图1 山羊奶发酵乳加工工艺流程图
Fig.1 Process flow chart of fermented goat milk
注:LBST-GMFM代表传统山羊奶发酵乳(对照组),LBSTL-GMFM代表新型山羊奶发酵乳(实验组)。
山羊乳是一种独特的乳资源,是我国丰富乳品消费结构、助力产业扶贫的重要产业[1]。山羊乳富含蛋白质、脂肪、碳水化合物、维生素和矿物质,有“奶中之王”的美称[2-3]。与牛奶相比,山羊乳富含容易消化分解的A2型β-酪蛋白[4],脂肪球粒径小[5];此外,羊乳功能性不饱和脂肪酸的含量与人乳相近[6],致敏性低、易消化吸收,是潜在的人乳替代品[7]。然而,较小的脂肪球,较多的短、中链脂肪酸,尤其是C6～C10的游离脂肪酸[8]和较低含量的酪蛋白造成羊奶膻味重、发酵乳组织状态差。因此,山羊奶发酵乳风味和品质的改善有待解决。
具备较好蛋白和脂肪水解能力的乳酸菌能够代谢产生氨基酸、脂肪酸等代谢物,加速凝乳,改善乳制品的风味和质地[9-10]。益生菌复配发酵能对羊奶的营养价值、风味和组织状态产生积极贡献[11];嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌是乳制品中常用的传统发酵剂,能在一定程度上掩盖羊奶的膻味[12-13],但其对羊奶凝乳能力较差。罗伊氏乳杆菌凝乳能力好,可用于发酵乳饼的研制[14];干酪乳杆菌产酸和蛋白水解能力强,可产生胞外多糖增强发酵乳的黏附性,提高酸奶结构的稳定性[15];干酪乳杆菌与短乳乳杆菌CGMCC1.5954复配发酵可提高益生菌活菌数、增强乳凝胶硬度,减少乳清析出[16];PENG等[17]添加干酪乳杆菌和双歧杆菌V9发酵牛奶,提高了发酵乳的活菌数和短链脂肪酸含量,赋予发酵乳更佳的口感和风味。
羊奶发酵乳具有辅助调节血脂、降低胆固醇、改善炎症等生物学价值[18]。目前,云南市售的山羊奶发酵乳膻味较重,组织状态较差,所含物质不明确,品质有待提升,山羊奶品质改善及新产品的开发具有良好的发展前景;研究旨在筛选具有较好蛋白和脂肪降解能力的发酵剂制备新型山羊奶发酵乳(new fermented goat milk,LBSTL-GMFM),解决传统发酵剂加工山羊奶发酵乳(fermented goat milk,LBST-GMFM)品质较差的问题,基于代谢组学技术探究山羊奶发酵乳的关键代谢物及相关代谢通路,为山羊奶发酵乳的研究与开发提供一定理论依据。
山羊奶(蛋白质2.99 g/100 g,脂肪3.34 g/100 g,乳固形物11.73 g/100 g),云南石林小尖山乳制品厂。
嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)21728菌株和保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus subsp.)6098菌株,中国工业微生物菌种保藏管理中心;干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)ZLC01、副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)和罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)由生产乳饼、乳扇的酸乳清中分离鉴定。
酚酞(分析纯),天津市北辰方正试剂厂;氨水(色谱纯),费希尔化学公司;乙酸铵、乙腈和甲醇均为色谱纯,德国默克股份有限公司。
HPX-9272ME培养箱,上海博讯实业有限公司;GJJ-0.06/70高压均质机,上海诺尼轻工机械有限公司;Vanquish超高效液相、Q Exactive HFX高分辨质谱、Heraeus Fresco17离心机,赛默飞世尔科技公司;Waters ACQUITY UPLC BEH Amide(2.1 mm×100 mm, 1.7 μm)液相色谱柱,Waters有限公司。
1.3.1 山羊奶发酵乳加工工艺设计
山羊奶发酵乳加工工艺如图1所示。
图1 山羊奶发酵乳加工工艺流程图
Fig.1 Process flow chart of fermented goat milk
