肉营养价值高、风味独特,在世界各地被消费和喜欢。但是,肉在贮藏和销售的过程中,会受到贮存环境和运输温度等不良环境的影响,发生腐败变质。根据联合国粮食及农业组织的调查,每年食物浪费或损失的数量为13亿t,约占世界人类可食用食品总量的三分之一[1]。因此食物浪费是一个急需解决的问题。肉制品在准备、加工和分销过程中,腐败已经对肉类工业造成了负面的经济影响[2]。家庭肉类浪费也是肉类浪费的重要组成部分,肉类浪费成为了一个全球性问题[3]。
智能包装方法通常用于附加或加入标签或标记,以监测被包装食品或食品周围环境的状况(如温度、pH值、水分含量、气体成分和腐败代谢物)[4]。肉在腐败过程中微生物产生的代谢物(如有机酸、胺、氯化氢、含硫化合物、二氧化碳等),会改变肉包装环境的pH值,而pH值是食品新鲜度和状态的主要指标[4-6]。因此,pH响应指示膜通过视觉颜色变化提供特定信息,成为一种方便、准确的无损检测新鲜度的方法[7]。如今,合成染料和天然色素已被用于制作各种pH比色膜[6,8]。合成染料(溴百里酚蓝、溴甲酚绿、溴甲酚紫、甲基红、甲酚红、氯酚以及二甲苯、间甲酚紫等)对人体健康有潜在的影响,不易用于食品包装[4,9-10]。因此,具有生态友好性、色域宽广、功耗较低、对食品和环境的毒性较小的植物基天然色素被认为是最佳选择[11]。
静电纺丝作为制备连续纳米纤维的一种有效且通用的方法,已被用作制造食品包装材料的候选者。YILDIZ等[9]以姜黄素、壳聚糖(chitosan, CS)和聚环氧乙烷(polyethylene oxide, PEO)为原料,制备了电纺纳米纤维变色pH传感器膜,用于鸡肉新鲜度的监测。首先分贝制备PEO原液、壳聚糖溶液;姜黄素溶液。PEO与壳聚糖溶液混合后,加入姜黄素溶液,制备的混合溶液通过静电纺丝工艺收集成纳米纤维膜。该纳米纤维膜应用在4 ℃鸡肉的新鲜度检测上。实验结果表明姜黄素负载纳米纤维膜的颜色变化(明黄色-淡红色)和鸡肉pH值、总挥发性盐基氮(total volatile basic nitrogen, TVB-N)值随时间变化密切相关。HAN等[12]以聚乙烯醇-银纳米胶体为载体聚合物,以葡萄籽花青素为指标,开发了一种用于肉类新鲜度评价的智能传感标签。首先将银纳米颗粒包埋在聚乙烯醇中制备聚乙烯醇-银纳米胶体中,将纳米胶体与葡萄籽花青素混合通过静电纺丝技术制备成纳米纤维膜。新鲜度智能传感标签在4 ℃下监测猪肉的新鲜度,随着贮藏时间的延长猪肉腐败,传感标签颜色也发生了变化(新鲜-浅粉色;次新鲜-棕红色;腐败-深灰色)。
花青素是广泛存在于自然界的酚类化合物,其稳定性容易受到环境因素(pH值、温度、光线、氧气等)的影响[13]。SHAVISI等[14]以壳聚糖和阿拉伯胶为基材,提取玫瑰的花青素为指示材料,利用静电纺丝技术制备纳米纤维垫,纳米纤维垫在pH值为1～12缓冲溶液中颜色从淡粉色变为棕色。这些一维纳米纤维由于其大的比表面积而表现出高的响应性,但具有多孔结构的二维纳米纤维更敏感,因为它们充分暴露了响应材料,提供了更多的活性位点[15]。此外,多孔材料也有很多优点,如质量高、易于功能化、化学变化大、节省材料等[16]。近年来,多孔纳米纤维已被应用于许多领域,包括催化、传感器、电极材料、吸附、储能、过滤和净化。因此,多孔纳米纤维必将在肉类新鲜度检测中显示出其优势和潜力,这将是一种理想的具有高灵敏度的新型无损检测材料。
静电纺丝,是一种利用静电力将聚合物拉伸成连续纤维的纤维成型技术。该工艺导致连续纤维被铺成具有极大比表面积的非织造布,赋予它们独特的性能,如增强的表面活性、增加的表面附着官能团的能力、高孔隙率、较好的柔韧性等。聚乳酸是从玉米、小麦和秸秆等可再生资源中提取的乳酸衍生物,是完全可生物降解的材料,可降解成二氧化碳和水。近年来,聚乳酸受到了广泛的关注,因为它具有相对较高的强度、优异的生物降解性和良好的生物相容性。因此,在本研究中,使用静电纺丝技术制备了多孔的聚乳酸纳米纤维,然后吸附花青素来制备多孔颜色指示膜,用于无损检测肉类的新鲜程度。然后对其结构、氨响应性、可重复使用性,以分析多孔颜色指示膜在实际应用中的潜力。结果表明,所制备的多孔颜色指示膜能够准确、快速地对羊肉中释放的生物胺做出颜色响应。因此,它可以作为一种非接触式肉眼识别多孔颜色指示膜,用于肉类新鲜度监测。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
