耙豌豆是四川的特色酱料,是以豌豆为原料,经高压蒸制或煮制而成的一种调味品,因其软烂绵密、豆香鲜美而深受四川地区人民的喜爱。耙豌豆广泛应用于豆汤饭、豌杂面、豆汤鱼、蹄花汤等传统家庭菜肴中。目前耙豌豆均为传统家庭或小作坊式生产,产品品质良莠不齐,安全性有待提高,另外经简单蒸煮工艺制作的耙豌豆风味不足,并伴有豆腥味[1-2]。安琪酵母(Saccharomyces cerevisiae)发酵性能好,能快速启动发酵反应,广泛应用于面包、酒类等发酵制品[3]。鲁氏酵母(Zygosaccharomuces rouxii)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、假丝酵母(Candida)和毕赤酵母(Pichia)等酵母菌作为发酵过程中重要的功能菌群,在传统发酵豆类食品的发酵过程中起主要增香作用[4]。发酵是食品增香的有效方法,酵母菌作为传统发酵食品的常用微生物,能够产生丰富的蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶和糖分解酶[5]。这些酶通过代谢糖类、蛋白质等大分子物质,形成氨基酸、酸类和醇类等小分子呈味物质,赋予产品特殊发酵香气,丰富产品风味[6]。李志江等[7]用Z. rouxii发酵大豆豆酱,豆酱的感官和理化品质显著提高,豆酱的挥发性香气成分明显增加。庞惟俏等[8]运用Z. rouxii和耐盐表皮葡萄球菌复合发酵的宝泉酱具有较好的发酵风味。
风味是发酵食品的重要品质特征,挥发性风味物质是风味的重要组成成分。电子鼻[9]是模拟人体的嗅觉,利用气体传感器阵列的响应值来识别气味的电子系统,其具有响应时间短、检测快速、测定范围较广、重复性好,能挖掘人鼻不能嗅闻的气体等优点,在食品行业发挥着越来越重要的作用,但电子鼻无法鉴定具体挥发性风味物质[10-11]。而GC-MS是分离、鉴定物质的有效工具。电子鼻和GC-MS在豆酱整体气味轮廓及物质的定性定量领域有广泛应用。庞惟俏等[8]运用电子鼻结合GC-MS区别了3种优势菌种对宝泉酱的香气成分的影响。CHEN等[12]通过GC-MS标记了浏阳豆豉中的关键风味物质。
本研究运用5种常用产香酵母菌(S. cerevisiae、Pichia、Saccharomyces cerevisiae、Zygosaccharomuces rouxii和Candida)对耙豌豆进行固态发酵5 d。通过电子鼻和GC-MS对不同酵母菌发酵的耙豌豆的挥发性风味物质进行分析,并结合主成分分析和偏最小二乘-判别分析(partial least square-discriminant analysis, PLS-DA)模型分析5种酵母菌发酵耙豌豆的香气组成差异,采用变量重要性投影(variable importance in the projection, VIP)确定不同酵母菌发酵耙豌豆中的关键香气物质,旨在为开发发酵型耙豌豆产品提供理论基础。
白豌豆,北京金禾绿源农业科技有限公司;S. cerevisiae,安琪酵母股份有限公司;S. cerevisiae、Z. rouxii,实验室保藏菌株;季也蒙毕赤酵母(Meyerozyma guilliermondii)、近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis),唐红梅等[13]由腌菜中筛选;麦芽汁培养基,广东中山百微生物技术有限公司;马铃薯葡萄糖琼脂(potato dextrose agar, PDA)培养基,北京奥博星生物技术有限责任公司。
SQ680气相色谱-质谱联用仪、Elite-5MS色谱柱(30 m×0.25 mm,0.25 μm),美国珀金埃尔默仪器有限公司;FOX4000电子鼻,法国Alpha MOS公司。