注:LBST-GMFM代表传统山羊奶发酵乳(对照组),LBSTL-GMFM代表新型山羊奶发酵乳(实验组)。
1.3.2 发酵剂的筛选
乳酸菌的蛋白水解度和脂肪降解能力越强,发酵乳风味和凝乳效果越好。将保加利亚乳杆菌亚种、嗜热链球菌、干酪乳杆菌ZLC01、罗伊氏乳杆菌、副干酪乳杆菌这5株菌活化至活菌数108 CFU/g,按表1组合复配(体积比)发酵山羊奶,筛选具有较好蛋白质和脂肪降解能力的乳酸菌作为实验菌种;蛋白水解度参照罗艳华等[19]的方法测定;游离脂肪酸含量参照苏伟丽[20]的方法测定。
表1 发酵剂菌种组合列表
Table 1 List of strains combination for directed vat set
菌种组合ABCD保加利亚乳杆菌亚种1111嗜热链球菌1111干酪乳杆菌ZLC010300罗伊氏乳杆菌0030副干酪乳杆菌0003
注:表中“A、B、C、D”代表不同的发酵剂,数字“1、0、3”代表每种菌种的复配体积比。
1.3.3 发酵乳感官评价
由10位感官评估人员对产品色泽、气味、滋味、组织状态进行感官评定,评分标准见表2。
表2 感官评定标准
Table 2 Sensory assessment criteria
色泽(20分)气味(20分)滋味(30分)组织状态(30分)色泽均匀一致,呈乳白色(15～20分)气味协调,酸香味浓郁(15～20分)滋味柔和,甜酸适口,膻味淡 (21～30分)细腻、均匀,无乳清析出(21～30分)色泽较均匀,呈微黄色(8～14分)气味较协调,酸香味较浓郁(8～14分)滋味不柔和,甜酸比例不佳,膻味淡 (11～20分)细腻、较均匀,少量乳清析出(11～20分)色泽不均匀,呈黄色(0～7分)气味不协调,酸香味较淡(0～7 分)过酸或过甜,甜酸比例差,无膻味 (0～10分)粗糙、不均匀,乳清析出多(0～10分)
1.3.4 理化指标和乳酸菌数测定
酸度参照GB 5009.239—2016《食品安全国家标准 食品酸度的测定》测定;黏度用黏度计(3号转子,转速30 r/min,时间30 s)测定;持水力参照GUO等[21]的方法测定;乳酸菌数参考GB 4789.35—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 乳酸菌检验》法测定。
1.3.5 发酵乳代谢物检测
样品前处理:取100 μL样品于400 μL提取液[V(甲醇)∶V(乙腈)=1∶1,含同位素标记内标混合物]中,涡旋混匀30 s,超声10 min(冰水浴),-40 ℃静置1 h,离心后取上清液于进样瓶中上机检测。
UPLC条件:使用Waters ACQUITY UPLC BEH Amide (2.1 mm×100 mm, 1.7 μm)液相色谱柱,A相为水相,含25 mmol/L乙酸铵和25 mmol/L氨水,B相为乙腈。样品盘温度4 ℃,进样体积3 μL。
质谱条件:选择QE HFX质谱仪,采用电喷雾电离源(electron spray ionization,ESI)采集数据。正离子模式下喷雾电压为3 600 kV;负离子模式下喷雾电压为-3 200 kV。鞘气体流量30 Arb;辅助气体流量25 Arb;毛细管温度350 ℃;全MS分辨率为60 000,MS/MS分辨率为7 500;NCE模式碰撞能量为10/30/60 eV。原始数据经ProteoWizard软件转成mzXML格式后,使用自主编写的R程序包(内核为XCMS)进行峰识别、峰提取、峰对齐和积分等处理,然后与BiotreeDB(V2.1)自建二级质谱数据库匹配进行物质注释,算法打分的Cutoff值设为0.3。
1.3.6 数据统计分析
所有试验均重复3次,结果以平均值±标准偏差表示。采用Microsoft Excel 2007、SPSS 19.0进行数据处理,Origin 2018进行图表绘制;使用R软件对代谢物进行主成分分析(principal component analysis,PCA)和正交偏最小二乘法判别分析(orthogonal partial least squares discriminant analysis,OPLS-DA)。基于OPLS-DA,根据变量投影重要度(variable importance in project,VIP)>1.5,t检验的P<0.05和|log2 FC|>1(FC为差异倍数,fold change)进行差异代谢物筛选,将差异代谢物通过代谢通路数据库KEGG Pathways(KEGG,www.genome.jp/kegg)进行注释解析。
