白兰地是世界著名的蒸馏酒之一,其独特之处在于,白兰地以葡萄为原料,经过发酵﹑蒸馏﹑橡木桶陈酿而成,这个过程也赋予了白兰地独特且复杂的香气特点[1]。目前已从白兰地中检测出数百种香气物质,包括醇类、芳香族、酚类、呋喃类、醛类、酸类、萜烯类、酯类、酮类等[2]。虽然香气物质在白兰地中所占比例仅仅只有1%左右[3],但它们决定着白兰地的风格特点和质量表现。
目前,针对白兰地香气国外已开展了较为深入的研究,如法国[4-6]、德国[7]等,国内对于白兰地香气的研究也在逐步展开[8-10],对于不同陈酿时间白兰地的香气研究已经取得了一些进展。陈酿对于白兰地风味的形成非常重要,在白兰地最终品质上起着至关重要的的作用[11],也是白兰地风味研究的一个热点。如WATTS等[12]对白兰地酒龄与风味之间的关联进行研究,利用顶空固相微萃取(headspace solid-phase microextraction, HS-SPME)结合GC-MS技术对不同样品的挥发性成分进行分析,结合偏最小二乘法(partial least squares, PLS)建立模型,通过17种挥发性物质(13种乙酯,4种甲基酮)可以进行酒龄预测;刘钰浩等[13]采用代谢组学思路结合正交偏最小二乘判别分析(orthogonal partial least squares-discriminant analysis, OPLS-DA),以变量投影重要性为依据,筛选出白兰地中的不挥发差异代谢物并将其绘制热图,结果表明这些差异物的含量变化会受到陈酿时间影响;何欢等[14]以不同陈酿过程中白兰地的风味物质变化为依据,论述了陈酿对挥发性、非挥发性物质的影响,结果表明在白兰地陈酿过程中,各物质会随着陈酿时间延长而变化。前期研究表明陈酿对白兰地风味的形成非常重要,白兰地的风味在橡木桶中随着贮存时间的延长不断发生变化,但不同陈酿时间对白兰地香气的具体影响和变化规律还尚未有系统研究。
因此,本研究采用HS-SPME结合全二维气相色谱质谱联用(headspace solid-phase microextraction with comprehensive two-dimensional gas chromatography/time-of-flight mass spectrometry, HS-SPME-GC×GC-TOFMS)技术,以不同陈酿时间白兰地原酒为研究对象,较为系统地分析了不同陈酿时间对白兰地中香气特征物质组分的影响。研究不仅可以丰富白兰地风味化学的理论体系,同时也为国内白兰地生产中的风味调控提供数据基础与理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 样品
实验样品使用了9款不同陈酿时间的白兰地原酒,采用相同生产工艺并存贮于法国利穆森中度烘烤橡木桶中,所有样品均由烟台张裕集团提供。每个陈酿时间3瓶,具体样品信息和编号见表1。
表1 不同陈酿时间白兰地原酒样品信息
Table 1 Information on brandy raw wine samples of different aging time
样品编号陈酿时间/年酒精度/(%vol)品种0Y072.0白玉霓1Y172.5白玉霓2Y272.8白玉霓3Y373.0白玉霓4Y456.9白玉霓7Y756.9白玉霓10Y1060.5白玉霓16Y1655.4白玉霓18Y1849.5白玉霓
1.1.2 试剂
分析级别氯化钠(NaCl),上海国药集团;色谱级别氘代正己醇、愈创木酚-D3、乙酸苯乙酯-D3、C6～C40正构烷烃,Sigma-Aldrich公司;超纯水,Milli-Q系统净化(美国Merck Millipore)。
1.2 仪器与设备
Agilent 7890 N-Pegasus 4D全二维气相色谱-飞行时间质谱仪,美国Agilent和美国Leco公司;MPS多功能自动进样系统,德国Geststel公司;DB-FFAP毛细管柱(60 m×0.25 mm×0.25 μm),美国Agilent公司;Rx-17 Si毛细管柱(1.5 m×0.25 mm×0.25 μm),美国Restek公司;2 cm 50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取头固相微萃取三相头,美国Supelco公司。
1.3 实验方法
