%[17];醇类化合物气味强度较高的化合物为β-芳樟醇和雪松醇,气味强度分别为8.63和8.38,其次为香叶醇(OI=7.37)、苯乙醇(OI=7.09)、橙花醇(OI=6.54)和1-辛烯-3-醇(OI=6.24)。β-芳樟醇呈现令人愉悦的“花香”气味,不仅被鉴定是各类茶叶特征香气形成的关键化合物,也被鉴定是花卉和香料植物特征香气形成的关键化合物[18-19];雪松醇呈现“木质”气味,曾被鉴定是普洱茶特征香气形成的主要香气化合物,在六堡茶中也具有较高的含量,被认为是六堡茶特征香气形成的关键化合物[11,20]。香叶醇、苯乙醇和橙花醇呈现令人愉悦的“花香”气味,曾被鉴定对红茶和普洱晒红茶特征香气的形成起关键作用[21-22]。1-辛烯-3-醇呈现“蘑菇”气味,该物质来源于亚油酸的氧化降解,被鉴定是蘑菇风味形成的关键香气物质[23],该物质也被鉴定是普洱茶特征香气形成的主要香气物质[24]。甲氧基苯类化合物气味强度较高的为1,2,3-三甲氧基苯(OI=8.07),其次为4-乙基-1,2-二甲氧基苯(OI=6.19)、1,2,3,4-四甲氧基苯(OI=6.17)、3,4-二甲氧基甲苯(OI=5.09)和1,2,4-三甲氧基苯(OI=5.05)。甲氧基苯类化合物呈现特殊的“陈香”气味,被认为是在发酵过程中微生物降解和甲基化儿茶素形成的一类物质,同时在茶叶堆积发酵中的热降解也有助于甲氧基苯类化合物的形成,这类化合物是六堡茶、普洱茶等后发酵茶类特征风味形成的关键香气物质[13,25]。醛类化合物气味强度相对较高的化合物为(E,Z)-2,6-壬二烯醛(OI=6.83)和癸醛(OI=6.42)。(E,Z)-2,6-壬二烯醛呈现“黄瓜”气味,曾被鉴定存在于普洱茶和红茶中[26-27];癸醛呈现“脂肪”和“柑橘”的气味,曾被鉴定是普洱茶的香气化合物之一[28]。
表1 六堡茶气味化合物GC-O分析结果
Table 1 The results of odor compounds in Liupao tea by GC-O analysis
保留时间/min保留指数化合物气味描述香气强度10.279761-辛烯-3-醇泥土,青草芳香6.24±1.5410.649886-甲基-5-庚烯-2-酮果香3.07±1.0911.611 011(E,E)-2,4-庚二烯醛脂香,青草香2.15±1.4712.461 0312-乙基-1-已醇柑橘类气味2.93±0.8713.741 061(E)-2-辛烯醛脂香,青草香4.04±1.0514.381 076(Z)-芳樟醇氧化物花香3.17±0.6915.111 093(E)-芳樟醇氧化物花香3.09±0.8715.301 097(E,E)-3,5-辛二烯-2-酮青草香2.17±0.5215.671 108β-芳樟醇花香8.63±2.9415.851 112壬醛脂香,青草香4.67±2.1716.201 119苯乙醇花香7.09±2.9916.491 125异佛尔酮青草香,果香3.58±0.7317.841 1541,2-二甲氧基苯陈香4.02±1.0818.111 159(E,Z)-2,6-壬二烯醛类似黄瓜的气味6.83±3.0218.411 166(E)-2-壬烯醛青草香4.36±1.5518.721 1731,3-二甲氧基苯陈香3.38±1.3719.061 180芳樟醇氧化物III木香2.63±0.9119.791 195α-萜品醇木香2.39±0.9420.191 204藏红花醛木香1.07±0.5820.561 211癸醛脂香,类似柑橘的气味6.42±2.3321.151 222β-环柠檬醛果香4.93±2.0921.551 229橙花醇花香6.54±1.9822.071 2393,4-二甲氧基甲苯陈香5.09±2.1722.751 252香叶醇花香7.37±3.2925.401 3041,2,3-三甲氧基苯陈香8.07±3.3725.811 3154-乙基-1,2-二甲氧基苯陈香6.19±2.0527.881 3681,2,4-三甲氧基苯陈香5.05±1.0928.261 378脱氢二氢-β-紫罗兰酮木香7.57±2.7428.971 396(Z)-茉莉酮茉莉花香5.24±2.2729.291 4041,2,3-三甲氧基-5-甲基苯陈香4.06±1.4730.191 427α-紫罗兰酮花香7.38±2.1930.641 438二氢-β-紫罗兰酮木香9.00±0.0031.061 4491,2,3,4-四甲氧基苯陈香6.17±1.5731.261 454香叶基丙酮花香3.27±1.0932.581 488β-紫罗兰酮花香9.00±0.0034.221 535二氢猕猴桃内酯木香2.04±0.8337.101 607雪松醇木香8.38±2.97
2.2 槟榔香六堡茶香气物质定量分析和OAV计算