1.3.1 菌种活化
将冻藏于-60 ℃的5株酵母菌株分别接种于已灭菌处理的麦芽汁液体培养基中,摇床培养(30 ℃,170 r/min)24 h。将活化后的酵母菌接种于PDA培养基中30 ℃培养2 d。挑取单菌落于麦芽汁液体培养基中摇床培养(30 ℃,170 r/min)36 h,调整菌种悬液浓度为1.0×108 CFU/mL。
1.3.2 样品的制备
用蒸馏水泡发豌豆12 h,取300 g泡发后的豌豆加入1 000 mL锥形瓶中,按料液比为1∶0.9(g∶mL)加入蒸馏水270 mL。将豌豆进行121 ℃,15 min蒸煮处理,冷却后即为耙豌豆。将5种酵母菌菌悬液以2%接种量分别接种于耙豌豆中,移入培养箱中30 ℃固态发酵5 d。S. cerevisiae、Pichia、S. cerevisiae、Z. rouxii和Candida发酵耙豌豆样品分别命名为A、B、C、D和E,未发酵耙豌豆样品命名为F。发酵结束后,将样品放入-60 ℃条件下储藏备用。
1.3.3 电子鼻检测
每份取1.0 g发酵耙豌豆样品,置于10 mL顶空瓶中。70 ℃加热5 min,进样针吸取1 mL顶空气体进样分析。载气(合成干燥空气)流速150 mL/min,数据采集时间120 s,延滞时间300 s。检测结束后,以18个传感器的响应值进行统计分析。每个样品设置10组平行,选取稳定后的3组数据进行分析处理。
1.3.4 GC-MS检测
样品前处理:取发酵耙豌豆样品4.0 g装入20 mL顶空瓶,用GC-MS专用瓶盖密封,装入自动进样器,备用。
萃取及进样条件:萃取温度70 ℃,进样针温度75 ℃,传输线温度75 ℃,萃取时间1 800 s,干吹120 s,解析10 s,顶空瓶加压/释压120 s,捕集阱保持240 s,捕集阱循环4次。
气相条件:载气(99.999% He),流速1.0 mL/min。由室温升至80 ℃保持2 min,然后以4 ℃/min升至180 ℃,保持3 min,再以5 ℃/min升至230 ℃,保持5 min。
质谱条件:EI离子源,电子轰击能量70 eV,离子源温度230 ℃,电子倍增电压1 650 V;质量扫描范围:45～450 m/z;标准调谐文件。
利用软件SPSS 26.0进行方差分析;用Origin 2021软件对电子鼻数据进行分析;采用SIMCA 14.0对GC-MS定量结果进行PLS-DA、聚类分析及VIP值计算;利用R语言(R 4.2.3)绘制Upset图和热图。
由图1-a可知,6种耙豌豆样品对18个传感器的特征响应值均在1.2以下,且对LY 2/LG、LY 2/G、LY 2/AA、LY 2/Gh、LY 2/gCTI、LY 2/gCT传感器不敏感,在传感器PA/2、P 30/1、P 40/2和P 30/2上的响应值较高,结合表1可知,乙醛类、醇类、甲硫醇和α-松油醇类化合物是其主要挥发性物质。发酵耙豌豆(A、B、C、D、E)与未发酵耙豌豆(F)的传感器响应值差异较大,表明酵母菌发酵对耙豌豆挥发性风味有影响,发酵耙豌豆与未发酵耙豌豆整体风味差异较大。A与B样品在传感器上的响应值差异最小,初步判定S. cescerevisiae与M. guilliermondii发酵耙豌豆的整体风味较相似。
表1 电子鼻传感器性能描述
Table 1 Performance description of electronic nose sensors
续表1