具有较好蛋白和脂肪水解能力的乳酸菌可加速凝乳,改善发酵乳的风味和质地[9]。如图2所示,相比于其他发酵剂,发酵剂B的蛋白水解度和游离脂肪酸含量分别为(9.29±0.24)%、(9.67±0.18) μmol/mL。较小的脂肪球、高含量的中链脂肪酸是山羊奶组织状态差、膻味重的原因[8],高含量的游离氨基酸和脂肪酸有助于提高发酵乳的风味和口感[10];发酵剂B的蛋白水解度和游离脂肪酸含量较高,说明发酵剂B有较好的凝乳和产香能力。据报道,干酪乳杆菌具有较好的脂肪和蛋白水解能力[22],可与其他菌种复配发酵,赋予产品更佳的风味品质[23]。综上,选择发酵剂B[V(保加利亚乳杆菌)∶V(嗜热链球菌)∶V(干酪乳杆菌ZLC01)=1∶1∶3]作为后期实验发酵剂。
图2 发酵剂筛选
Fig.2 Fermentation starter screening
注:图中不同小写字母表示差异显著(P<0.05)(下同)。
2.2.1 感官评价结果
分别用传统发酵剂和发酵剂B生产LBST-GMFM和LBSTL-GMFM。如图3所示,LBSTL-GMFM感官评分高于LBST-GMFM,为88分。2种发酵乳在气味、滋味和组织状态上差异较大;LBST-GMFM质地粗糙、膻味重、酸香味淡、口感偏酸、有乳清析出,LBSTL-GMFM酸香味浓郁、酸甜适口、有轻微羊膻味、黏稠细腻、无乳清析出。LBSTL-GMFM膻味低、风味和组织状态较好;这可能是干酪乳杆菌ZLC01能产胞外多糖,降解蛋白质和脂肪,产生大量的有机酸、游离氨基酸、游离脂肪酸[22];从而改善发酵乳的风味和组织状态。王记成等[23]通过干酪乳杆菌与嗜热链球菌复配发酵赋予了发酵乳细腻的口感、浓郁的乙醛风味。感官评价结果表明,将干酪乳杆菌ZLC01与传统发酵剂共发酵,有助于发酵乳风味品质的提高。
图3 山羊奶发酵乳感官评分图
Fig.3 Sensory scores of fermented goat milk
2.2.2 理化指标及乳酸菌活菌数分析
不同的发酵条件可改变发酵体系的酸度、凝乳pH值、黏度、持水力,影响发酵乳的组织状态和滋味品质。如表3所示,干酪乳杆菌ZLC01显著提高了LBSTL-GMFM的酸度、黏度、持水力和乳酸菌活菌数(P<0.05),且LBSTL-GMFM的pH值显著低于LBST-GMFM(P<0.05)。酸度是发酵乳中总酸性基团物质的表征,如肽和游离氨基酸[10]。
表3 山羊奶发酵乳的基本理化指标及乳酸菌活菌数
Table 3 Basic physicochemical indicators and live lactic acid bacteria count of fermented goat milk
基本指标LBST-GMFMLBSTL-GMFM标准pH值4.39±0.02a4.15±0.01b-酸度/°T95±2.24b107±4.75a≥70黏度/(mPa·s)1 724±16.83b1 952±21.95a-持水力/%87.1±3.56b97.17±2.36a-乳酸菌数/(CFU/g)3.76×108b2.06×109a≥1×106
注:-表示标准未规定相关要求。
LBSTL-GMFM的pH值较低、酸度高,而感官评分较好。这可能是低温长时发酵条件下,发酵剂将脂肪和蛋白充分降解为氨基酸、肽和脂肪酸等物质,从而有效提高了LBSTL-GMFM的酸度和乳酸菌活菌数[16]。这不仅赋予发酵乳更为浓郁的酸香味,还避免了高温短时发酵带来的乳酸含量高、口感粗糙、乳清析出和风味不足等问题。此外,黏度和持水力反映发酵乳蛋白凝胶结构的稳定性,黏度和持水力下降会导致发酵乳乳清析出、质地粗糙[24]。LBSTL-GMFM较高的黏度和持水力,形成较稳定的凝胶结构,增强了LBSTL-GMFM的质地和口感。FAN等[16]通过干酪乳杆菌和传统发酵剂共发酵,有效提高了发酵乳中脂肪酸、氨基酸和胞外多糖的含量,赋予发酵乳更佳的质地和口感,与本研究结果相似。综上,复配干酪乳杆菌ZLC01发酵,可充分地将羊乳的蛋白质和脂肪水解为氨基酸和游离脂肪酸等物质、促进菌体胞外多糖产生,增加发酵乳酸香味的同时改善发酵乳的组织状态。这可能是LBSTL-GMFM膻味低、酸香味浓郁、组织状态较好的原因。下一步可通过代谢组学探究代谢物对发酵乳品质的影响。
