枇杷为蔷薇科枇杷属植物,因果实形似琵琶而得名。枇杷含有丰富的碳水化合物、蛋白质、氨基酸、维生素等,且具有止咳润肺、延缓衰老等生理功效。我国是世界上主要的枇杷生产国,生产规模占世界枇杷产量的80%以上[1],由于采摘期短,果皮薄,且贮运过程中易受机械损伤[2],枇杷的精深加工十分必要。
乳酸菌是可以代谢糖类产生乳酸的一类益生菌。近年来,随着植物基原料的健康功效越来越受到关注,乳酸菌发酵果蔬产品的开发成为研究热点。研究者常利用植物乳植杆菌[3]、副干酪乳酪杆菌[4]和短乳杆菌[5]对单一或者混合果蔬汁进行发酵,以提高其营养或感官特性。苏能能等[6]利用植物乳植杆菌发酵桑葚汁,明显提高了桑葚汁的抑菌活性;王储炎等[7]利用副干酪乳酪杆菌发酵蓝莓汁,提高了蓝莓多酚含量与抗氧化活性;张晶等[8]利用短乳杆菌发酵苹果汁,极大改善了其风味口感。围绕乳酸菌发酵枇杷汁研究,林晓姿等[9]解析了植物乳植杆菌R23发酵枇杷汁的挥发性风味物质;MENG等[10]揭示了植物乳植杆菌和嗜酸乳杆菌发酵对枇杷汁抗氧化活性和代谢组学特征的影响。本研究旨在考察内源性植物乳植杆菌、副干酪乳酪杆菌和短乳杆菌在枇杷汁中的生长情况,并研究3种乳酸菌发酵枇杷汁总酸、总酚、抗氧化活性和代谢产物的差异,为乳酸菌发酵枇杷汁的制备提供理论基础。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 材料与菌种
枇杷,产自雅安市汉源县;植物乳植杆菌M2、副干酪乳酪杆菌J1和短乳杆菌B7-8,保存于四川农业大学食品学院微生物实验室,筛选自自然发酵枇杷汁。
1.1.2 试剂
MRS肉汤培养基、MRS琼脂培养基,青岛海博生物技术有限公司;没食子酸,成都市科隆化学品有限公司;DPPH,梯希爱(上海)化学工业发展有限公司;ABTS、福林-酚、Trolox、DNS试剂,北京索莱宝科技有限公司。
1.2 仪器与设备
PHS-3CB型pH计,上海越平科学仪器有限公司;UV-3100PC型紫外分光光度计,上海美谱达仪器有限公司;DHG-9162电热恒温培养箱,上海一恒科技有限公司;LDZF-75L-I立式高压蒸汽灭菌锅,上海申安医疗机械厂;Varioskan Flash荧光酶标仪、Vanquish超高效液相色谱仪、Orbitrap Exploris 120高分辨质谱仪,美国Thermo Fisher Scientific公司;PS-60AL超声仪,深圳市雷德邦电子有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 菌种活化
将甘油管保藏的植物乳植杆菌M2、副干酪乳酪杆菌J1和短乳杆菌B7-8解冻,按2%(体积分数)接种至MRS肉汤培养基,于37 ℃下静置培养24 h后再次进行扩增培养(37 ℃,24 ～36 h)。
1.3.2 枇杷汁的制备
将果实完好的八至九成熟枇杷用自来水清洗,去皮、去核、去蒂得到枇杷果肉,沥干水分后打浆,按照m(白砂糖)∶m(枇杷果肉原浆)∶m(纯净水)=1∶4∶5制作枇杷汁,并于105 ℃灭菌1 min,冷却至室温待用。
1.3.3 枇杷汁发酵
将乳酸菌接种至枇杷汁(终浓度约3.50×107 CFU/mL),于30 ℃恒温培养箱中发酵5 d,每天固定时间取样。将所取样品于8 000 r/min离心10 min,将上清液于-20 ℃保存待用。
1.3.4 发酵过程指标测定
1.3.4.1 乳酸菌计数
采用稀释涂布平板法测定,具体操作步骤参考国标GB 4789.35—2016 《食品安全国家标准 食品微生物学检验 乳酸菌检验》。
1.3.4.2 pH值与总酸含量
pH 值采用pH计进行测定。总酸采用酸碱滴定法测定,总酸含量以乳酸计,具体操作参照国标GB 12456—2021《食品安全国家标准 食品中总酸的测定》。
1.3.4.3 还原糖含量
采用DNS法进行测定,具体操作参照钱籽霖[11]的方法并稍作修改:将样品用蒸馏水稀释100倍,取1 mL加入试管,并加入1 mL DNS试剂,经5 min沸水浴处理后立即冷却,加入3 mL蒸馏水,测定540 nm 吸光度值。以干燥至恒重的无水葡萄糖绘制标准曲线。
1.3.4.4 总酚含量