传感器序号传感器性能参考物质11T 70/2对芳香族化合物敏感二甲苯12PA/2对有机化合物、有毒气体敏感乙醛、胺类化合物13P 30/1对可燃气体、有机化合物敏感乙醇14P 40/2对氧化能力较强的气体敏感甲硫醇15P 30/2对有机化合物敏感α-松油醇16T 40/2对氧化能力较强的气体敏感糠硫醇17T 40/1对氧化能力较强的气体敏感二甲基二硫醚18TA/2对有机化合物敏感己醇
a-电子鼻雷达图;b-主成分分析图
图1 不同发酵耙豌豆的电子鼻雷达图和主成分分析
Fig.1 E-nose radar plot and principal component analysis of different fermented pulpy peas
为了进一步确定不同酵母菌发酵耙豌豆的香气差异,通过主成分分析对数据进行统计分析,由图1-b可知,PC1和PC2的贡献率分别为84.8%和13.5%,累积贡献率大于80%,表明两个主成分可以呈现发酵耙豌豆的香气特征信息。5种发酵耙豌豆(A、B、C、D和E)与未发酵耙豌豆(F)的距离较远,表明发酵耙豌豆与未发酵耙豌豆整体香气差异较大。A、B和D样品在PC 1的距离较近,C与F的距离最远,表明S. cerevisiae、Pichia和Z. rouxii发酵耙豌豆的整体风味相似,S. cerevisiae发酵耙豌豆和未发酵耙豌豆的整体风味差异最大。
由电子增强出版附表1(https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.036377)和图2可知,6种发酵耙豌豆样品中共检测出69种挥发性物质,包括酯类、酸类、醇类、醛类、烃类、酮类及其他化合物。醇类和酸类是主要物质。与未发酵耙豌豆对比,发酵耙豌豆(A、B、C、D和E)中醇类物质的相对含量和种类数量均增加。醇类物质是由乳酸菌及酵母菌在发酵过程中,通过氨基酸脱羧、脱氢或脂代谢产生[14]。醇类物质共27种,相对含量最高,各样品的醇类物质相对含量为32.69%～64.77%;其次是酸类物质,共15种,各样品的相对含量为15.14%～53.43%。醇类和酸类物质的相对含量远高于其他类化合物。烃类、醛类、酯类、酮类和其他类化合物分别为4、6、7、2和8种,烃类、醛类和其他类化合物的相对含量较低,这也同ZHANG等[15]发酵大豆酱的研究结果一致。E样品中挥发性风味物质的种类数量最多,多于未发酵耙豌豆14种,表明Candida发酵耙豌豆能提高耙豌豆风味的丰富度。
a-物质相对含量;b-物质种类数量
图2 不同发酵耙豌豆挥发性风味物质相对含量及种类数量
Fig.2 Relative content and number of species of volatile flavor compounds in different fermented pulpy peas
醇类物质赋予了耙豌豆醇香风味,由电子增强出版附表1可知,同未发酵耙豌豆相比,发酵耙豌豆(A、B、C、D、E)中异戊醇、异丁醇和2-甲基丁醇的相对含量均上升。异戊醇主要由S.cerevisiae通过合成代谢途径和Ehrlich途径合成,使发酵耙豌豆口感醇厚,增强香气复杂度[16],其对豆豉形成特有酱香风味有显著贡献[17]。2-甲基丁醇的含量在A、C、D和E 4个样品中相对含量上升较多,分别增加到2.86%、3.27%、2.60%和2.93%,赋予发酵耙豌豆甜香、麦芽香,其也是酱油、黄豆酱中的挥发性香气物质[18]。A、D样品中乙醇的含量均较高,分别为24.14%和8.69%,因此S. cerevisiae和Z. rouxii发酵耙豌豆醇香、花香较浓郁,乙醇来源于酵母菌对氨基酸和糖类化合物的发酵代谢[19]。还原糖和氨基酸态氮水平的升高为酵母菌提供了物质基础,使醇类富集[20]。A中异丙醇含量较高,而D中异戊醇含量较高,因此S. cerevisiae发酵耙豌豆呈现水果香气,Z. rouxii发酵耙豌豆呈现果香、麦芽香气。E中异丙醇的含量最高,为53.91%,赋予Candida发酵耙豌豆浓郁水果香气,这也是Candida发酵耙豌豆与其他耙豌豆样品香气差异显著的原因,与电子鼻结果也相符合。