实验用羊肉为鲜羊肉,呼和浩特市东瓦窑市场;聚乳酸(poly-L-lactic acid,PLLA,Mw=100 000);蓝莓花青素,上海源叶生物科技有限公司;二氯甲烷(dichloromethane, DCM);N,N-二甲基甲酰胺(N,N-dimethylformamide, DMF);氨水(体积分数为30%);浓盐酸;碳酸氢钠(NaHCO3)。
1.2 仪器与设备
TL-F6静电纺丝机,深圳通力微纳科技有限公司;MYP11-2A磁力搅拌器,上海梅颖浦仪器仪表制造有限公司;CR-20色差仪,日本柯尼卡美能达有限公司;TM 4000 Plus扫描电子显微镜,日本株式会社日立高新技术科学;IRSpirit-T 傅里叶变换红外光谱仪,日本岛津公司;FOSS半自动凯氏定氮仪,丹麦福斯集团公司。
1.3 实验方法
1.3.1 颜色指示膜的制备
将聚乳酸溶解在DCM中,连续搅拌直至溶液透明均匀,制备聚乳酸溶液。再加入DMF搅拌30 min,最后加入碳酸氢钠搅拌30 min,制备静电纺丝溶液。PLLA为12%(质量分数),DCM和DMF体积比为9∶1。
多孔颜色指示膜通过静电纺丝机制备。将上述制备的静电纺丝溶液装入注射器(容积为20 mL)。然后将注射器固定在静电纺丝机上。用铝箔收集纳米纤维丝。收集器与针尖之间的距离为15 cm。静电纺丝溶液进给量为1 mL/h、滚筒转速为150 r/min、电压为20 kV。湿度分别为20%～30%、50%～60%。将制备好的聚乳酸纳米纤维膜完全浸泡在1%花青素溶液(pH=2的缓冲溶液)中24 h。取出后室温干燥过夜。分别命名为PLLA/花青素/20-30、PLLA/花青素/50-60和PLLA/花青素/NaHCO3/50-60。未经花青素溶液浸泡的膜命名为PLLA/20-30、PLLA/50-60和PLLA/NaHCO3/50-60。
1.3.2 颜色指示膜的表征
1.3.2.1 微观结构
利用扫描电子显微镜(scanning electron microscope, SEM)观察了多孔颜色指示膜的微观结构。对多孔颜色指示膜进行喷金,以便于观察。纤维直径分布采用Image Pro-Plus 6.0测量,在扫描电镜图像中随机选择50个点。
1.3.2.2 傅里叶变换红外(Fourier transform infrared, FTIR)光谱
花青素粉末、PLLA/20-30、PLLA/50-60和PLLA/NaHCO3/50-60和PLLA/花青素/NaHCO3/50-60通过FTIR光谱进行分析。光谱采集波幅为500～4 000 cm-1。每个样品的光谱是通过3次扫描的平均值得到,分辨率为4 cm-1。
1.3.2.3 氨响应性
将2 cm×2 cm的PLLA/花青素/NaHCO3/50-60多孔颜色指示膜,置于含有15 mL氨水溶液的密封玻璃培养皿的顶空。玻璃培养皿中氨水的浓度分别为0.001、0.010、0.050、0.100、0.250、0.350、0.500 mg/mL。反应在25 ℃下进行5 min,反应后多孔颜色指示膜的颜色变化值通过色差仪测量。每个样品重复测量3次,颜色变化的计算如公式(1)所示:
(1)
1.3.2.4 可重复使用性
将2 cm×2 cm的PLLA/花青素/NaHCO3/50-60多孔颜色指示膜置于浓氨水和浓盐酸环境中,顶空熏制30 s,使用色差仪测量颜色变化。多孔颜色指示膜在浓氨水和浓盐酸轮流熏制,重复5个循环。根据公式(1)计算ΔE。
1.3.2.5 多孔颜色指示膜在羊肉新鲜度检测中的应用
