蓝莓果实富含花青素、维生素、叶酸、膳食纤维、矿物质等营养物质与功能成分[1],具有提高人体免疫力、改善视力、抗衰老等功效,被联合国粮农组织列为人类五大健康食品之一[2],且蓝莓果肉口感细腻多汁,滋味酸甜适宜,深受消费者地喜爱。截至2020年底,我国蓝莓栽培面积约6.64万公顷,年产量约34.72万t,发展速度较快[3]。但是蓝莓的成熟期在5～8月,此时正值高温多雨季节,加上蓝莓果实皮薄汁多,极易受到机械损伤而被微生物侵染,并且病原菌对蓝莓植株的侵染具有普遍性、长久性[4-5]。在蓝莓采后致病菌的相关研究中,发现经分离、纯化后的主要病害病原菌为灰霉菌,其带菌率可达81.85%[6],被侵染后的蓝莓果实极易腐烂变质,造成极大的经济损失。因此研究抑制蓝莓采后灰霉病生长的保鲜技术,对延长蓝莓货架期具有重要意义。
植物精油是从植物的不同部位(如根、茎、叶、花、果实)提取出的具有特定香气的一类次生产物,一般采用有机溶剂萃取、水蒸气蒸馏、机械挤压、超临界萃取、吸附等方法[7]。大量研究表明植物精油具有抑制微生物、抗氧化、增香调味等作用,应用范围极广,并且与化学试剂相比具有低毒、无残留、副作用小、环保等优点[8]。将不同精油或精油活性成分组合使用可达到协同增效的作用[9],例如将丁香酚与柠檬醛联合使用对腐败菌青霉菌和曲霉菌均具有协同抑制作用,联合应用于面包保鲜可比使用单个柠檬醛精油延长5 d保质期[10]。武延利[11]研究发现将丁香精油、肉桂精油与山苍子精油的主要成分丁香酚、肉桂醛与柠檬醛三者复配使用,对草莓致病菌灰霉菌的生长具有协同抑制作用,联用时的最小抑菌浓度比单用丁香酚时最小抑菌浓度降低75%。
精油虽然具有良好的抑菌性能,但由于气味刺激、稳定性差、易挥发等缺点限制了其在实际生产生活中的应用,而利用微胶囊技术可将液体状态的精油包埋入环糊精、明胶、壳聚糖等壁材中,形成固体状态,从而改善精油缺点,达到持续缓慢释放的目的[12-14]。王冰玉等[15]采用羧甲基壳聚糖包埋柠檬醛精油制备成微胶囊应用于刺嫩芽保鲜,结果表明柠檬醛微胶囊减缓了刺嫩芽营养成分的流失。另有研究报道,将肉桂醛、柠檬香茅、薰衣草精油分别用β-环糊精、蜂蜡、明胶与阿拉伯胶包埋制备成精油微胶囊,通过研究其结构性能及应用,发现这些精油被包埋后稳定性增强、气味减弱并且具有良好缓释性能,可延长西瓜、芒果等水果的贮藏时间[16-18]。
本文采用棋盘法联合抑菌实验筛选出具有协同抑制灰霉菌作用的复合精油,并以此为芯材,β-环糊精为壁材,采用饱和水溶液法制备微胶囊,通过响应面优化法确定复合精油微胶囊的最佳制备条件,对微胶囊的形貌、粒径、抑菌性能、缓释性能等进行了测定,最后评估了复合精油微胶囊对蓝莓采后的保鲜效果,意在开发出一种安全环保、非接触式抑菌型固体缓释保鲜剂。
蓝莓(品种为‘巴尔德温’,成熟度为8～9分)采自合肥徽王蓝莓采摘园;柠檬醛,上海泰坦科技股份有限公司;丁香酚、肉桂醛,北京伊诺凯科技有限公司;香芹酚、百里香酚、芳樟醇、对茴香醛,上海笛柏生物科技有限公司;香叶醇、反式-2-己烯醛,上海毕得医药科技有限公司;壬醛,合肥优谱特生物科技有限公司;马铃薯葡萄糖琼脂(potato dextrose agar,PDA)培养基,南京翼飞雪生物科技有限公司;β-环糊精,上海源叶生物科技有限公司;无水乙醇,西陇科学股份有限公司,以上试剂均为分析纯。
SW-CJ-1D超净工作台,江苏通净净化设备有限公司;DHP-9162电热恒温培养箱,上海一恒科技有限公司;LDZX-75KBS立式高压蒸汽灭菌锅,上海申安医疗器械厂;S-4800扫描电子显微镜,日本日立公司;TA-XTPlus质构分析仪,英国Stable Micro Systems公司;MS2000激光粒度仪,英国马尔文仪器有限公司;85-2数显恒温磁力搅拌器,常州越新仪器制造有限公司;GZX-9146MBE数显鼓风干燥箱,上海博迅实业有限公司医疗设备厂。
