面团是固体(面筋和淀粉)和流体共存的非均质混合体系,是一种兼具黏性和弹性的黏弹性体,面团的品质与其原料、加工条件、网络结构、理化性质以及流变学性质等密切相关[1]。近些年来,人们对冷冻面团的需求在不断增长,冷冻面团也因其优势受到了广泛的关注。然而,冷冻和冷藏期间的低温和波动导致面团因冰晶的形成和冰的再结晶而变质,从而破坏了水合面筋网络,影响了面团的结构和功能特性。
本文主要从冷冻方法和冻藏时间对面团成分的影响入手,冻结速率通常可以作为调节冻结系统中冰晶的大小和分布的控制参数[2]。较慢的冷冻过程通常会在面团中产生更大的冰晶,这可能会对谷蛋白网络造成更多的破坏。相比之下,快速冷冻有效地保存了面团中酵母的活力[3]。此外,长时间的冷冻贮存会通过改变流变学和谷蛋白基质来降低最终产品的质量。因此,调节贮存时间和冷冻速率对于保护面筋网络的性质和结构,保证面团的整体质量至关重要。
本文以冷冻面团的可冻结水、巯基二硫键、微观结构、蛋白质二级结构、馒头的色差以及比容等为指标,研究不同冷冻方法和冻藏时间对冷冻面团在冻藏期间面团稳定性及其馒头特性的影响,为后续不同冷冻方法和冻藏时间应用于冷冻面团产品提供理论参考。
1 材料与方法
1.1 实验材料
普通小麦粉(蛋白质12.2%、碳水化合物72.3%、水13.04%、脂肪1.6%),益海嘉里粮油食品工业有限公司;高活性干酵母,安琪酵母股份有限公司。
1.2 仪器与设备
Minolta CR-400色差计,美国X-rite C公司;LGJ-10D 冷冻干燥机,北京四环科学仪器厂有限公司;TM3000日历台式电镜,日立高新技术公司;冰箱,青岛海尔有限公司;快速冷冻机,郑州亨利制冷设备有限公司;-70 ℃超低温保存箱,青岛海尔特种电器有限公司;DSC Q2000差示扫描量热仪,瑞士METTLER-TOLEDO公司;722N紫外分光光度计,上海仪电分析仪器有限公司;VERTEX 70傅立叶红外光谱(Fourier transform infrared spectroscopy,FTIR),德国Bruker公司。
1.3 实验方法
1.3.1 冷冻面团和馒头的制备
1.3.1.1 面团的制备
参考HE等[4]的制作方法,将小麦粉(100 g)、酵母(0.8 g)与蒸馏水(63 mL)在搅面机中混合,然后搅拌7 min,直到面团完全混合,揉至表面光滑即可。取出并用保鲜膜包好,室温静置5 min 后,生面团被切成50 g的小块,备用。
1.3.1.2 冷冻面团的制备
在上述制备好的面团的中心,插入无纸化温度记录仪,分别选取液氮浸泡冷冻法(liquid nitrogen immersion freezing, LF)、速冻机冷冻法(quick freezer freezing, QF)、包装浸泡冷冻法(package immersion freezing, PF)、超低温冰箱冷冻法(ultra-low-temperature freezer freezing, UF)进行速冻处理。每隔1 min 记录一次温度变化,当样品核心温度达到-18 ℃时取出,放置在冰箱中以-18 ℃冷冻0、15、30、60 d。以未被冷冻贮存的面团作为对照。
其中,LF是一种直接接触冻结法,面团放在液氮罐中,温度为-196 ℃。QF是一种空气冻结法,面团用快速冷冻机在-20 ℃的温度下冷冻。PF是将装有面团的塑料袋放在盛有浸泡溶液(95%无水乙醇)的容器中,在-20 ℃的冷冻机中冷冻。UF是一种间接接触冻结法,面团被冷冻在-70 ℃的超低温冰箱中。
1.3.1.3 馒头制备
将冻藏后的冷冻面团放入醒发箱解冻40 min (30 ℃,相对湿度75%)后,发酵40 min(35 ℃,相对湿度75%),然后放入沸水锅中蒸制20 min,冷却1 h。
1.3.2 冷冻面团蛋白质二级结构的测定
用FTIR测定面团中蛋白质的二级结构,并根据相关研究进行分析[5]。冷冻面团冻干粉末和KBr的质量比为1∶100,在压力(10 MPa)中压制1 min, 取出后进行扫描。实验在以下条件下进行:检测波数在400～4 000 cm-1,扫描次数为64次,分辨率为4 cm-1。对每个样品进行3次技术重复实验。