PLLA/花青素/NaHCO3/50-60多孔颜色指示膜应用于25 ℃贮藏期间监测羊肉的新鲜度。在无菌环境下,将羊肉在紫外线下照射30 min,去除表面杂菌。接下来,剔除肉中的脂肪和结缔组织。称取(10±0.5) g羊肉放入玻璃培养皿中(直径=9 cm),将2 cm×2 cm多孔颜色指示膜贴于保鲜膜上,包封在玻璃培养皿顶空,不与羊肉直接接触。将样品放在贮藏在(25±1) ℃下,间隔24 h使用色差仪测量多孔颜色指示膜的颜色变化。根据GB 5009.228—2016《食品安全国家标准 食品中挥发性盐基氮的测定》测定羊肉的总挥发性盐基氮值。
2 结果与分析
2.1 扫描电镜图分析
图1为多孔颜色指示膜的微观结构和直径分布图。由图1-a和图1-d中可以观察到,PLLA/花青素/20-30的纤维直径分布在400～1 700 nm,平均直径为1 093.27 nm。纤维粗细均匀,纤维表面可以观察到有大小不均匀的孔。由图1-b和图1-e中PLLA/花青素/50-60的纤维形态和直径分布可知,纤维的直径分布在600～2 600 nm直径,平均直径为1 410.60 nm。纤维粗细不均匀,纤维表明的孔比湿度20%～30%的孔大。观察到PLLA/花青素/NaHCO3/50-60的纤维形态和直径分布(图1-c,图1-f),纤维的粗细均匀,纤维表面出现更多的孔,且孔大小均匀。这是因为碳酸氢钠均匀分布在溶液中,在一定的湿度下反应生成二氧化碳和水,从而产生的孔大小均匀。纤维直径分布在200～1 600 nm,平均直径为632.48 nm。随着湿度的增加,纤维表面的孔也增大,加入碳酸氢钠后产生大小均匀的孔。综上,PLLA/花青素/NaHCO3/50-60的纤维表面的孔比未加碳酸氢钠的孔大小更均匀。PLLA/花青素/NaHCO3/50-60的纳米纤维直径较细,具有较大的比表面积。纤维表面均匀的孔更有利于与气体的接触,从而提高了新鲜度检测的灵敏度。
a-PLLA/花青素/20-30的纤维形态;b-PLLA/花青素/50-60的纤维形态;c-PLLA/花青素/NaHCO3/50-60的纤维形态; d-PLLA/花青素/20-30的纤维直径;e-PLLA/花青素/50-60的纤维直径;f-PLLA/花青素/NaHCO3/50-60的纤维直径
图1 多孔颜色指示膜纳米纤维形态和纤维直径
Fig.1 Porous color indicator membrane nanofiber morphology and fiber diameter
2.2 FTIR分析
使用FTIR光谱在4 000～500 cm-1评估了聚乳酸和花青素之间的化学结构。图2中,PLLA/20-30、PLLA/50-60和PLLA/NaHCO3/50-60的光谱中,在1 756 cm-1附近观察到的吸收峰是由—C
O的弯曲振动引起的[17]。在1 452 cm-1附近的吸收峰是由—CH3的弯曲振动引起。在1 361 cm-1附近的吸收峰是由—C—H的弯曲振动。此外,1 180、1 085 cm-1附近的吸收峰,是由于不同基团和原子的—C—O—C—键的多模式分布[18]。在PLLA/花青素/NaHCO3/50-60的光谱中,在1 021、1 629 cm-1处的吸收振动峰归因于芳香环中C—H和CC的伸缩振动[19]。综上所述,PLLA/花青素/NaHCO3/50-60中的化学键与聚乳酸相同,没有产生新的化学键。
a-花青素;b-PLLA/20-30;c-PLLA/50-60;d-PLLA/NaHCO3/50-60; e-PLLA/花青素/NaHCO3/50-60
图2 多孔颜色指示膜的FTIR
Fig.2 FTIR of porous color indicator membrane
2.3 氨响应性分析
肉品变质过程中产生的生物胺是衡量肉品品质的重要指标。因此,为了测定多孔颜色指示膜对氨气的检测能力,使用不同浓度的氨溶液模拟肉品变质过程中环境的变化。如图3所示,多孔颜色指示膜暴露在1～500 mg/mL氨溶液中时,随着氨溶液浓度的增加,多孔颜色指示膜的ΔE值也在增加。ΔE>3,颜色变化肉眼可见[20]。多孔颜色指示膜的颜色由紫红色逐渐变为浅棕色,表明多孔颜色指示膜会随着氨溶液浓度的增加膜的颜色也会发生变化。花青素中的黄酮离子是花青素显色的重要基团,对pH具有高度的敏感性。其结构会根据不同pH的溶液进行转变。pH<3,黄酮离子会使花青素溶液变成红色、紫色;pH 4～5,黄酮离子转化成为甲醇假碱。呈现无色、淡粉色;pH 6～7,以醌基形式存在;pH 7～8形成阴离子醌基,呈现出蓝色;pH>8,形成查尔酮结构,显示成深褐色[21]。因此,该结果表明多孔颜色指示膜可以对氨溶液进行快速颜色响应。