酸类物质赋予耙豌豆温和的酸味和香气。酸性化合物的产生与微生物密切相关,在发酵过程中,微生物降解蛋白质和碳水化合物产生对风味贡献显著的小肽、氨基酸和糖类,并进一步代谢形成挥发性有机酸[21]。与未发酵耙豌豆相比,A、B和C的酸类物质相对含量均上升。B、C中甲酸的相对含量显著上升,分别高于未发酵耙豌豆19.86%和21.92%。D中迭氮酸含量最高且为36.31%,呈现刺激性气味。
酯类化合物可通过有机酸和醇类酯化反应得到。未发酵耙豌豆样品中酯类物质相对含量为1.63%,酵母发酵耙豌豆样品中酯类物质含量均增加。A、B、C、D和E样品中酯类物质相对含量分别为4.68%、2.21%、4.39%、10.85%和2.83%。D中的乳酸乙酯赋予发酵耙豌豆朗姆酒、奶油香气。酯类物质中乙酸乙酯和3-甲基苯酚甲酯的相对含量较高,其中A和C中的乙酸乙酯含量较高,赋予发酵耙豌豆水果香气,可能是由于S. cerevisiae和S. cerevisiae所产的乙醇和乙酸较高,而乙酸乙酯含量与乙酸含量直接相关[22]。
醛类物质赋予发酵豆类食品特殊风味[23]。发酵耙豌豆中醛类物质种类及相对含量都较少。发酵耙豌豆(A、B、C、D和E)中己醛的相对含量均下降,己醛是豆腥味的主要物质[24-25]。表明酵母菌发酵能减弱耙豌豆的豆腥味。
为可视化6种发酵耙豌豆挥发性物质的差异,对69种挥发性物质进行热图分析。图3-b是高阶韦恩Upset图,能够更直观的表现出多个样品之间的交互情况。图中左下角的柱状图表示不同发酵耙豌豆样品的挥发性物质的种类数,上方柱状图和下方点线图表示不同样品之间交集数量和交集形式[26]。在下方点线图中,集合参与一个交集,则黑色圆填充相应的矩阵单元格,反之则显示浅灰色圆。每一列中最上面和最下面的黑色圆之间用黑线连接,表示集合之间的相交关系[27-28]。由图3-a和图3-b可知,6种发酵耙豌豆中挥发性物质的含量差异较大,共有挥发性物质仅为5种,包括乙酸乙酯、甘油三亚油酸酯、1-甲氧基-丁烯、钙磷酸和甲乙醚。丙二醇、2-羟乙基甲酸酯、5-乙炔酸、乙基烯丙基醚、牛磺酸和4-甲氧基-丁醇等物质在A和B中的相对含量都较高,表明S. cerevisiae和Pichia发酵耙豌豆的整体风味较相似,且与电子鼻分析结果相符合。E中相对含量较高的挥发性物质数量最多,而A、B和C样品中数量较少,表明Candida发酵能提高耙豌豆风味的丰富度。3-甲基-3-丁烯-2-醇、乙酸乙酯、乳酸乙酯在未发酵耙豌豆中的含量最低,在发酵耙豌豆(A、B、C、D和E)中含量均增加,这些酯类和醇类物质分子量小且易挥发,对耙豌豆的香气贡献为浓郁的果香和甜味。
a-聚类热图;b-物质种类Upset图
图3 不同发酵耙豌豆挥发性风味物质聚类热图和种类Upset图
Fig.3 Cluster heat map and species Upset map of volatile flavor compounds of different fermented pulpy peas
a-PLS-DA模型得分图;b-PLS-DA模型置换检验结果
图4 不同发酵耙豌豆PLS-DA模型得分散点图和置换检验结果
Fig.4 The scatter plot and permutation test results of the PLS-DA model of different fermented pulpy peas
