不同地区红花椒果皮的苦味物质分析

花椒(Zanthoxylum bungeanum),芸香科花椒属植物,是我国“八大调味品”之一。花椒因麻感强烈,香气独特,常被用于各地菜肴和食品加工中[1]。根据果皮颜色的不同,花椒可分为红花椒(Zanthoxylum bungeanum Maxim.)和青花椒(Zanthoxylum schinifolium Sieb.et Zucc),但花椒食用过程中的苦味引起食品工业的重视。

根据前人研究,花椒果皮中的苦味物质已被分离鉴定。2020年,KE等[2]从红花椒中分离鉴定出7-甲氧基香豆素和8-异戊烯基山奈酚2种苦味物质,并发现它们能激活苦味受体hTAS2R14。非靶向代谢组学可对检测样本进行全面检测后确定差异代谢物[3],通过非靶向代谢组学和感官引导的分离分析技术,课题组梅小飞[4]从红花椒中分离鉴定出15种苦味物质。2022年,YANG等[5]确定青花椒13种苦味物质,其中槲皮素、异鼠李素、山奈酚是苦味重要贡献物质。HUANG等[6]组合出青花椒果皮苦味物质生物合成途径。我国花椒产地分布范围广,青花椒主要分布于云南、四川、重庆等地[7],红花椒主要分布于甘肃、陕西、山东等地[8]。花椒种植地区气候条件不同,花椒品质会存在差异[9],但对于苦味品质的影响还尚未展开研究。相比于青花椒,红花椒种植面积和产量相对较高[10],确定红花椒中的苦味物质含量及对不同地区间含量进行比较,成为花椒产业亟待解决的问题。多元统计方法在食品风味分析中广泛应用[11],本研究采用此分析方法可对不同地区红花椒果皮的苦味物质进行差异分析。

因此,本研究以20种不同地区红花椒果皮为研究对象,采用HPLC和氨基酸自动分析仪定量红花椒果皮苦味物质,并结合聚类分析(hierarchical cluster analysis, HCA)、偏最小二乘判别分析(partial least squares discrimination anlysis, PLS-DA)进行含量分析,比较不同地区间苦味物质含量差异和寻找不同类别间关键苦味物质。本研究可为花椒苦味评价提供数据参考和理论基础,促进红花椒的深度开发。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

红花椒均产自原地区农户花椒种植基地,于2021年7～9月采收,花椒编号及地区如表1所示。对20个地区红花椒去籽、去杆,粉碎后过40目筛,贮藏于-80 ℃。色谱级甲醇、乙腈、甲酸,上海麦克林生化科技有限公司;苦味物质标准品(类别及纯度见表2),四川成都麦德生科技有限公司;其他分析级试剂均来自实验室常用试剂。

1.2 仪器与设备

YF-111B中药材粉碎机,西安永历制药机械有限公司;Agilent 1290高效液相色谱仪,美国Agilent公司;L-8900全自动氨基酸分析仪,日本日立公司;FA2004分析天平(感量0.000 1 g),上海精密科学仪器有限公司;DHG-9240超声清洗机,上海一恒科技有限公司;PHS-3E pH计,上海仪电科学仪器有限公司;5810台式高速离心机,德国Eppendorf公司;R-215旋转蒸发仪,瑞士Buchi公司。

1.3 实验方法

根据课题组的前期研究,对红花椒苦味物质(表2)进行含量测定。

1.3.1 红花椒果皮中氨基酸含量测定

参照HUANG等[6]的研究,红花椒果皮用粉碎机粉碎后过40目筛,称取花椒果皮粉末0.5 g,加入质量浓度40 g/L的磺基水杨酸溶液10 mL,混匀后4 ℃静置15 h,最后6 000 r/min离心10 min,采用全自动氨基酸分析仪进行含量测定。