2.3.1 PCA和OPLS-DA
基于LC-QE-MS结合多元统计分析,探究发酵乳的小分子代谢物(多元统计分析结果见电子版增强出版附图1, https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.036207,下同)。PCA显示2组发酵乳在代谢物水平上存在差异,OPLS-DA结果显示,2种发酵乳被分离为两个单独的集群;正、负离子模式下模型的R2Y分别为0.998和1,Q2分别为0.791和0.943;R2Y、Q2值接近于1,表明此模型能很好的解释2种山羊奶发酵乳代谢物的差异。对模型进行200次置换检验,正、负离子模式下,置换检验模型的R2Y和Q2值均小于原模型,说明模型可靠性高,可根据VIP值筛选差异代谢物。
2.3.2 差异性代谢物的筛选
基于OPLS-DA结果,以VIP>1.5,P<0.05以及|log2FC|>1为条件筛选差异代谢物(差异代谢物含量见电子版增强出版附表1, https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.036207)。如图4-b所示,正、负离子模式下,共鉴定到58种差异代谢物,主要包括16种氨基酸、肽及其衍生物,9种脂肪酸及其衍生物,8种核苷酸及其衍生物,7种芳香类化合物,4种生物碱和14种其他类化合物。对差异代谢物进行聚类和可视化分析(图4-a、图4-c),LBSTL-GMFM中44种代谢物下调,14种代谢产物上调;上调的代谢物为4-异丙基苯甲酸、维生素C、橙皮苷、甲基富马酸、酪氨酰脯氨酸、谷氨酰胺丙氨酸、N-甲酰-L-蛋氨酸、4-羟基苯乙烯、(E)-3-(4-羟基苯基)-2-丙烯醛、丝衣霉酸、喹啉、尿囊素、L-色氨醇、苯乳酸,主要以氨基酸、肽及其衍生物和脂肪酸类化合物为主。其中,4-异丙基苯甲酸、维生素C、橙皮苷、甲基富马酸、酪氨酰脯氨酸这5种物质相对含量分别为LBST-GMFM的12 541、8 601、8 499、1 448、314倍,可作为LBSTL-GMFM的特征代谢物。
a-差异代谢物聚类热图;b-差异代谢物分类图;c-LBST-GMFM中上调差异代谢物的Log2 FC绝对值
图4 山羊奶发酵乳的差异代谢物热图分析
Fig.4 Heat map analysis of differential metabolites of fermented goat milk
氨基酸、肽及其衍生物能改善羊奶发酵乳的风味品质,赋予发酵乳酸甜的口感;含甘氨酸、丙氨酸和天冬氨酸残基的肽呈酸味、含谷氨酸的肽呈鲜味[10]。N-甲酰-L-蛋氨酸可通过美拉德反应生成醛类和硫类等风味物质[25]、酪氨酰脯氨酸有抗血压、抗肿瘤[26]等功能活性;大多数的L型氨基酸呈苦味、L-酪氨酸与甜味相关、L-苯丙氨酸和L-亮氨酸与苦味有关[27]。本研究中,LBSTL-GMFM中L-酪氨酸、L-亮氨酸、L-天冬酰胺、L-苯丙氨酸、2-呋喃酰甘氨酸等相对含量低于对照组,谷氨酰胺丙氨酸、酪氨酰脯氨酸、N-甲酰-L-蛋氨酸、L-色氨醇等相对含量较高;这可能是LBSTL-GMFM风味和酸甜味更佳的原因。此外,发酵乳中的氨基酸能和还原糖发生美拉德反应生成香气阈值较低的挥发性醛类物质[28];干酪乳杆菌可以利用氨基酸作为氮源,促进嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌的生长[29],增加胞外多糖含量,从而改善发酵乳的组织状态;这可以解释LBSTL-GMFM氨基酸类代谢物下调,而风味和组织状态更佳的原因。