1.3.3 冷冻面团巯基二硫键的测定
根据LU等[6]的方法。冻干面团粉(0.075 g) 称重,放入10 mL离心管,加入1 mL缓冲溶液和4.7 g盐酸胍混合,用缓冲液固定到10 mL,获得样品溶液。将1 mL样品溶液、4 mL尿素-盐酸胍溶液和0.05 mL埃尔曼试剂放入10 mL试管,混合,然后使用紫外分光光度计在412 nm处测量吸光值。每个样本测量3个重复并取平均值。游离巯基含量根据公式(1)计算:
游离巯基含量
(1)
式中:A412为412 nm处的吸光度值;D为稀释系数;C为样品质量浓度,mg/mL。
对于总的SH含量,将1 mL样品溶液、0.05 mL巯基乙醇和4 mL尿素盐酸胍溶液混合,在25 ℃下保存1 h。然后将10 mL 12%(质量分数)三氯乙酸加入到混合物中,在25 ℃下保存1 h,以5 000×g离心10 min。用5 mL 12%三氯乙酸洗涤沉淀2次,最后将沉淀溶解于10 mL 8 mol/L尿素中,在处理溶液中加入0.04 mL的Ellman试剂,测定412 nm处的吸光度值。每个样品进行3次测定,并取测量值的平均值。二硫键含量根据公式(2)计算:
(2)
式中,CSS为二硫键含量,μmol/g;CSH′为总巯基含量,μmol/g,包括二硫键衍生物和溶液中的游离巯基;CSH为游离巯基含量,μmol/g。
1.3.4 冷冻面团微观结构测定
参照YI等[7],将面团冻干分成小块,固定横截面于导电胶带上,放入离子溅射仪内喷金30 s,厚度10 nm。然后在20 kV的加速电压下用扫描电镜观察。样本图像是在1 500 ×的放大倍数下观察到的。从样品中选择有代表性的显微照片进行说明。
1.3.5 冷冻面团可冻结水的测定
参照FENG等[8],采用差示扫描量热仪测定冷冻贮存0、15、30、60 d后冷冻面团的熔化峰的焓(ΔH)。简单地说,冷冻面团样品在25 ℃下解冻1 h,称取20 mg的面团,放在DSC铝坩埚中,然后密封铝坩埚。同时,以一个空的标准铝坩埚作为参考,样品在25 ℃下平衡5 min,用液氮以10 ℃/min的速度冷却至-30 ℃,在-30 ℃下平衡1 min,然后以10 ℃/min的速度从-30 ℃加热至30 ℃。记录了加热过程中熔化峰的焓(ΔH)。根据公式(1),确定了可冻结水(freezable water,FW)的含量。FW含量按公式(3)计算:
(3)
式中:ΔH为吸热曲线熔化的峰值焓,J/g;ΔH0为纯水熔化的峰值焓(334 J/g);Wt通过在105 ℃下用真空干燥箱脱水的样品的含水量,%。每一个测量重复进行3次。
1.3.6 冷冻面团馒头色差的测定
参考GUO等[9]的方法并稍做修改,研究了冷冻方法和冻藏时间对馒头色差的影响。将1.3.1节中制作好的馒头分割成20 mm厚的片状馒头,取芯部(长×宽×高=2 cm×2 cm×1 cm), 每个冷冻处理冻藏一定时间后分别取3份。使用色差仪测定冷冻面团馒头色泽。
1.3.7 冷冻面团馒头比容的测定
参照GUO等[9]的方法做了一定的修改,研究了不同冷冻方法和冻藏时间对馒头比容的影响。将馒头称重,采用谷子置换法测定其体积,然后计算比容。每组测量3次。馒头比容按公式(4)计算:
比容
(4)
式中:V为馒头体积,mL;m为馒头质量,g。
1.4 数据处理
试验至少重复3次,数据以平均值±标准差表示,用SPSS 26.0对数据进行ANOVA 统计学分析(P<0.05),利用 Origin 2021 软件绘图。
2 结果与分析
2.1 不同冷冻方法和贮存时间下冷冻面团蛋白质二级结构