1.3.1 HS-SPME方法
参考实验室之前建立的方法并略作修改[2],将白兰地原酒稀释到5%vol酒精度,吸取5 mL稀释后的样品到20 mL的顶空样品瓶中,随后加入1.5 g氯化钠、50 μL同位素混合内标。同位素混合内标中含有23.25 mg/L的氘代正己醇,20.88 mg/L的愈创木酚-D3,20.40 mg/L的乙酸苯乙酯-D3。萃取过程实验条件如下:萃取头固相微萃取三相头,萃取温度50 ℃,转速400 r/min,平衡时间5 min,萃取时间45 min。提取后,将萃取头置于GC入口,于250 ℃下进行5 min的解吸附。由MPS2系统完成HS-SPME自动进样,每个样品进行3次重复。
1.3.2 GC×GC-TOFMS仪器条件设置
GC×GC气相色谱烘箱的温度实验参数条件:起始温度45 ℃保持3 min,以4 ℃/min的加热频率升温至150 ℃并在150 ℃保持2 min,再以6 ℃/min的频率升温至200 ℃,最后以10 ℃/min的频率升温至230 ℃并在230 ℃下保持10 min。升温过程全程保持二级烘箱的温度比一维烘箱温度高5 ℃。调制周期为4 s(热脉冲时间为0.8 s),设置补偿温度为20 ℃。使用高纯度的氦气作为载体气体(纯度>99.999 5%),设置气体的流速为1 mL/min。
TOF/MS条件:离子源和检测器的电压分别设置为70 eV和1 430 V,温度为230 ℃,传输线温度设置为240 ℃,以100 spectra/s采集频率收集质谱信息,质量数范围35～400 amu。
1.3.3 GC×GC-TOFMS数据处理方法
定性:实验采集的数据在软件Chroma TOF(Leco)处理。自动识别色谱峰(信噪比>200),并解卷积后与质谱库(NIST 2014和Wiley 9)比对。选择相似度≥700且3个重复样品中至少出现2次的色谱峰作为样品中存在的组分。进一步采用保留指数(retention index, RI)比对,通过同条件下进样的正构烷烃(C6～C40)和样品中化合物的出峰时间的对比,自动计算每个化合物的保留指数,将这些化合物的保留指数与文献中保留指数的对比分析,最终筛选出保留指数相差50以内的化合物,作为定性结果。半定量的计算如公式(1)所示:
化合物质量浓度
(1)
1.4 数据分析
使用IBM SPSS Statistics 22.0进行单因素方差检验,主成分分析(principal components analysis, PCA)由SIMCA14.1(MSK Data Analytics Solutions)完成,通过在线网站https://www.bioinformatics.com.cn绘制热图。
2 结果与分析
2.1 不同酒龄白兰地原酒中挥发性化合物鉴定
采用HS-SPME-GC×GC-TOFMS鉴定了9款不同酒龄白兰地样品的挥发性化合物。结果显示,在白兰地酒样中共检测出530种挥发性化合物。值得注意的是,不同样品之间的挥发性化合物种类有所不同(表2)。在未经陈酿白兰地中;其挥发性化合物种类总数最少,而在陈酿18年的样品中,其种类总数最多。挥发性化合物种类随着陈酿时间的延长呈现逐渐增加的趋势。
表2 不同陈酿时间下挥发性化合物的种类数
Table 2 Types of volatile compounds under different aging times
样品0Y1Y2Y3Y4Y7Y10Y16Y18Y酯类668286809090929298醇类545347534949454650醛类363745454137373941萜烯类323135332624282626酮类181714171613162321芳香族172120272527233027酚类111310101210131212呋喃类111413151617151615酸类101114121414131513其他类666657677含硫化合物867435334含氮化合物300111011内酯类222322213烃类100000010总计275293299306300296293312318