1.3.1 精油抑菌率的测定
参照葛达娥[19]的方法并略作修改,采用直径为7 mm的无菌打孔器打取培养7 d的灰霉菌块,置于PDA培养基中央,在培养皿盖上放置一张直径为6 mm且灭过菌的滤纸圆片,再分别将10 μL精油滴加在滤纸片上,以无菌水作为对照。使用封口膜将培养皿密封,于28 ℃培养箱中倒置培养。培养4 d后用游标卡尺(十字交叉法)测定菌丝生长直径,按照公式(1)计算抑菌率。根据抑菌率判定精油对灰霉菌的抑菌活性等级,即抑制率>80%、60%～80%、40%～60%与<40%分别表示强抑制作用、较强抑制作用、中等抑制作用与较弱抑制作用。
(1)
式中:Y,抑菌率,%;R0,初始菌块直径,mm;R1,对照组菌块直径,mm;R2,处理组菌块直径,mm。
1.3.2 精油最小抑菌浓度(minimal inhibitory concentration,MIC)的测定
参照HERRERA等[20]的方法并做修改,采用倍比稀释法测定精油气相扩散下的最小抑菌浓度。用无菌打孔器(直径7 mm)取培养7 d的灰霉菌菌块,接种到PDA培养基中央,将直径为6 mm的无菌滤纸片贴于培养皿皿盖内,分别吸取10 μL不同浓度(二倍稀释法)的精油于滤纸片上,封口膜密封,28 ℃倒置培养4 d后观察灰霉菌生长情况。以灰霉菌完全没有生长的最低精油浓度为精油的MIC,表示为90 mm培养皿单位体积内精油的质量,单位为mg/L。
1.3.3 具有协同抑菌作用的精油筛选方法
参照赵玲丽[21]的方法测定两种精油联合使用时的MIC,根据公式(2)计算不同精油联用的分级抑菌指数(fractional inhibitory concentration,FIC)。
(2)
式中:FIC,分级抑菌指数;MICA0,精油A联用时的最小抑菌浓度,mg/L;MICB0,精油B联用时的最小抑菌浓度,mg/L;MICA,精油A单用时的最小抑菌浓度,mg/L;MICB,精油B单用时的最小抑菌浓度,mg/L。
两种精油相互作用效果判定标准:FIC≤0.5时,两种精油为协同作用;0.5<FIC≤1时,两种精油为相加作用;1<FIC≤2时,两种精油为无关作用;FIC>2时,两种精油为拮抗作用。
1.3.4 复合精油微胶囊的制备及结构性能表征
1.3.4.1 复合精油微胶囊的制备方法
参照YANG等[22]的方法稍作修改,去离子水加热至50 ℃,水中加入适量β-环糊精,于磁力搅拌器上搅拌至完全溶解。吸取1 mL复合精油,溶解于无水乙醇中,用针管逐滴加入β-环糊精水溶液中,密闭搅拌2 h,冷却至室温后,放入4 ℃冰箱沉淀24 h后抽滤,将滤渣于50 ℃烘箱中干燥12 h,即得固态复合精油微胶囊。
1.3.4.2 单因素及响应面试验设计
以复合精油为芯材,以β-环糊精为壁材,壁芯比(g∶mL)分别为2∶1、4∶1、6∶1、8∶1、10∶1,包埋时间分别为1、1.5、2、2.5、3 h,包埋温度分别为30、40、50、60、70 ℃,测定复合精油微胶囊包埋率的大小。
在单因素实验结果的基础上,根据Box-Behnken实验响应面设计原理,选取壁芯比(g∶mL)为6∶1、8∶1、10∶1,包埋温度为40、50、60 ℃,包埋时间为1.5、2、2.5 h作为各因素的取值范围进行响应面试验,优化复合精油微胶囊的制备工艺参数。
1.3.4.3 包埋率测定
复合精油微胶囊的包埋率定义为微胶囊中的精油质量与初始添加精油质量的比值,按照公式(3)计算。
(3)
式中:EE,包埋率,%;m1,包埋后微胶囊中精油质量,mg;m0,包埋前微胶囊中精油质量,mg。
1.3.4.4 微观结构观察
参照赵玲丽[21]的方法,扫描电子显微镜下观察微胶囊与β-环糊精形貌,放大倍数1 500倍。
1.3.4.5 粒径测定
参照林莹[23]的方法取微胶囊适量,加入去离子水搅拌溶解,放入激光粒径分析仪中测量其粒径。