总酚含量测定参照GB/T 8313—2018《茶叶中茶多酚和儿茶素类含量的检测方法》。以没食子酸标准品绘制标准曲线。
1.3.4.5 抗氧化活性的测定
ABTS阳离子自由基清除能力测定参考CAI等[12]报道并稍作修改:将样品用pH 7.2、0.2 mol/L的磷酸盐缓冲液稀释5倍后取5 μL于96孔酶标板中,加入195 μL 7 mmol/L ABTS阳离子溶液,避光反应8 min后测定734 nm吸光度值。以Trolox标准品绘制标准曲线。
DPPH自由基清除能力测定参考WU等[13]报道并稍作修改:取5 μL样品于96孔酶标板中,加入195 μL DPPH溶液,避光反应30 min后测定517 nm吸光度值。以Trolox标准品绘制标准曲线。
1.3.5 发酵枇杷汁代谢组分析
将100 mg发酵完成的样品与400 μL提取液[V(甲醇)∶V(乙腈)∶V(水)=2∶2∶1,含同位素标记内标混合物]混匀,于35 Hz研磨4 min,超声5 min(冰水浴);-40 ℃静置1 h后将样品于4 ℃,13 800×g离心15 min,取上清液待测。使用Vanquish超高效液相色谱仪,通过 Waters ACQUITY UPLC BEH Amide(2.1 mm × 50 mm,1.7 μm)液相色谱柱对目标化合物进行色谱分离。液相色谱A相为水相,含25 mmol/L乙酸铵和25 mmol/L氨水,B相为乙腈。样品盘温度 4 ℃,进样体积 2 μL。护套气体流速50 Arb,Aux气体流速15 Arb,毛细管温度320 ℃,MS/MS分辨率15 000,喷雾电压3.8 kV(正离子模式)或-3.4 kV(负离子模式)。采用Orbitrap Exploris120高分辨质谱仪对样本中的代谢物进行检测,利用XCMS程序进行峰识别、峰提取、峰对齐和积分等处理。
1.4 数据分析
所有实验均进行3次重复。使用Microsoft Excel进行数据结果统计,使用Origin 2018绘图,采用SPSS Statistics进行显著性和方差分析。
2 结果与分析
2.1 枇杷汁发酵过程中乳酸菌数量的变化
由图1可知,3种乳酸菌在枇杷汁中表现出不同的生长情况,发酵过程中植物乳植杆菌M2整体生物量始终低于副干酪乳酪杆菌J1和短乳杆菌B7-8。3种乳酸菌数量在发酵第1天内迅速增长,均达到8.1 lg CFU/g以上。副干酪乳酪杆菌J1和植物乳植杆菌M2的数量在发酵第1 d最高,副干酪乳酪杆菌J1的数量在随后的发酵过程中呈现微弱波动,而植物乳植杆菌M2在发酵1～4 d逐步减少,第5天则稍有增加。发酵结束时,3种乳酸菌数量均在8.0 lg CFU/g以上,表明它们均能较好地适应枇杷汁基质。
图1 枇杷汁发酵过程中乳酸菌数量的变化
Fig.1 Changes in the number of lactic acid bacteria during loquat juice fermentation
2.2 枇杷汁发酵过程中pH值及总酸含量变化
由图2-A可知,随着发酵的进行,3种枇杷汁的pH值均持续下降,其中第0～3天下降较快,第4天后下降趋势变缓。对应地,发酵枇杷汁总酸含量总体呈现上升趋势(图2-B),其中植物乳植杆菌M2产酸能力最佳。发酵结束时,3种乳酸菌的总酸含量均在2.60 g/100 mL以上,其中植物乳植杆菌M2在发酵结束时达到3.49 g/100 mL(P<0.05)。
A-pH值;B-总酸
图2 枇杷汁发酵过程中pH值和总酸的变化
Fig.2 Changes in the pH and total acid content during loquat juice fermentation
2.3 枇杷汁发酵过程中还原糖含量的变化
由图3所示,植物乳植杆菌M2和短乳杆菌B7-8发酵枇杷汁的还原糖含量总体呈现类似变化趋势,但第3～5天植物乳植杆菌M2发酵枇杷汁的还原糖含量明显低于短乳杆菌B7-8发酵枇杷汁(P<0.05)。副干酪乳酪杆菌J1发酵枇杷汁中还原糖呈现无规则波动,发酵中还原糖偶有上升可能与乳酸菌代谢过程中产生的酶使发酵基质中碳水化合物降解、酸性环境促使多糖水解等相关,这导致还原糖生成的速度大于乳酸菌消耗还原糖的速度[14]。发酵结束时,副干酪乳酪杆菌J1发酵枇杷汁中还原糖含量最高(P<0.05),其次为短乳杆菌B7-8和植物乳植杆菌M2,分别为36.82、27.07、12.09 mg/mL。