a-多孔颜色指示膜的ΔE;b-多孔颜色指示膜的颜色变化
图3 多孔颜色指示膜在不同浓度氨溶液中的ΔE和颜色变化
Fig.3 ΔE and color change of porous color indicator membrane in different concentration of ammonia solution
2.4 可重复使用性分析
通过在酸性环境和碱性环境下检测多孔颜色指示膜的可逆颜色变化,如图4所示。经过5个酸性和碱性环境循环后多孔颜色指示膜可以快速进行颜色响应。在酸性存在下,分子式发生消去反应,形成叶黄素阳离子,使多孔颜色指示膜的颜色由无色变为粉红色。在碱性环境下,会发生亲核加成反应,形成半缩酮,半缩酮中吡喃环会打开形成无色的顺式查尔酮结构,颜色指示膜的颜色会从粉红色变为无色。结果表明,多孔颜色指示膜可用于进行快速、实时、准确的生物胺检测,颜色变化肉眼可见。多孔颜色指示膜的颜色变化在酸性和碱性环境下具有可逆的颜色变化,因此多孔颜色指示膜可进行重复使用。
图4 多孔颜色指示膜的可重复使用性
Fig.4 Reusability of porous color indicator membrane
2.5 多孔颜色指示膜在25 ℃贮藏条件下的应用实验
肉类是一种易腐产品,在贮藏过程中,微生物和内源酶的作用导致其化学成分发生变化。根据肉的腐败机理,蛋白质和其他含氮化合物的降解会导致有机胺的积累,这些有机胺通常被称为TVB-N。TVB-N常被用作蛋白质和胺降解的生物标志物[22]。研究者们广泛采用TVB-N来解释肉类新鲜度的程度[23-24]。图5是羊肉在25 ℃下贮藏的总挥发性盐基氮值。在第0 h,羊肉的TVB-N为7.65 mg/100 g,在第48 h的TVB-N为19.00 mg/100 g,超过规定限值。根据国家标准(GB 2707—2016)中规定的,羊肉的TVB-N不得超过15 mg/100 g。TVB-N值超过15 mg/100 g,羊肉失去食用价值。TVB-N在贮藏期间呈上升趋势,这是由于腐败细菌的存在,蛋白质分解,产生胺类物质。贮藏环境中,胺类物质的增加导致pH向碱性方向变化。多孔颜色指示膜的ΔE值随着贮藏时间延长呈增长趋势。多孔颜色指示膜的颜色随着羊肉贮藏时间的延长从0 h的紫红色到48 h变为暗紫色。72 h多孔颜色指示膜中花青素已经反应到了终点。通过ΔE与TVB-N含量的一致性进行分析,在48 h时羊肉的TVB-N达到限值,不可食用。羊肉贮藏48 h,多孔颜色指示膜的颜色也变为暗紫色。实验结果表明,多孔颜色指示膜可以进行25 ℃羊肉贮藏期间的新鲜度检测,会发生从紫红色(新鲜)到暗紫色(腐败)的颜色变化。
图5 25 ℃羊肉贮藏期间多孔颜色指示膜颜色的 ΔE值与TVB-N的关系
Fig.5 ΔE value of porous color indicator membrane color versus TVB-N during storage of mutton at 25 ℃
3 结论
实验制备了聚乳酸/花青素/NaHCO3/50-60多孔颜色指示膜,用于羊肉的新鲜度检测。采用静电纺丝技术在50%～60%的湿度下利用NaHCO3与水的反应,使多孔颜色指示膜的纤维有更多的孔隙,具有更大的比表面积。通过氨响应性和可重复使用性,验证了多孔颜色指示膜对氨浓度的敏感性和具有很好的颜色可逆性,证明了其在实际应用的可行性。对羊肉新鲜度监测的实验结果表明,多孔颜色指示膜在羊肉贮藏过程中颜色变化肉眼可识别,从紫红色变为深灰色。综上所述,聚乳酸/花青素/NaHCO3/50-60多孔颜色指示膜在肉品新鲜度监测中具有很大的应用潜力,对我国食品安全检测技术的研究与开发具有重要意义。
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