1.3.4.6 释放性能测定
称取若干份复合精油微胶囊平铺于培养皿内,置于冷藏(4 ℃)和常温(20 ℃)条件下,每隔2 d取相同质量的微胶囊测定其中复合精油的质量,根据公式(4)计算复合精油微胶囊累计释放率,每组测定重复3次。
(4)
式中:CR,累计释放率,%;mt,微胶囊第t天复合精油的质量,mg;m0,微胶囊初始复合精油质量,mg。
1.3.4.7 复合精油微胶囊抑菌性能测定
分别称取10、50 mg β-环糊精以及10、20、30、40、50 mg的微胶囊,于超净工作台内紫外杀菌30 min后加入已高温灭菌的PDA培养基中,使其溶解,未凝固前倒入培养皿中。按照1.3.1节步骤测定灰霉菌菌斑直径,并计算抑菌率。
1.3.5 复合精油微胶囊在蓝莓保鲜上的应用
1.3.5.1 蓝莓果实的处理
新鲜蓝莓采后2 h内运回实验室,预冷后选择无病虫害、无机械损伤,并且成熟度、形状、大小均匀的蓝莓果实,将其随机分为2个处理组和1个对照组。2个处理组,分别加入2%与6%(以果实实际质量计)用透气无纺布袋包装的复合精油微胶囊粉末,置于果实底部,对照组不做任何处理。蓝莓分装在无孔包装盒中,每盒果实150 g左右,每组设3个平行,预计6个取样点。前2周(W)在温度为(4±1) ℃冷库中贮藏,每周取样1次,2 W后转模拟货架20 ℃贮藏,隔2 d取样1次。
1.3.5.2 商品率测定
商品率采用计数法测定,目测果实表皮没有明显的霉变、软腐或病斑,具有商品价值的果实即为商品果实,商品率按照公式(6)计算。
(6)
式中:G,商品率,%;C,商品果实数;C0,果实总数。
1.3.5.3 霉菌总数测定
参照GB 4789.15—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验 霉菌和酵母计数》,采用平板计数法计算霉菌总数。
1.3.5.4 硬度测定
将蓝莓果实放置于质构仪的样品台上,将探头对准果实赤道区进行穿刺测定。
1.3.5.5 可溶性固形物、可滴定酸与抗坏血酸含量测定
参照曹建康等[24]的方法测定蓝莓中可溶性固形物、可滴定酸与抗坏血酸含量
1.3.6 数据分析
本研究中指标测定均重复3次,结果用平均值±标准差表示。采用Office软件处理数据,采用SPSS 23.0软件中ANOVA和Duncan多重比较方法进行各组间差异显著性分析(P<0.05),采用Origin 2018软件进行作图。
如表1所示,10种精油在气相扩散方式下,抑制灰霉菌生长的作用差异显著(P<0.05),其中经柠檬醛、香芹酚、百里香酚、壬醛、反式-2-己烯醛、芳樟醇等6种精油处理后,培养基上的灰霉菌生长完全被抑制,菌落直径仍为初始的7 mm,抑制率达到100%。说明这些精油的挥发性成分具有强抑制灰霉菌作用,因此选取这6种精油进行下一步具有协同抑菌作用的精油组合筛选实验。
表1 十种精油对灰霉菌的抑制效果
Table 1 Inhibitory effects of ten essential oils on Botrytis cinerea
精油菌落直径/mm抑制率/%抑菌活性等级柠檬醛7.00±0.00d100.00±0.00c强香芹酚7.00±0.00d100.00±0.00c强百里香酚7.00±0.00d100.00±0.00c强壬醛7.00±0.00d100.00±0.00c强反式-2-己烯醛7.00±0.00d100.00±0.00c强芳樟醇7.00±0.00d100.00±0.00c强丁香酚22.00±0.99c72.78±1.80b较强肉桂醛22.75±0.21c71.42±0.38b较强香叶醇46.80±2.40b27.77±4.36a较弱对茴香醛47.00±2.83b27.40±5.13a较弱无菌水62.05±2.90a--