鉴定到的挥发性化合物可根据结构特征分为14类:酯类、醇类、酸类、醛类、酮类、烃类、呋喃类、含氮化合物、含硫化合物、酚类、萜烯类、内酯类、芳香族、其他。酯类物质是白兰地中检测到的种类数最多的一类化合物,其次是醇类、醛类,这与赵玉平等[15]的研究结果相一致。在此外,陈酿时间18年的白兰地样品中的挥发性化合物种类最多(318种),陈酿时间0年的白兰地样品中的挥发性化合物种类最少(275种),整体上挥发性化合物表现出随着陈酿时间的延长而增多的趋势。
酯类化合物中,白兰地中发现了直链酯、支链酯、不饱和酯等,大部分化合物主要呈现出果香、花香的感官特征[2]。并且随着陈酿时间的延长,白兰地样品酯类物质的种类数逐渐增多,可能是由于陈酿过程中由酸类与醇类不断发生酯化反应导致的[11]。醇类化合物是组成白兰地香气的重要成分之一,由微生物在发酵过程中经分解代谢与合成代谢生成[16],其香气特征大都被描述为果香、醇香[17-18]。相较于未陈酿的白兰地,陈酿过的白兰地中的醇类种类数不断减少。这些挥发性化合物种类数在不同酒龄白兰地中处于波动变化。这可能归因于陈酿过程中发生的各种物理化学变化速度不同,如氧化还原反应、酯化反应、缩合反应、挥发作用以及橡木桶物质浸出[14]。
2.2 不同酒龄白兰地原酒中香气化合物
风味领域研究中,本研究更关注具有香气特征的化合物,因此对HS-SPME-GC×GC-TOFMS定性的530种挥发性化合物进行分析,通过比对Flavor DB (https://cosylab.iiitd.edu.in/flavordb/)和Flavornet Home (http://www.flavornet.org/index.html)2个香气数据库,筛选得到381种具有香气特征的挥发性化合物,包含酯类97种、醇类63种、醛类50种、萜烯类43种、酮类26种、芳香族21种、酸类19种、呋喃类18种、酚类16种、含硫化合物14种、内酯类4种、含氮化合物4种、其他化合物6种。通过内标物质计算,得到381种具有香气特征的挥发性化合物的半定量结果(附表1,https://doi.org/10.13995/j.cnki11-1802/ts.039068)。
为了进一步探究各类别香气组分随陈酿时间延长的变化规律,计算了不同年份酒样中各大类相对总含量(图1)。从图中可以看出,不同陈酿时间白兰地的香气化合物差异不仅体现在其种类上,还与其含量有关。通过对比可知,不同陈酿年数白兰地酒样中的香气化合物均以酯类、酸类、醇类等为主,但同一类化合物成分的数量和含量在不同陈酿时间酒样中存在明显差异。在所有白兰地酒样中,酯类化合物的含量在贮存2年达到最高(83 052.5 μg/L),3年时快速下降,随后又逐渐增高一直到贮存16年,随后又快速下降。醇类化合物含量总体呈下降趋势,贮存1年的酒样含量最高(32 196.1 μg/L),随后逐渐减低,推测醇类物质与酸类物质不断发生酯化反应导致含量不断下降。酸类化合物呈现先上升后下降随后又上升的趋势,酸类物质一方面会因为醇酸酯化导致含量降低,另一方面会从橡木桶中不断提取[19-20];醛类化合物、萜烯类化合物、含硫化合物含量都是随陈酿时间延长也显著下降,特别是可能会表现一些异味的含硫化合物和醛类化合物,随着陈酿时间的延长含量不断降低,白兰地的品质逐渐提高。白兰地的醛类物质主要来源于酵母,其中最主要的就是表现为辛辣、刺激香气的乙醛,并且在蒸馏过程中通常难以分离被带入最终酒液中。但是醛类物质会在橡木桶陈酿过程中会与醇类物质反应生成缩醛,同时乙醛也会不断发生氧化变为乙酸,因此其含量会随着贮存时间的延长而不断降低[21]。
图1 不同陈酿时间各类别香气化合物的含量变化
Fig.1 Changes in the content of aroma compounds of different categories under different aging times
2.3 不同陈酿时间白兰地香气化合物的主成分分析
为了进一步明晰不同酒龄白兰地之间的感官特征差异,将筛选出的381种香气化合物进行PCA分析。图2可以看出,不同年份酒样随酒龄呈现趋势性变化。依据其香气化合物组成相似程度,可将样品大致分为四类:未经陈酿白兰地(0年)单独聚为一类,分布在第三象限;陈酿时间为1、2、3年的白兰地聚为一类,分布于第二象限;4、7、10年聚为一类,分布于原点附近;16、18聚为一类,分布于第四象限。值得注意的是,单独分布在第三象限的未经陈酿的白兰地(0年),与经橡木桶陈酿的白兰地有极大差异,说明经橡木桶陈酿的白兰地会显著改变白兰地香气物质种类和含量。且在陈酿期间,初期(0～1年)香气化合物变化非常大,可能是因为在陈酿前期橡木桶中可萃取挥发性化合物快速浸提,1到3年期间、4到10年期间以及16到18年期间香气化合物变化较小。不同酒龄白兰地之间其香气化合物的组成和含量具有明显不同。