1.3.2 红花椒果皮中酚类含量测定

参照YANG等[5]的研究,红花椒果皮用粉碎机粉碎后过40目筛,称取花椒果皮粉末0.5 g,加入提取液10 mL(水、甲醇、二甲基亚砜体积比为1∶4∶5),于360 W、25 ℃超声提取80 min。提取液用酸或碱调至pH值为2.0后用10 mL乙醚和乙酸乙酯混合液萃取3次,收集有机层先获得游离酚;水层碱解、萃取,收集有机层获得酯型结合酚;剩余水层最后酸解、萃取,收集有机层获得糖苷型结合酚(碱解和酸解均需添加10 mmol/L的EDTA-Na2和10 g/L抗坏血酸)。所有有机层旋转蒸发至干后均用甲醇定容至1 mL,采用HPLC进行含量测定,色谱条件参考文献[5]。

1.3.3 红花椒果皮中生物碱含量测定

1.3.3.1 红花椒果皮中木兰花碱含量测定

参照YANG等[5]的研究,红花椒果皮用粉碎机粉碎后过40目筛,称取花椒果皮粉末2 g,加入3 mL浓氨水碱化30 min,后加入50 mL异丙醇和乙酸乙酯混合液(体积比1∶1),于300 W、25 ℃超声提取60 min。滤液旋转蒸发至干后用甲醇定容至1 mL,采用HPLC进行含量测定,色谱条件参考文献[5]。

1.3.3.2 红花椒果皮中小檗碱含量测定

参照赵奕彭[12]、JIANG等[13]的研究并作适当修改,红花椒果皮用粉碎机粉碎后过40目筛,称取花椒果皮粉末0.5 g,加入体积分数为75%甲醇20 mL,于240 W、50 ℃超声提取30 min。后置于4 ℃下1 h浸提,滤液旋转蒸发至干后先用体积分数为2%HCl溶液10 mL溶解,后用浓氨水调节pH值至9～10,最后用10 mL水饱和正丁醇反复萃取3次富集小檗碱。收集有机层旋转蒸发至干后用甲醇定容至1 mL,采用HPLC进行含量测定,色谱条件参考文献[5]。

1.3.4 红花椒果皮中腺苷含量测定

参照陈彦林[14]的研究并做适当修改,红花椒果皮用粉碎机粉碎后过40目筛,称取花椒果皮粉末0.5 g,加入体积分数为50%乙醇溶液30 mL,于360 W、60 ℃超声避光提取1 h。滤液旋转蒸发至干后先用10 mL水溶解,后分别用10 mL石油醚、乙酸乙酯萃取,最后水层用10 mL水饱和正丁醇萃取富集腺苷。有机层旋转蒸发至干用50%甲醇溶液定容至1 mL,色谱条件为色谱柱Agilent ZORBAX SB-Aq C18柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);流动相:A相,水溶液(含体积分数为0.1%甲酸),B相,甲醇;进样量10 μL;柱温35 ℃;检测波长260 nm;流速1 mL/min;洗脱程序0～15 min, 95%A;15～25 min, 85%A;25～35 min,50%A;35～50 min, 95%A。

1.4 结果计算

称取适量红花椒果皮苦味物质(表2)标准品后,溶解于和样品相同的溶剂中,并稀释制成不同浓度梯度的标准溶液。在上述测定条件下绘制单标标准曲线。样品中苦味物质含量(X)以毫克每克(mg/g)表示,按公式(1)计算:

式中:X,红花椒果皮苦味物质含量,mg/g;ρ,利用标准曲线求出的供试品溶液的苦味物质质量浓度,μg/mL;V,供试品溶液定容体积,mL;m,红花椒果皮质量,g。

1.5 数据处理与分析

本研究所有实验数据除特别说明外,均由3次平行测定,以平均值±标准偏差表示。利用SPSS 25进行数据分析,Origin 2021和Metaboanalyst 6.0进行图表绘制。