将上述6种强效精油两两进行复配后共有15种组合,通过测定两种精油联用时的MIC,结合单用时MIC值,计算出二者联用的分级抑菌指数FIC(表2)。结果表明,其中共有9组具有相加作用,4组具有无关作用,具有协同作用的组合有2组,分别是壬醛与反式-2-己烯醛以及壬醛与香芹酚。当具有协同作用的两种精油联合使用时,最小抑菌浓度降低到原来的1/4(壬醛)和1/4(反式-2-己烯醛、香芹酚),即精油联用既可达到相同的抑菌效果,又可减少精油使用量,因此选用这两种组合的精油为芯材,以β-环糊精为壁材制备微胶囊。
表2 精油的最小抑菌浓度和联合抑菌效果
Table 2 Minimum inhibitory concentration of essential oil and combined inhibitory effect
精油单用MIC/(mg/L)联用MIC/(mg/L)ABABABFIC值联合效果柠檬醛百里香酚22.3825.005.6025.001.25无关柠檬醛芳樟醇22.3885.185.6085.181.25无关柠檬醛壬醛22.3840.655.6020.330.75相加柠檬醛反式-2-己烯醛22.3842.5511.1921.131相加柠檬醛香芹酚22.3845.555.6022.780.75相加壬醛反式-2-己烯醛40.6542.5510.1610.640.5协同壬醛香芹酚40.6545.5510.1611.390.5协同壬醛芳樟醇40.6585.1810.1642.590.75相加反式-2-己烯醛香芹酚42.5545.5521.2811.390.75相加反式-2-己烯醛芳樟醇42.5585.1821.2821.300.75相加香芹酚芳樟醇45.5585.1811.3942.590.75相加百里香酚壬醛25.0040.6525.0010.161.25无关百里香酚芳樟醇25.0085.1812.5042.591相加百里香酚反式-2-己烯醛25.0042.556.2542.551.25无关百里香酚香芹酚25.0045.553.1322.780.625相加
单因素试验结果(具体结果见电子版增强出版附图1～图3所示(https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.034229))表明,壬醛与香芹酚复合精油组包埋率在芯壁比与包埋时间两个单因素上优于壬醛与反式-2-己烯醛组,当壁芯比为8∶1、包埋时间为2 h、包埋温度为50 ℃时,壬醛与香芹酚复合精油微胶囊的包埋率分别达到最高,因此选择壬醛与香芹酚复合精油组进行响应面优化实验[具体结果见电子版增强出版附表1～表3、图1所示(https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.034229)]。优化后的壬醛/香芹酚微胶囊最优制备条件为壁芯比8.75∶1(g∶mL),包埋温度50.3 ℃,包埋时间2.0 h,微胶囊包埋率可达78.23%。
a-β-环糊精;b-复合精油微胶囊;c-粒径分布
图1 β-环糊精与复合精油微胶囊的SEM图(×1 500)及粒径分布
Fig.1 SEM pattern of β-cyclodextrin and compound essential oil microcapsule and particle size distribution
表3 复合精油微胶囊及β-环糊精对灰霉菌的抑制效果
Table 3 Inhibition of compound essential oil microcapsules and β-cyclodextrin on Botrytis cinerea