图3 枇杷汁发酵过程中还原糖含量的变化
Fig.3 Changes in reducing sugar content during loquat juice fermentation
2.4 枇杷汁发酵过程中总酚含量的变化
由图4可知,3种乳酸菌的总酚含量总体呈现先下降后上升的趋势,而短乳杆菌B7-8发酵枇杷汁在发酵第2天达到最高值后先下降后又上升。总酚含量的下降可能与发酵液中的溶解氧含量有关,发酵初始溶解氧较多,总酚类物质因氧化出现含量降低;也可能与总酚类物质不稳定、与金属离子发生络合[15]或乳酸菌代谢产生多酚氧化酶[16]有关;总酚含量的上升可能与乳酸菌代谢过程中释放水果结合多酚,将聚合酚类物质转化成更多简单酚类物质有关[17]。发酵结束时植物乳植杆菌M2、副干酪乳酪杆菌J1和短乳杆菌B7-8发酵枇杷汁总酚含量分别为147.36、116.03、63.70 mg/L,仅植物乳植杆菌M2比发酵初始总酚含量高,为第0天的126.79%,而副干酪乳酪杆菌J1与短乳杆菌B7-8则分别比第0天下降0.16%、58.49%。
图4 枇杷汁发酵过程中总酚含量的变化
Fig.4 Changes in the total phenol content during loquat juice fermentation
2.5 枇杷汁发酵过程中抗氧化活性的变化
由图5可知,3种乳酸菌发酵枇杷汁的DPPH自由基、ABTS阳离子自由基清除能力在发酵过程中均呈无规则波动,短乳杆菌B7-8发酵枇杷汁的DPPH自由基清除能力整体变化最小。植物乳植杆菌M2和副干酪乳酪杆菌J1的DPPH自由基清除能力均在第1天达到最高,分别为855.56、487.78 μmol/L,第2天之后总体呈现下降趋势,发酵结束时仅有副干酪乳酪杆菌J1发酵枇杷汁的DPPH自由基清除能力高于第0天,为618.89 μmol/L。与植物乳植杆菌M2和短乳杆菌B7-8相比,副干酪乳酪杆菌J1能更好地提升DPPH自由基的清除能力。
A-DPPH自由基;B-ABTS阳离子自由基
图5 枇杷汁发酵过程中自由基清除能力的变化
Fig.5 Changes in the free radical scavenging ability during loquat juice fermentation
3种乳酸菌发酵枇杷汁中,短乳杆菌B7-8和植物乳植杆菌M2发酵枇杷汁ABTS阳离子自由基清除能力的最大值均出现在第2天,分别为1 400、961.11 μmol/L,是发酵第0天的262.50%、180.21%。发酵结束时,副干酪乳酪杆菌J1发酵枇杷汁ABTS阳离子自由基清除能力达到最高,为1 216.67 μmol/L,与短乳杆菌B7-8的ABTS阳离子自由基清除能力近似;而植物乳植杆菌M2发酵枇杷汁ABTS阳离子自由基清除能力与第0天相比明显下降,仅为第0天的12%。植物乳植杆菌M2发酵枇杷汁的自由基清除能力变化与李慧等[18]报道类似。
2.6 发酵枇杷汁代谢组分析
2.6.1 三种发酵枇杷汁代谢产物概况
3种枇杷汁在正、负离子模式下共检测到15 815个峰,其中正离子模式下9 503种,负离子模式下6 302种。KEGG数据库和人类代谢组数据库(human metabolome database, HMDB)注释到代谢产物409种,可分为14类(图6),其中有机酸及其衍生物种类最多(93种),其次为脂质和类脂质分子(85种)和有机杂环化合物(69种)。
图6 发酵枇杷汁代谢物分类及占比
Fig.6 Classification and percentage of metabolites in fermented loquat juice
2.6.2 三种枇杷汁代谢产物比较分析
2.6.2.1 主成分分析(principal component analysis,PCA)
采用PCA法分析不同乳酸菌发酵枇杷汁的代谢差异。如图7所示,第一和第二主成分分别占总变量的25.4%和22.2%。3种枇杷汁样本点组内较聚集,表明样本组内重复性较好,差异较小;组间分散且距离较远,表明3种枇杷汁在代谢产物组成上存在显著差异。