脂质代谢物与发酵乳的风味品质密切相关,发酵乳中的脂肪酸源于微生物对原料乳中脂肪、蛋白质和乳糖的分解代谢[30]。LBSTL-GMFM中甲基富马酸、苯乳酸、4-异丙基苯甲酸等相对含量高于对照组(P<0.05);这类物质不仅赋予LBSTL-GMFM浓郁的酸香味和滋味、增强凝乳性能,还有较好的功能活性[28]。其中,苯乳酸有广谱抑菌作用[31],甲基富马酸有抑菌、抗炎和免疫调节作用[32],4-异丙基苯甲酸与酸菜独特的酸香味有关[33]。
综上,LBSTL-GMFM的风味品质和营养价值优于对照组。N-甲酰-L-蛋氨酸、谷氨酰胺丙氨酸、4-异丙基苯甲酸等物质赋予LBSTL-GMFM浓郁的酸香味和清爽的口感;干酪乳杆菌ZLC01具有较强的脂肪和蛋白质利用度,可通过氨基酸代谢改善发酵乳的风味品质和组织状态;下一步,有必要对差异代谢物进行代谢通路富集分析。
2.3.3 差异代谢物通路分析
通过KEGG数据库比对和通路相关性分析(代谢图通路富集图见电子版增强出版附图2-a和附图2-b),58种差异代谢物主要富集到6条显著的代谢途径,分别为苯丙氨酸代谢,维生素B6代谢,酪氨酸代谢,苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成,氨酰-tRNA生物合成,缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的生物合成途径。WANG等[34]研究表明,氨基酸是微生物的氮源,氨基酸物质的进一步代谢,会影响食品风味物质的形成,如酯和醇。本研究中的苯丙氨酸代谢、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成、酪氨酸代谢等代谢通路与氨基酸的代谢途径相关,且氨基酸、肽及其衍生物为主要的差异代谢物;这表明,干酪乳杆菌ZLC01主要通过氨基酸的代谢路径来改善山羊奶发酵乳的风味品质。
绘制了关键差异代谢物与代谢途径间的关系图(差异代谢物与代谢途径关系见电子版增强出版附图2-c)。在发酵剂作用下,羊乳中的蛋白质、糖类和脂类物质通过蛋白、脂肪的水解和氨基酸代谢途径参与三羧酸循环[35]。甲基富马酸由三羧酸循环中的顺乌头酸的衍生物衣康酸转化而来[32]。酪氨酰脯氨酸由蛋白质水解生成;4-异丙基苯甲酸由乳酸菌混菌发酵代谢糖类和脂质等物质分解产生[33],赋予新型发酵乳浓郁的酸香味。此外,L-苯丙氨酸可经芳香族氨基转氨酶生成苯丙酮酸,在乳酸脱氢酶的作用下转化为苯乳酸[31],赋予发酵乳潜在贮藏功能;橙皮苷是甜味剂二氢查耳酮的前体物质,由L-苯丙氨酸转化而来[36]。吡哆醛呈苦味,干酪乳杆菌可代谢吡哆醛分泌胞外多糖[37],增强凝乳效果;同时,吡哆醛还可以通过维生素B6代谢和酪氨酸代谢途径产生多巴胺,从而减轻L-酪氨酸带来的苦味[38]。维生素C具有较强的抗氧化活性和柔和的酸甜味[33],主要由干酪乳杆菌通过山梨糖途径代谢葡萄糖和2-酮基-L-古洛糖酸生成[38]。LBSTL-GMFM中吡哆醛含量低,橙皮苷和维生素C的相对含量显著高于对照组(P<0.05),这说明干酪乳杆菌ZLC01主要通过苯丙氨酸代谢、维生素B6代谢和酪氨酸代谢,改善LBSTL-GMFM的滋味和质地。
干酪乳杆菌ZLC01有效改善了山羊奶发酵乳膻味重、组织状态差、乳清析出严重等问题。LBSTL-GMFM的酸度[(107.26±4.75) °T]、黏度[(1 952.93±21.95) mPa·s]、持水力[(97.17±2.36)%]和乳酸菌活菌数(2.06×109 CFU/g)均高于对照组(P<0.05)。4-异丙基苯甲酸、维生素C、橙皮苷、甲基富马酸、酪氨酰脯氨酸是LBSTL-GMFM的特征代谢物,其主要通过苯丙氨酸代谢,酪氨酸代谢,苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成等途径生成。4-异丙基苯甲酸和酪氨酰脯氨酸与LBSTL-GMFM浓郁的酸香味有关,维生素C呈酸味、橙皮苷呈甜味、甲基富马酸有抑菌作用,这些特征性代谢产物赋予LBSTL-GMFM较好的滋味和防腐保鲜作用,共同改善发酵乳的风味品质。本研究可为山羊奶风味改善和山羊奶发酵乳的研发提供科学依据。
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