2 结果与分析

2.1 红花椒果皮氨基酸类苦味物质的含量分析

氨基酸在滋味感知中具有重要作用,当含量低于阈值时也可与其他物质互作增强滋味感知[15]。由表3可知,在前期鉴定的3种氨基酸类苦味物质(缬氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸)中,异亮氨酸在20个地区的含量相较于其他2种氨基酸较低,且各个地区间含量差异较小(P<0.05)。缬氨酸含量为0.074 mg/g(H3甘肃临夏)～0.198 mg/g(H20湖南张家界),异亮氨基酸含量为0.013 mg/g(H18山西平顺)～0.084 mg/g(H20湖南张家界)。苯丙氨酸在H3甘肃临夏和H5云南丽江中含量最低(0.063 mg/g),在H12河南太行山中含量最高(0.143 mg/g)。

2.2 红花椒果皮酚类苦味物质的含量分析

植物中酚类物质种类多、含量高,已有多种酚类物质被推测和鉴定为植物苦味的来源[16]。8种酚类苦味物质番石榴苷、槲皮苷、异槲皮苷、槲皮素、异鼠李素、熊果苷、水杨酸、芥子酸在20个地区均有分布,水杨酸和芥子酸在大部分地区的含量相较于其他酚类物质较低,槲皮素和熊果苷含量较高;各个地区间槲皮苷含量差异较大,槲皮素含量差异较小(P<0.05)。红花椒果皮番石榴苷含量为0.126 mg/g(H20湖南张家界)～0.734 mg/g(H18山西平顺)。槲皮苷在H6云南大理和H7四川凉山中含量最低(0.234 mg/g),在H4云南昭通中含量最高(1.460 mg/g)。在HUANG等[6]和YANG等[5]的报道中,异槲皮苷、槲皮素、异鼠李素作为青花椒的关键苦味物质,对苦味有重要贡献。在红花椒果皮中异槲皮苷含量为0.145 mg/g(H20湖南张家界)～1.285 mg/g(H7四川凉山),槲皮素含量为0.127 mg/g(H7四川凉山)～1.200 mg/g(H6云南大理)。异鼠李素和番石榴苷最低、最高含量分布地区一致,在H20湖南张家界中含量最低(0.195 mg/g),在H18山西平顺中含量最高(1.353 mg/g)。熊果苷为含量较高的苦味物质,含量为0.451 mg/g(H6云南大理)～1.918 mg/g(H18山西平顺)。水杨酸作为苦味物质的前体或副产物在柑橘[17]等植物中积累,芥子酸的降解产物芥子碱苦味强度高,水解后仍具有较强苦味[18]。水杨酸和芥子酸在大部分地区含量低于0.2 mg/g。值得注意的是湖北恩施的水杨酸含量较高,为0.548 mg/g,原因可能是恩施土壤硒元素含量高,花椒植物激素含量增加来提高其硒耐受能力[19]。

2.3 红花椒果皮生物碱类苦味物质的含量分析

生物碱在花椒属植物中普遍存在,木兰花碱大量存在于花椒属植物的根、茎中[20],其在花椒果皮中的研究较少。由表3可知,木兰花碱在H20湖南张家界中含量最低(0.007 mg/g),在H16贵州毕节中含量最高(0.071 mg/g)。小檗碱属于季铵型异喹啉类生物碱,此类生物碱常存在于黄连等药用植物中[21]。红花椒果皮中小檗碱含量较低,且大部分地区小檗碱含量低于木兰花碱和其他类苦味物质。小檗碱在H3甘肃临夏中含量最低(0.009 mg/g),在H18山西平顺中含量最高(0.032 mg/g)。

2.4 红花椒果皮苦味物质腺苷的含量分析

腺苷属于核苷酸类物质,该类物质代谢过程中会产生呈苦味的中间产物[22]。由表3可知,腺苷在H9四川茂汶和H14山东山亭中含量最低(0.028 mg/g),在H18山西平顺中含量最高(0.053 mg/g)。本研究采用分级萃取和水饱和正丁醇富集腺苷,可有效测得腺苷的最大含量[14]。