通过GC-O分析,确定了槟榔香六堡茶中呈现气味的化合物,为了进一步评价气味化合物对槟榔香六堡茶整体香气形成的贡献度,对每种气味化合物进行定量分析,定量结果如表2所示。槟榔香六堡茶中含量较高的化合物为β-紫罗兰酮(84 996.78 μg/kg)、二氢-β-紫罗兰酮(54 637.50 μg/kg)、苯乙醇(13 582.16 μg/kg)、脱氢二氢-β-紫罗兰酮(6 872.67 μg/kg)、β-芳樟醇(4 424.37 μg/kg)、1,2,3-三甲氧基苯(1 931.23 μg/kg)、(E,Z)-2,6-壬二烯醛(726.83 μg/kg)、香叶醇(578.05 μg/kg)、癸醛(487.47 μg/kg)、4-乙基-1,2-二甲氧基苯(409.14 μg/kg)、1,2,3,4-四甲氧基苯(291.87 μg/kg)、3,4-二甲氧基甲苯(276.10 μg/kg)、1,2,3-三甲氧基-5-甲基苯(214.86 μg/kg)、(E)-2-壬烯醛(193.40 μg/kg)、α-紫罗兰酮(193.29 μg/kg)、雪松醇(165.83 μg/kg)、橙花醇(103.81 μg/kg)和1,2-二甲氧基苯(101.69 μg/kg)。
表2 六堡茶香气物质定量分析和OAV计算结果
Table 2 The results of quantitative analysis and OAVs calculation of aroma-active compounds in Liupao tea
保留时间/min保留指数化合物定量结果/(μg/kg)感官审评浓度/(μg/kg)(3 g茶加150 mL水)阈值/(μg/L)OAV10.27976 1-辛烯-3-醇70.26±35.451.4111.4110.64988 6-甲基-5-庚烯-2-酮0.39±0.230.0150<0.111.611 011(E,E)-2,4-庚二烯醛0.88±0.260.0256<0.112.461 0312-乙基-1-已醇0.10±0.070.002198<0.113.741 061(E)-2-辛烯醛11.76±4.370.233<0.114.381 076(Z)-芳樟醇氧化物3.95±1.290.08100<0.115.111 093(E)-芳樟醇氧化物7.05±3.380.1460<0.115.301 097(E,E)-3,5-辛二烯-2-酮0.21±0.130.004100<0.115.671 108β-芳樟醇4 424.37±3 170.0788.490.4221.2215.851 112壬醛72.58±29.571.4511.4516.201 119苯乙醇13 582.16±8 485.06271.640.01518 109.5516.491 125异佛尔酮3.48±3.070.0711<0.117.841 1541,2-二甲氧基苯101.69±38.942.033.170.6418.111 159(E,Z)- 2,6-壬二烯醛726.83±353.5314.540.03484.5518.411 166(E)-2-壬烯醛193.40±56.793.870.138.6818.721 1731,3-二甲氧基苯2.23±1.040.04100<0.119.061 180芳樟醇氧化物III0.15±0.070.0033 000<0.119.791 195α-萜品醇1.20±0.450.02330<0.120.191 204藏红花醛0.01±0.010.000 21 000<0.120.561 211癸醛487.47±176.269.740.197.4921.151 222β-环柠檬醛43.68±13.140.8730.2921.551 229橙花醇103.81±46.912.081.11.8922.071 2393,4-二甲氧基甲苯276.10±110.815.522.712.0422.751 252香叶醇578.05±461.4111.561.110.5125.401 3041,2,3-三甲氧基苯1 931.23±1 478.5438.620.7551.4925.811 3154-乙基-1,2-二甲氧基苯409.14±267.868.1833.42.4127.881 3681,2,4-三甲氧基苯56.99±32.871.143.060.3728.261 378脱氢二氢-β-紫罗兰酮6 872.67±6 288.03137.450.091 527.2628.971 396(Z)-茉莉酮16.27±16.210.327<0.129.291 4041,2,3-三甲氧基-5-甲基苯214.86±185.764.304.450.9630.191 427α-紫罗兰酮193.29±35.833.870.66.4430.641 438二氢-β-紫罗兰酮54 637.50±23 190.241 092.750.0011 092 750.0031.061 4491,2,3,4-四甲氧基苯291.87±155.265.840.649.1231.261 454香叶基丙酮1.43±0.420.0360<0.132.581 488β-紫罗兰酮84 996.78±31 683.861 699.940.007242 847.9434.221 535二氢猕猴桃内酯2.37±0.320.05500<0.137.101 607雪松醇165.83±70.003.320.56.63