图1显示了不同冷冻方法在不同冻藏时间下蛋白质二级结构相对含量的变化。由图1可知,随着冷冻贮藏时间的增加,α-螺旋以及β-转角含量减少,β-折叠和无规则卷曲含量增加。这表明面团的面筋网络在贮存过程被削弱,β-转角转化为了β-折叠,α-螺旋部分转化为无规则卷曲,从而导致构象的改变。而且α-螺旋是较为有序的二级结构,其含量的增加代表更为稳定和有弹性的蛋白结构,对面团的弹性具有一定的贡献[10]。冻藏60 d后,与0 d相比,PF、UF、QF和LF处理的冷冻面团中,α-螺旋含量分别下降28.2%、24.33%、31.18%和19.5%,β-折叠含量分别提高了22.1%、8.33%、32%和27.66%。这些变化可能是由于冻藏阶段水分迁移和冰晶重结晶,导致面筋网络结构的弱化和面团黏弹性的降低从而引起α-螺旋含量的下降;随着冷冻保存时间的延长,冷冻面团中蛋白质的二硫键被破坏,形成一些小分子物质,导致蛋白质中分子间氢键的减弱,这些小分子物质通过非共价相互作用不断发生聚集,导致β-折叠的含量增加[11-12]。且从PF、UF、QF和LF处理的冷冻面团α-螺旋和β-折叠含量变化的结果来看,LF处理的冷冻面团中α-螺旋含量下降最少,β-折叠提高相对较高,这说明LF处理减轻了冻藏过程中蛋白质二级结构的破坏。另一方面,随着β-转角的减少,分子间β-折叠增加,说明冻藏会影响面团蛋白质的分子间β-折叠和β-转角的含量,使β-转角在冻藏过程中转化为了β-折叠,与赵雷[13]研究结果一致。
图1 不同冷冻方法和贮存时间下冷冻面团蛋白质二级结构
Fig.1 Secondary structure of frozen dough proteins under different freezing methods and storage times
注:误差条表示至少3次重复的标准偏差。不同小写字母表示相同冷冻方法下不同贮存时间存在显著差异(P<0.05);不同大写字母表示在相同贮存时间不同的冷冻方法存在显著差异(P<0.05)(下同)。
2.2 不同冷冻方法和贮存时间下冷冻面团巯基和二硫键
通常游离巯基可以通过SH/SS键交换反应形成SS键参与蛋白分子的聚集行为,因此是面筋蛋白的功能基团,也是评价面筋蛋白聚集程度的重要指标。而当蛋白质的二硫键断裂后会形成自由巯基,进而导致面筋蛋白网络弱化。冷冻面团中游离巯基和二硫键的变化趋势如图2所示。
图2 不同冷冻方法和贮存时间下冷冻面团巯基和二硫键
Fig.2 Sulfhydryl and disulfide bonds of frozen dough under different freezing methods and storage times
可知在贮藏期内(0～15 d),4种冷冻方法处理的冷冻面团游离巯基和二硫键含量相差不大,整体表现二硫键含量高于游离巯基含量。而当贮藏期内(30～60 d),4种冷冻方法处理的冷冻面团游离巯基和二硫键含量差异较明显,尤其是游离巯基含量变化,可以明显看出PF>UF>QF>LF。这可能是因为冻藏阶段,由于温度波动引起的水分迁移和冰晶重结晶造成对面团样品网络结构的挤压和破坏,二硫键密度分布不均匀从而使其键合作用变弱,氧气将这部分键合作用较弱的二硫键氧化,从而使得部分二硫键断裂[13]。
冷冻面团中游离巯基含量随时间逐渐增加,二硫键含量逐渐减少。由此可见,冷冻面团中的二硫键随着冻藏时间的延长发生断裂,与ZHAO等[14]研究结论一致。另外,冷冻保存60 d后,PF、UF、QF和LF的游离巯基含量分别从4.00、3.64、3.79、3.95 μmol/g增加到10.47、9.22、8.25、7.23 μmol/g,而二硫键含量分别从8.37、8.65、9.87、10.25 μmol/g下降到3.62、3.92、4.39、4.72 μmol/g。表明冻藏会极大破坏面团体系中的面筋网络结构,加剧面筋蛋白肽链间二硫键的断裂,从而损害面筋网络的加工性质和稳定性。而且WANG 等[15]发现GMP在冷冻贮存过程中发生解聚,导致游离巯基含量上升。
2.3 不同冷冻方法和贮存时间下冷冻面团微观结构
图3为冷冻面团样品的扫描电镜结果,由图3可以清楚的看出,图中圆球状的是淀粉颗粒,淀粉颗粒被面筋蛋白包裹在网络结构内;黑色孔洞可能是冰晶在冷冻干燥过程中升华留下的空间或者面团发酵产生CO2形成的气孔所致。PF冷冻面团的微观结构出现的孔洞大且多;与PF相比,QF和LF冷冻面团暴露较少,孔洞数目减小,面筋网络结构的完整性和连续性相对较好,UF次之。
A1, A2, A3, A4-PF处理0、15、30、60 d;B1, B2, B3, B4-UF处理0、15、30、60 d;C1, C2, C3, C4-QF处理0、15、30、60 d;D1, D2, D3, D4-LF处理0、15、30、60 d