样品菌落直径/mm抑制率/%CK63.00±1.41a/10 mgβ-CD63.50±0.71a050 mgβ-CD65.00±2.83a010 mg微胶囊51.00±2.83b21.60±3.59a20 mg微胶囊45.50±2.12b35.21±6.70b30 mg微胶囊30.00±2.12c57.99±3.36c40 mg微胶囊21.00±2.12d75.15±2.66d50 mg微胶囊16.00±4.95d83.43±6.30d
注:CK为不添加β-环糊精或微胶囊。
2.4.1 扫描电子显微镜图及粒径分布
如图1-a所示,空白微胶囊,即β-环糊精的结构呈不规则的块状或片层状,颗粒大小随机分布且有多处裂纹;与β-环糊精的表观形貌截然不同,复合精油微胶囊(图1-b)呈规则的多层立方晶体结构,大小相对均一且无明显裂纹。扫描电镜下观察到的β-环糊精与复合精油微胶囊在形态与尺寸方面有明显的区别,这表明壬醛与香芹酚复合精油与β-环糊精包合物的形成[25]。由图1-c可看出复合精油微胶囊粒径分布均匀,且分布范围较窄,主要分布在1.0～70.0 μm,平均粒径为16.86 μm。
2.4.2 复合精油微胶囊抑菌性能
如表3所示,β-环糊精对灰霉菌无抑制作用,甚至有利于灰霉菌的生长,这可能是因为β-环糊精属于糖类物质,可作为灰霉菌的营养来源[26];而复合精油微胶囊对灰霉菌具有明显的抑制作用并且随着微胶囊用量的增加,抑制效果显著提高(P<0.05),当复合精油微胶囊添加量为50 mg时,平均抑制率可达83.43%,具有强抑制作用。
2.4.3 复合精油微胶囊缓释性能
在4 ℃与20 ℃开放空间环境下,复合精油微胶囊中的精油随时间延长的释放曲线如图2所示,结果表明,两种环境温度下复合精油微胶囊中精油的释放规律相似,可分为突释、缓释增加、趋于平缓3个阶段[27]。在释放前8 d表现为突释,其累积释放量分别为39.35%与44.09%,在此时间段释放的可能是存在于β-环糊精分子间和微胶囊表面的精油。在8～24 d累积释放量逐渐增加,这是复合精油微胶囊内部的精油在缓慢释放,在第26天时达到最大累积释放量,分别为50.52%和57.78%,随后累积释放量逐渐趋于平稳,可能是因为微胶囊内复合精油已释放完全。复合精油微胶囊随着贮藏时间的增加,缓释速度先增大后逐渐趋于平缓,降低了壬醛与香芹酚的挥发且达到了缓释作用,这与广藿香精油微胶囊中的精油释放规律类似[28]。这种释放规律使得复合精油微胶囊具备长效抗菌作用,尤其前期释放量高,可抑制采后果实初期灰霉菌的快速增殖。
图2 复合精油微胶囊在不同温度下的缓释曲线
Fig.2 Slow-release curves of composite essential oil microcapsules at different temperatures
2.5.1 商品率与霉菌总数
商品率是评价水果保鲜技术最直接、最重要的指标,由图3-a可知,蓝莓的商品率在贮藏期间都呈下降趋势,尤其在4 ℃冷藏两周后转20 ℃货架期开始,各组商品率下降速度加快,但是复合精油微胶囊处理组的商品率显著高于空白对照组(P<0.05)。冷藏2周转20 ℃货架8 d后,空白对照组腐烂速率加剧,商品率仅为60%,而2%和6%微胶囊组商品率分别高达75%和84%,随着贮藏时间延长,组间差距逐渐增大,这说明微胶囊可抑制蓝莓腐烂变质。为验证复合精油微胶囊实际抑菌性能,进一步检测了贮藏期间蓝莓果实霉菌总数(图3-b)。结果表明,冷藏一周后,随着贮藏时间延长对照组蓝莓霉菌总数快速上升,而微胶囊处理组霉菌总数增加较缓慢,且显著(P<0.05)低于对照组,说明微胶囊中释放的精油能抑制霉菌的生长,降低了贮藏期间蓝莓的腐烂率。在贮藏中后期微胶囊使用量越大抑菌效果越好,这与贮藏期间蓝莓的商品率变化趋势结果一致。
a-商品率;b-霉菌总数
图3 不同处理对蓝莓商品率和霉菌总数的影响
Fig.3 Effects of different treatments on commodity rate and total number of molds of blueberry