目前食品领域中已经发现万余种气味成分,然而仅有一小部分会对食品整体香气的形成起着关键决定作用,这一部分气味成分称为关键香气成分[29]。风味化学研究者认为,OAV≥1的气味化合物通常被认为对分析样品整体香气的构成其贡献作用,OAV<1的气味化合物被认为对分析样品整体香气的形成无贡献作用或起较小的贡献作用[30-31]。可见,气味化合物含量的高低并不能完全代表其对六堡茶槟榔香贡献度的大小,需要结合GC-O-MS鉴定结果和OAV作进一步判断。为了进一步筛选对槟榔香六堡茶整体香气形成起主要贡献作用的气味化合物,在气味化合物定量的基础上,结合已报道气味化合物在水溶液中的阈值计算OAV,结果见表2。
为准确研究六堡茶槟榔香的特点,以OAV≥1为标准共筛选出18种关键气味物质,分别为:1-辛烯-3-醇、(E)-2-壬烯醛、(E,Z)-2,6-壬二烯醛、癸醛、壬醛、β-芳樟醇、苯乙醇、橙花醇、香叶醇、β-紫罗兰酮、α-紫罗兰酮、雪松醇、二氢-β-紫罗兰酮、脱氢二氢-β-紫罗兰酮、3,4-二甲氧基苯、1,2,3-三甲氧基苯、4-乙基-1,2-二甲氧基苯及1,2,3,4-四甲氧基苯,这些化合物对槟榔香六堡茶整体风味的形成起关键作用。其中,β-芳樟醇、苯乙醇、橙花醇、香叶醇、β-紫罗兰酮和α-紫罗兰酮贡献了花香;(E,Z)-2,6-壬二烯醛具有类似黄瓜的气味,贡献了清香;壬醛和癸醛贡献了脂香;1-辛烯-3-醇和(E)-2-壬烯醛贡献了青草香;雪松醇、二氢-β-紫罗兰酮和脱氢二氢-β-紫罗兰酮贡献了木香;3,4-二甲氧基苯、1,2,3-三甲氧基苯、4-乙基-1,2-二甲氧基苯和1,2,3,4-四甲氧基苯贡献了陈香。其中,二氢-β-紫罗兰酮(OAV=1 092 750)、β-紫罗兰酮(OAV=242 847.94)、苯乙醇(OAV=18 109.55)、脱氢二氢-β-紫罗兰酮(OAV=1 527.26)、(E,Z)-2,6-壬二烯醛(OAV=484.55)、β-芳樟醇(OAV=221.22)、癸醛(OAV=97.49)和1,2,3-三甲氧基苯(OAV=51.49)的OAV≥50,特别是二氢-β-紫罗兰酮(0.001 μg/L)、β-紫罗兰酮(0.007 μg/L)和苯乙醇(0.015 μg/L)有极低的阈值,OAV显著高于其他气味化合物,这些气味化合物对于六堡茶槟榔香的形成具有重要的贡献作用。六堡茶良好的仓储环境对这些关键香气物质的转化、协调比例的形成及槟榔香的呈现起着决定性的作用[32]。通过对比OAV结果和GC-O分析结果,癸醛和(E)-2-壬烯醛具有较大的OAV,但GC-O分析香气强度均小于5,这可能是物质间的相互作用导致。总体来说,2种方法所筛选槟榔香六堡茶关键香气物质的分析结果基本保持一致。
3 结论
本研究采用HS-SPME结合GC-O-MS和OAV对槟榔香六堡茶香气物质进行分析和关键香气物质筛选。经GC-O分析,从槟榔香六堡茶共嗅闻、鉴定出37种呈现气味的化合物,其中气味强度中等以上的化合物为19种,主要为酮类、醇类、甲氧基苯类和醛类,其中香气强度较高的化合物为二氢-β-紫罗兰酮、β-紫罗兰酮、β-芳樟醇、雪松醇和1,2,3-三甲氧基苯。在GC-O分析的基础上,结合气味化合物定量结合和气味化合物阈值计算化合物OAV,槟榔香六堡茶中OAV≥1的气味化合物有18种,其中二氢-β-紫罗兰酮、β-紫罗兰酮、苯乙醇、脱氢二氢-β-紫罗兰酮、(E,Z)-2,6-壬二烯醛、癸醛、β-芳樟醇和1,2,3-三甲氧基苯的OAV≥50,可以说明这些物质对槟榔香六堡茶整体香气形成贡献度较大。对比GC-O分析和OAV计算结果,2种方法所筛选槟榔香六堡茶关键香气物质的分析结果基本一致,该研究结果对于六堡茶陈化过程中“槟榔香”的形成提供理论依据以及对于定向加工“槟榔香”六堡茶具有指导意义。
然而,通过GC-O-MS分析和OAV计算仍然无法准确解析槟榔香六堡茶中的关键香气成分,在后续实验中还需要通过香气重组及遗漏实验等进行关键香气成分的验证分析。此外,在2种分析方法中关键香气物质存在一定的差异,这可能与化合物较高的阈值以及香气化合物之间的相互作用等因素有关。值得注意的是,单个气味化合物对槟榔香六堡茶香气品质的贡献不仅取决于其在茶叶中的含量,基质成分也会影响气味化合物的释放。因此,在后续研究中,还需要进一步针对基质成分、低OAV化合物对槟榔香六堡茶香气品质的影响展开相关研究。
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