A-副干酪乳酪杆菌J1;B-植物乳植杆菌M2;C-短乳杆菌B7-8
图7 不同乳酸菌发酵枇杷汁的PCA得分散点图
Fig.7 Scatter plot of PCA scores of loquat juice fermented by three different lactic acid bacteria
2.6.2.2 差异代谢产物分析
筛选3种枇杷汁中的差异显著代谢物(VIP>1,P<0.05),经比较分析发现副干酪乳酪杆菌J1与植物乳植杆菌M2间存在900种差异代谢物,其中521种代谢物上调、379种代谢物下调;副干酪乳酪杆菌J1与短乳杆菌B7-8间存在782种差异代谢物,374种上调,408种下调;植物乳植杆菌M2与短乳杆菌B7-8间存在1 099种差异代谢物,其中457种代谢物上调、642种代谢物下调。对相对含量高且能被HMDB数据库注释到的各样品差异代谢物进行热图分析(图8),结果表明不同枇杷汁间存在显著差异,且差异代谢产物主要集中在氨基酸、脂肪酸、有机杂环化合物等,这些化合物对发酵枇杷汁的品质至关重要。
A-副干酪乳酪杆菌J1;B-植物乳植杆菌M2;C-短乳杆菌B7-8
图8 差异代谢物热图分析
Fig.8 Heatmap of differential metabolites
在氨基酸中,N-乙酰-L-谷氨酰胺、瓜氨酸和N-乙酰-L-天门冬氨酸是短乳杆菌B7-8发酵枇杷汁的特征代谢氨基酸,其含量为副干酪乳酪杆菌J1、植物乳植杆菌M2发酵组的8.22～32.29倍。研究发现发酵乳杆菌、植物乳植杆菌、短乳杆菌可以通过精氨酸脱亚胺酶途径产生瓜氨酸[19]。瓜氨酸已被证明对治疗心力衰竭、动脉硬化和老年人肌肉减少症具有重要作用[20]。此外,副干酪乳酪杆菌J1发酵枇杷汁中D-天门冬氨酸含量为植物乳植杆菌M2和短乳杆菌B7-8发酵组的1.81～10.20倍,D-天门冬氨酸在神经和内分泌组织中起着至关重要的作用,且会对食物的风味产生影响[21]。
脂质和类脂质分子在枇杷汁代谢产物中占比第二。与副干酪乳酪杆菌J1相比,植物乳植杆菌M2发酵枇杷汁中4-三甲基氨基丁酸显著上调(13.36倍)。同时,在植物乳植杆菌M2组的差异代谢物中,脂质和类脂质分子的含量高于其他两组,这表明植物乳植杆菌能代谢产生的脂类物质更多[10]。
有机杂环化合物中,胞嘧啶和次黄嘌呤是变化最大的2种化合物。短乳杆菌B7-8发酵枇杷汁中次黄嘌呤的相对含量分别为植物乳植杆菌M2、副干酪乳酪杆菌J1组的303.38倍、14.89倍。此外,部分糖类物质如麦芽四糖,在副干酪乳酪杆菌J1和短乳杆菌B7-8发酵组中含量增加。麦芽四糖是由α-1,4糖苷键连接的葡萄糖四聚体,一般是由麦芽四糖淀粉酶水解淀粉而来,属于低聚麦芽糖中的直链低聚麦芽糖,集营养、保健、食疗等功能于一体,被誉为最有前景的低聚麦芽糖。D-木酮糖在短乳杆菌B7-8组中的相对含量为植物乳植杆菌M2和副干酪乳酪杆菌J1组的5.65～6.48倍,糖类代谢物的差异,可能与不同菌株代谢产生的酶活性高低相关。
3 结论与讨论
本研究利用3种不同的内源乳酸菌对枇杷汁进行接种发酵,对比了发酵过程中基本指标以及发酵结束时代谢产物的差异,结果发现植物乳植杆菌M2、副干酪乳酪杆菌J1和短乳杆菌B7-8均能较好适应枇杷汁基质,其中副干酪乳酪杆菌J1和短乳杆菌B7-8生长能力更强,但两者产酸能力均弱于植物乳植杆菌M2。发酵过程中不同乳酸菌发酵枇杷汁总酚含量和抗氧化活性差异明显。非靶向代谢组学分析表明3种枇杷汁在代谢产物组成上存在显著差异,且差异代谢产物主要集中在氨基酸、脂肪酸、有机杂环化合物等。考虑到发酵结束时乳酸菌活菌数、总酚含量以及DPPH自由基和ABTS阳离子自由基清除能力,副干酪乳酪杆菌J1发酵枇杷汁具有一定优势。本研究重点关注不同乳酸菌发酵对枇杷汁基础理化特性、抗氧化性和代谢产物的影响,未来可考虑不同乳酸菌或乳酸菌与非酿酒酵母、醋酸菌等的复合发酵,并关注发酵枇杷汁的色泽、风味和感官等特性。本研究的开展可为乳酸菌发酵枇杷汁产品的开发提供理论参考。
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