图3 不同冷冻方法和贮存时间下冷冻面团微观结构
Fig.3 Microstructure of frozen dough under different freezing methods and storage times
随着冻藏时间的延长,所有冷冻面团的面筋蛋白网络结构逐步减少,淀粉颗粒与面筋结构分离出来,部分淀粉颗粒完全裸露在外面,而15 d时面团微观接近0 d。从冻藏60 d后与第0天对比可知,冻藏时间的延长会造成面筋蛋白网络结构破坏,面筋结构表面变的粗糙而且松散,导致更多的淀粉颗粒向外裸露出来,这结果也与王金水等[16]、BAIER-SCHENK等[17]的研究结论相一致。另一方面也可能是因为冷冻贮藏过程中水分重新分布,面筋的脱水增加了冰晶含量,冰的重结晶破坏面团的面筋网络结构,导致面筋网络结构的孔隙变大,破坏了网络结构的完整性和连续性。这些结果表明QF和LF处理的面团冻藏15 d 时相对较好。
2.4 不同冷冻方法和贮存时间下冷冻面团可冻结水
由图4可知在贮藏期内(0～15 d), PF和UF冷冻面团可冻结水含量高于QF和LF;在贮藏期(30～60 d),4种不同冷冻方法处理的面团可冻结水存在显著差异(P<0.05),其中30 d时,LF处理的面团可冻结水含量高于其他3种,60 d时,PF处理的面团可冻结水含量最高。这可能归因于冷冻温度较低,冷冻过程中的冰晶数量、形状和大小的变化会导致更大的冰晶形成,破坏蛋白网络结构的化学键,从而导致面筋网络结构被破坏,致使水分子分离出来,面团的持水力减弱,最终影响冷冻面团的品质[18]。
图4 不同冷冻方法和贮存时间下冷冻面团可冻结水
Fig.4 Frozen dough freezable water under different freezing methods and storage times
另一方面,随着时间的延长,4种冷冻方法和冻藏时间处理的面团可冻结水先减少后增加在15 d或30 d较低,60 d达到最大。与0 d相比,经PF、UF、QF 和LF处理的面团经过60 d的冷冻贮存后,面团可冻结水分别增加了约6.21%、1.7%、7.7%、1.18%,这是因为在冷藏过程中面团中析出的冰晶破坏了面筋结构,降低了蛋白与水分子的结合,导致更多的冰晶析出,面团体系结构进一步劣变,从面团的微观结构测定中也能看到类似的变化。
2.5 不同冷冻方法和贮存时间馒头外观及切面
如图5所示,随贮藏期延长,不同冷冻方法下馒头表皮开始皱缩,出现凹陷,容易掉碎屑,失去原有品质。在贮藏前期,馒头内部结构呈细小蜂窝状、结构均匀致密,随着贮藏时间的延长,馒头内部孔洞逐渐不均匀。60 d时变化最为明显,其中PF馒头切面出现裂纹,QF馒头切面中心出现硬芯,LF馒头切面出现孔洞多且大的现象。单从馒头切面结果来看,冻藏时间不易超过60 d。
A1, A2, A3, A4-PF处理0、15、30、60 d;B1, B2, B3, B4-UF处理0、15、30、60 d;C1, C2, C3, C4-QF处理0、15、30、60 d;D1, D2, D3, D4-LF处理0、15、30、60 d
图5 不同冷冻方法和贮存时间下馒头外观及切面
Fig.5 Appearance and cut surface of steamed bread under different freezing methods and storage time
根据表1色差结果分析,L*和b*随着时间的延长先增大后减小,在15 d或者30 d时较大,这是因为冰晶破坏冷冻面团面筋网络结构,淀粉更多的暴露出来,导致白度增加。PF贮藏的馒头L*值和a*值颜色变化差距最大,老化较快,老化的表现为馒头硬度增大、亮度降低和口感变差等。在LF处理下馒头色差变化幅度不如 QF、UF、PF,很大原因在于处理温度的变化导致馒头老化程度不同,馒头老化程度和蛋白质性质的变化是影响馒头色差的主要因素[19]。
表1 不同冷冻方法和贮存时间下馒头色差的变化