注:图中横坐标中W和d分别表示周和天,2 W+8 d表示(4±1) ℃冷藏2周后转20 ℃模拟货架8 d(下同)。
2.5.2 硬度、可溶性固形物、可滴定酸与抗坏血酸
蓝莓果实的硬度是耐贮性的重要指标之一,由图4-a可知,在贮藏期间各组蓝莓果实的硬度都持续下降,模拟货架20 ℃条件下相较4 ℃冷藏条件下蓝莓果实硬度下降速率更快。贮藏至22 d后对照组大部分蓝莓出现严重软化现象,硬度仅为初始时的58%,而微胶囊处理组蓝莓硬度下降较缓,6%微胶囊处理组至贮藏结束,硬度较初始仅下降约25%。复合精油微胶囊能维持蓝莓硬度,这可能是微胶囊释放出的精油抑制蓝莓微生物的生长,降低蓝莓果胶物质与纤维素的分解速度,维持蓝莓细胞壁完整性,从而减缓了硬度的下降[29]。
a-硬度;b-可溶性固形物;c-可滴定酸;d-抗坏血酸
图4 不同处理对蓝莓硬度、可溶性固形物、可滴定酸、抗坏血酸的影响
Fig.4 Effects of dfferent treatments on the hardness, soluble solids, titrable acid and ascorbic acid of bueberry
可溶性固形物与可滴定酸含量会影响蓝莓的口感和风味,这两个指标可用来衡量果实营养价值及判断耐贮藏能力。在蓝莓贮藏过程中,可溶性固形物含量呈现先上升后下降的趋势(图4-b),这与YANG[22]等在桃保鲜中可溶性固形物的变化趋势一致,可能是因为在贮藏前期,蓝莓果实中不溶性糖转化成可溶性糖,导致可溶性固形物含量上升,在贮藏后期,由于果实的呼吸代谢作用和微生物的影响,营养物质出现损失而降低可溶性固形物含量[30]。
如图4-c所示,各处理组蓝莓果实中可滴定酸含量在贮藏过程中均呈下降趋势,这可能是因为蓝莓果实中的营养物质糖、酸等作为呼吸作用的底物被逐渐消耗,与空白对照组相比,微胶囊蓝莓组中TA含量下降幅度相对较缓,表明微胶囊处理能减缓蓝莓的新陈代谢,有利于维持果实的品质,延长蓝莓的贮藏保鲜期。
抗坏血酸含量是反应蓝莓果实品质的重要指标,随着贮藏时间的增加,蓝莓果实内营养物质逐渐被消耗,抗坏血酸含量不断下降(图4-d),前期4 ℃条件下降较缓,转货架后,下降速率加大,而且微胶囊处理组与空白对照组差距逐渐加大,差异显著(P<0.05)。结果表明,6%复合精油微胶囊处理可较好保持果实中抗坏血酸含量,在一定程度上维持了蓝莓的营养价值。
本研究通过气相扩散法和棋盘法筛选出两组具有协同抑制灰霉菌作用的精油组合,两种精油联合使用可使MIC降低至单独使用时的1/4。以包埋率为指标,通过单因素与响应面优化实验,确定了具有协同抑菌作用的复合精油微胶囊最佳制备工艺条件。在最优工艺条件下制备的复合精油微胶囊包埋率为78.23%,扫描电镜下微胶囊为规则立方晶体结构,表明β-环糊精成功包封了壬醛与香芹酚。当复合精油微胶囊添加量为50 mg时,对灰霉菌的抑制率可达83.43%;在4 ℃与20 ℃环境温度下,累积最大释放率分别达50.52%和57.78%,具有缓释性能,因此可应用于抑制果实采后真菌的侵染。添加量为2%、6%的复合精油微胶囊对采后蓝莓均具有明显的抑菌效果,当添加量为6%时,显著(P<0.05)减少了蓝莓果实货架期间的霉菌总数,延缓了蓝莓果实硬度、可溶性固形物、可滴定酸、抗坏血酸含量的降低从而显著(P<0.05)提高了蓝莓的商品率。因此,以壬醛与香芹酚复合精油为芯材,β-环糊精为壁材制备成微胶囊,提高了精油稳定性、缓释性,同时掩盖了不愉快的刺激性气味,可以更方便、有效地应用于蓝莓果实的保鲜。本研究为开发新型安全无毒、非接触抑菌型天然固体缓释保鲜剂提供依据,对延长采后蓝莓贮藏保鲜期具有参考意义。
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