PLS-DA是一种有监督的分析方法,能对数据进行降维处理,实现复杂数据的可视化、判别和预测。模型中R2X=0.977,R2Y=0.984,Q2=0.948接近1.0表明模型稳定可靠[29]。图4-b是判别模型经过200次置换检验的结果,Q2的回归线与Y轴的交点在负半轴,说明模型有效,没有过拟合,可用来反映发酵耙豌豆的风味情况[30]。A样品位于第1象限,B、C位于第2象限,E和F位于第3象限,D位于第4象限。发酵耙豌豆(A、B、C、D)和未发酵耙豌豆(F)之间分布较离散,各样品之间有较为明显的区分,说明S. cerevisiae、Pichia、S. cerevisiae和Z. rouxii发酵耙豌豆的整体风味具有一定的差异。6种发酵耙豌豆在PLS-DA的分散点图上聚类良好,组内差异小。E与F样品聚集度较高,D与F离散程度最大,表明Candida发酵和未发酵耙豌豆间的整体风味相似度较高,而Z. rouxii发酵与未发酵耙豌豆的风味差异最大。
为明确不同酵母菌发酵耙豌豆风味差异的关键风味物质,通过计算VIP确定各物质对发酵耙豌豆风味的贡献度。VIP>1的风味物质具有较大的贡献,定义其为差异标志物[31]。由图5可知,共筛选出12种VIP>1的香气物质,分别为4种醇类(异丙醇、乙醇、2-甲基丁醇和异戊醇)、3种酸类(甲酸、L-乳酸、迭氮酸)、2种酯类(乙酸乙酯、3-甲基苯酚甲酯)、1种醛类(甲氧基乙醛)、1种酮类(1-甲氧基-2-丙酮)和1种其他类物质(二甲醚)。其中甲酸的VIP值最高,表明甲酸对发酵耙豌豆的风味贡献较大,LIN等[32]同样发现传统发酵豆类调味品在发酵过程中会产生大量甲酸、丙酸等有机酸。结合电子增强出版附表1可知,C中甲酸的相对含量最高,主要呈辛辣气味,给S. cerevisiae发酵耙豌豆带来不舒适的风味。乙酸乙酯在C中相对含量最高,赋予耙豌豆水果香气和醇香,乙酸乙酯也被认为是豆豉中水果香味的重要来源[12]。乙酸乙酯与合成前体物质乙酸含量直接相关,可能是S. cerevisiae发酵产生的乙酸和乙醇酯化形成的。2-甲基丁醇主要是酱油、黄豆酱中的挥发性香气物质,能够赋予耙豌豆麦芽、酒香。
图5 不同发酵耙豌豆挥发性成分VIP图
Fig.5 VIP chart of volatile components of different fermented pulpy peas
本研究对产香酵母发酵耙豌豆的挥发性风味物质进行研究,电子鼻分析结果表明,5种酵母菌发酵耙豌豆的整体香气与未发酵耙豌豆的差异较大,其中S. cescerevisiae与M. guilliermondii发酵耙豌豆的整体风味较相似。GC-MS共检测出69种物质,包括27种醇类、15种酸类、7种酯类、6种醛类、4种烷烃类、2种酮类和8种其他类化合物。其中醇类、酸类和酯类为主要挥发性物质,相对含量远高于其他类物质。5种发酵耙豌豆的挥发性香气成分差异显著,与未发酵耙豌豆对比,发酵耙豌豆(A、B、C、D和E)中醇类和酯类物质的相对含量显著上升,且醇类物质的种类数量均增多。Candida发酵耙豌豆(E)样品的挥发性风味物质种类最多,达到了38种,提高了耙豌豆风味的丰富度。结合PLS-DA模型,筛选出12种VIP>1的挥发性标志物,包括甲酸、异丙醇、乙醇、2-甲基丁醇、异戊醇、L-乳酸、迭氮酸、乙酸乙酯、3-甲基苯酚甲酯、甲氧基乙醛、1-甲氧基-2-丙酮和二甲醚,多为醇类物质。醇类物质中异丙醇的VIP值最高,对发酵耙豌豆的风味贡献最大,赋予耙豌豆水果香气。本研究通过酵母菌发酵提高了耙豌豆风味的丰富度,为开发耙豌豆产品和促进发酵耙豌豆品质形成奠定了良好的基础,为发酵耙豌豆产品优化提供了理论依据。
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