图2 不同陈酿时间白兰地原酒香气化合物的PCA图
Fig.2 PCA diagram of aroma compounds in brandy raw wine at different aging times
2.4 不同陈酿时间白兰地香气化合物的聚类热图分析
为进一步明确香气化合物在不同年份白兰地中的差异,首先对381种香气化合物进行单因素方差分析(ANOVA),从中筛选出具有显著差异(P<0.05)的268种香气化合物。在筛选出的香气物质中,进一步按照酒鼻子(Le Nez du Vin)中的香气类型对物质进行归类分析,分别为水果类、花卉类、植物类、香料类、动物类和烘焙类,分别绘制热图(图3)。
A-果香;B-花卉;C-植物;D-香料;E-动物;F-烘焙
图3 白兰地的显著性热图分析和HCA聚类分析
Fig.3 Significant heatmap analysis and HCA clustering analysis of brandy
热图的颜色变化可以很好得表征化合物含量的大小。由图3可知,不同香气类型在不同年份白兰地酒中,所含化合物类型具有显著差异且含量随着陈酿时间延长而发生变化。
水果香气主要是酯类化合物(图3-A),发现异戊酸异戊酯、丙酸异丁酯、戊酸乙酯、庚酸乙酯、乙酰丙酸乙酯等酯类以及2-戊酰呋喃、2-呋喃丙烯醛等少量呋喃类化合物的含量,随着陈酿时间延长有上升的趋势,并在10年及以上表现出较高值。有研究报道,作为白兰地主体香的乙酸乙酯,其含量会随着橡木桶贮存时间的延长不断上升,本研究结果也与之相一致[11]。此外,在课题组先前的研究中,首次在气相色谱-嗅味计闻香中发现表现为甜水果香气特征的乙酰丙酸乙酯[22],在本研究也是发现此物质含量会随着橡木桶贮存时间的延长而不断增加,后续可以进一步其来源以及合成途径的相关研究。
花香香气物质主要因带苯环的乙酯类化合物以及某些萜烯类化合物存在(图3-B),从图中可以看出,相对含量比较高的乙酸苯乙酯以及萜烯中的大马酮、香茅醇、香叶醇等含量都是随贮存时间的延长不断降低。表现植物类香气的主要有醇类化合物、萜烯类化合物等(图3-C),大部分醇类化合物含量也是随着贮存时间的延长不断降低。在橡木桶贮存过程中,由于橡木桶的微氧作用,醇会氧化成醛,醛进一步氧化成酸,导致一些醇类物质含量的降低而酸不断增加。同时醇、酸还会发生酯化作用,使醇含量进一步降低[23]。香料类香气(图3-D)中比较重要的物质有香草醛,其含量随着贮存时间的延长而不断增加。香草醛主要来自于橡木桶,是橡木中木质素的降解产物,橡木桶在制桶过程中的烘烤有利于这类物质的形成[24],在贮存过程中白兰地不断将桶中的香草醛浸提到酒中,从而使其含量不断升高,也给白兰地带来香草的香气特征。动物类香气(图3-E)在白兰地中主要就是呈现奶油香气特征的化合物,相对含量较高的2-戊基呋喃含量会随着橡木桶贮存时间的延长不断增加。烘焙类(图3-F)也是白兰地中一类比较重要的香气,主要包括表现烟熏香气的挥发酚,以及表现焦糖、烘烤香气特征的呋喃类化合物。其中在白兰地中比较重要的香气4-甲基愈创木酚、4-乙基愈创木酚、糠醛、5-羟甲基糠醛含量都是随着时间延长呈升高趋势。通常这些物这与白兰地的陈酿年份密切相关,白兰地陈酿时间越久,与橡木接触的时间就越长,其含量也就越高[25]。
3 结论
本研究利用HS-SPME-GC×GC-TOFMS在9种不同陈酿时间白兰地原酒中共定性出495种挥发性化合物,其中陈酿0年样品中的挥发性化合物种类最少(275种),陈酿18年最多(318种)。通过与香气数据库Flavornet和Flavor DB比对,共明确出381种具有香气特征的香气物质。通过PCA分析,发现不同年份酒样随酒龄呈趋势性变化,其中在陈酿初期(0～1年)香气化合物变化非常大。基于单因素方差分析,共筛出268个差异代谢物,其中呈现果香、香料、烘培等香气特征的化合物在陈年酒中更为突出,而呈现花香、植物香气特征的化合物含量普遍随贮存时间延长而不断降低。
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