花椒苦味物质是植物中常见次级代谢物,它们可在植物抵御危害因素时产生[23]。有研究表明遗传因素、营养水平和环境条件等会对其含量产生影响[24]。综合来看,不同地区红花椒果皮苦味物质含量存在差异,红花椒果皮含有的酚类苦味物质不仅种类多,含量占比也高,大部分地区槲皮素和熊果苷是主要的苦味物质。此外,多种苦味物质含量在H20湖南张家界地区含量偏低,在H18山西平顺地区偏高,不同地区红花椒果皮的苦味物质含量差异值得深入研究。

2.5 聚类分析

为了更好地可视化不同地区红花椒果皮的苦味物质含量差异,采用系统聚类对不同地区红花椒果皮苦味物质含量进行分析。如图1所示,在欧式距离平方为12.5处可聚为五类,能有效对20个不同地区红花椒果皮进行类别分析。H1(甘肃武都)、H2(甘肃天水)、H3(甘肃临夏)、H5(云南丽江)、H6(云南大理)、H9(四川茂汶)、H10(陕西韩城)、H12(河南太行山)和H15(山东莱芜)聚为A类。该类聚集红花椒果皮大部分地区,表明果皮苦味物质含量及组成较为一致。H4(云南昭通)、H8(四川汉源)、H11(陕西凤县)、H13(河南林州)、H16(贵州毕节)、H17(河北涉县)和H19(湖北恩施)聚为B类。H14(山东山亭)、H20(湖南张家界)2个地区聚为C类。H18(山西平顺)和H7(四川凉山)地区分别独自聚为一类,可能是因为它们独特的自然环境导致其苦味物质等植物代谢物含量与其他地区不同[23]。

2.6 PLS-DA分析

PLS-DA分析是一种有监督的判别分析统计方法,在食品分析中被广泛应用于探究不同类别或不同地区风味物质差异,通过变量重要性投影值(variable importance in project, VIP)可以判断风味物质对判别分类的重要性。一般认为,VIP值>1时,该物质在分类判别过程中具有重要作用[25]。因此,利用系统聚类的分类结果和PLS-DA分析筛选不同类别红花椒果皮的关键差异苦味物质。为了检验PLS-DA模型是否出现过拟合,对模型参数进行评估。模型拟合优度R2为0.903,预测优度Q2为0.877,2个值均接近1;对模型进行置换检验,P<0.05,所构建模型具有较好的解释能力和预测能力。由图3可知,异槲皮苷、槲皮素、异鼠李素的VIP值>1,说明这3种苦味物质是不同类别红花椒果皮的关键差异苦味物质。YANG等[5]和HUANG等[6]对青花椒果皮苦味物质进行定量,发现异槲皮苷、槲皮素和异鼠李素的滋味活度值(taste active value, TAV)较高,对青花椒果皮苦味具有重要贡献。

结合表3和图2发现聚为A类的9个地区槲皮素含量较高,聚为B类的7个地区3种苦味物质含量均较高。聚为C类的H14(山东山亭)和H20(湖南张家界)地区3种苦味物质含量均较低。说明这2个地区和A、B两类地区间苦味强度可能存在差异。H18(山西平顺)和H7(四川凉山)地区有2种苦味物质含量偏高或偏低独自聚为一类。通过PLS-DA分析结合VIP值共筛选出3种不同类别红花椒果皮关键差异苦味物质:异槲皮苷、槲皮素和异鼠李素。这3种苦味物质可作为区分以上五类红花椒果皮地区的关键差异苦味物质。

3 结论

本研究对20个不同地区红花椒果皮的苦味物质进行定量检测和分析,结果表明,红花椒果皮苦味物质在20个地区均有分布,大部分地区槲皮素和熊果苷含量较高,氨基酸、酚酸、生物碱、腺苷含量较低。槲皮素含量为0.127～1.200 mg/g,熊果苷含量为0.451～1.918 mg/g。进一步利用聚类分析可将20个地区聚为五类,异槲皮苷、槲皮素和异鼠李素是不同类别红花椒果皮的关键差异苦味物质。本研究结果为红花椒果皮苦味质量控制研究等方面提供一定的数据基础,可促进红花椒果皮的深度开发利用。后续可感官评价不同地区花椒果皮苦味强度,深度分析红花椒果皮苦味差异。

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