Table 1 Changes in color difference of steamed bread under different freezing methods and storage times
冷冻方法0 d15 d30 d60 dL∗PF62.78±3.66Bb78.12±1.10Aa80.21±0.68Aa76.49±3.00AaUF64.79±5.05ABb78.31±1.03Aa77.84±0.97Ba74.81±0.16AaQF69.95±3.57ABb76.91±1.07Aa76.23±1.92Ba75.03±1.07AaLF71.46±4.73Ab77.39±0.47Aa76.99±0.87Ba73.97±0.88Aaba∗PF-1.03±0.14Aab-1.09±0.24Aab-0.85±0.05Aa-1.16±0.10bBUF-0.97±0.27Aab-1.02±0.03Aab-0.82±0.21Aa-1.18±0.09BbQF-1.11±0.09Aab-1.23±0.14Ab-1.08±0.19ABab-0.90±0.09AaLF-1.18±0.15Aa-1.30±0.07Aa-1.14±0.07Ba-1.20±0.15Bab∗PF 7.55±0.80Bb11.81±1.61Ba 13.67±1.37Aa 12.52±2.45AaUF8.02±0.82ABb13.04±0.32ABa12.67±0.91Aa12.61±0.49AaQF8.91±1.10ABb13.75±0.55Aa13.49±1.15Aa13.23±0.60AaLF10.33±1.97Aab11.86±0.86ABa12.55±0.93Aa8.52±0.97Bb
注：数据以平均±标准差(n=3)表示。同一行中不同小写字母表示在不同的贮藏时间有显著性差异(P<0.05)。同一列中不同大写字母表示在不同的冻结方法下存在显著差异(P<0.05)。
2.6 不同冷冻方法和贮存时间下冷冻面团馒头比容
比容是评价馒头质量属性的重要指标,冷冻面团制成的馒头比容如图6所示。在冻藏期间不同冷冻方法下馒头比容有一定的差异,其中LF处理的馒头比容最大。主要是由于在冻藏过程中,不同温度间的差异导致馒头内的水形成冰晶的大小不一进而影响馒头的比容[20]。随着冻藏时间的延长,PF、UF、QF和LF馒头的比容显著降低(P<0.05),与0 d相比,在冻藏60 d时比容分别降低了约73.01%、83.41%、72.82%和69.54%。表明馒头比容的减小主要是因为冻藏引起水分分布状态改变,结合水向可冻结水转化,冰晶数量的增多以及重结晶的不断出现使面筋网络遭到破坏以及发酵特性减弱[21]。
图6 不同冷冻方法和贮存时间下馒头比容
Fig.6 Specific volume of steamed bread under different freezing methods and storage times
注:误差条表示至少3次重复的标准偏差。不同小写字母表示相同冷冻方法下不同贮存时间存在显著差异(P<0.05);不同大写字母表示在相同存贮存间内不同的冷冻方法存在显著差异(P<0.05)。
3 结论
分析了冻藏方式及时间对冷冻面团可冻结水、巯基二硫键、蛋白质二级结构、微观结构及馒头品质的影响。与PF、UF和QF相比,LF温度较低,更好地保存冷冻面团的网络结构。巯基二硫键表明,PF对面团样品网络结构的挤压和破坏较大。蛋白质二级结构中,LF处理的冷冻面团中α-螺旋含量下降最少,β-折叠提高相对较高,对蛋白质二级结构的破坏较小。冷冻贮存后,谷蛋白结构被破坏,导致出现空洞,PF对面团的影响最大,UF次之,QF和LF相对较轻。冻藏15 d时,冷冻面团的面筋网络结构与0 d的面团相似。而且从馒头切面来说,当冻藏时间超过15 d,可以看出切面出现裂纹、硬芯及气孔变多。综上,与PF、UF和QF相比,LF处理的冷冻面团和馒头在保存15 d后,其质地和质量有了显著的改善。本研究为在冷冻小麦食品中使用不同的冷冻方法和贮存时间提供了基础依据。其次,今后还应研究不同的冷冻方法和贮存时间对冷冻面团中面筋和淀粉特性的影响。
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