水产品中药物残留前处理及检测方法研究进展

水产品是海洋和淡水渔业生产的水产动植物产品及其加工产品的总称。它具有良好的营养价值,特别是维生素、矿物质和多不饱和脂肪酸等,是合理膳食结构中不可缺少的组成部分。中国是渔业大国,水产养殖水域广阔,鱼类产量丰富,我国居民生活水平的不断提升使消费结构不断优化和改善,水产品在膳食结构中的比重不断增加,需求的持续增长推动我国水产品总产量的不断提升[1-2]。近年来,农业农村部在对全国各地水产品进行抽检时,合格率虽基本都在97%以上[3],但还是存在一定的安全风险,比如福建[4]、嘉兴[5]、大连[6]和新疆[7]等地。究其原因,农兽药残留超标及含有违禁药物是影响水产品质量安全的最大隐患,这些违禁药包括孔雀石绿、硝基呋喃类代谢物和部分氟喹诺酮类等等。其中贝类主要的阳性检出项目是氯霉素,鱼类中主要的残留药物是孔雀石绿和氯霉素,氨基脲多存在于甲壳类水产品中。这些残留药物在消费者食用水产品时大部分不会对人体直接产生毒性作用,但当大量食用含有药残的水产品时,将会对人体造成极大的危害。比如摄入过多含有氯霉素的水产品时,可能会引发再生障碍性贫血,从而导致白血病的发生;氟喹诺酮类药物会对人体消化系统和中枢神经系统造成不良反应,甚至涉及到肝肾和软骨的损伤[8-9];孔雀石绿在人体内经过代谢为甲基衍生物,其官能团具有高毒性以及致畸致癌致突变作用,对人体各个组织器官均有影响[10-11]。

水产品基质复杂,干扰物质较多,故需进行一定程度的前处理以保证后续实验的进一步深入。近年来,常见的样品前处理技术已有许多,按照原理主要分为相分离、场辅助和其他方法。其中,相分离主要分为:液-液萃取(liquid-liquid extraction,LLE)、固相(微)萃取(solid-phase microextraction,SPME)、快速固相微萃取(QuEChERS)和超临界流体萃取(supercritical fluid extraction,SFE)等等;场辅助方法有微波辅助萃取(microwave-assisted extraction,MAE)和超声辅助萃取法(ultrasonic-assisted extraction,UAE)。而水产品药物残留检测方面,高效液相色谱-串联质谱法(HPLC-MS)作为国家标准方法一直都在被使用,除此之外,还有不少其他更经济准确的方法投入使用,比如免疫分析法、毛细管电泳法(capillary electrophoresis,CE)等等。本文综述近年来水产品中药物残留前处理技术和检测方法,为后续深入研究奠定了基础。

1 水产品样品前处理方法研究进展

水产品样品基质过于复杂,干扰物质较多,因此样品前处理技术对于药物残留定量和定性分析十分重要。目前,药物残留测定的前处理过程大致分为2步——溶剂提取和净化。溶剂提取一般采用不同浓度的乙腈、甲醇等有机溶剂对样品进行粗提取,该过程可以去除样品中90%的杂质。经实验证明[12]:在测定水产品中喹诺酮类药物多残留时,含有酸的乙腈提取效果远远大于纯乙腈,且以酸化乙腈为提取剂时涡轮振荡的提取方式回收率最高,效果最好。净化是将提取后的样品再次提取,去除剩下10%的杂质,使其能够满足上机检测的要求。以下是几种常见的前处理技术及其优缺点,具体见表1。

1.1 相分离前处理法

1.1.1 液-液萃取法(LLE)

LLE通常用于液态样品或经过加工处理后的液态基质样品的提取,比如工业废水、药酒、酱油等等[13]。通常根据被提取物质的性质,其提取剂也有所不同,它主要分为两类;极性类(乙腈、甲醇、水等)和非极性类(乙酸乙酯、苯等)。在使用LLE时,一般需要较多有机溶剂,且操作时限制较多,因此将其与其他方法结合使用更为常见。周艳华等[14]采用液-液萃取净化法进行前处理,并将其与超高液相色谱串联质谱相结合,以此来分析原料乳中18种喹诺酮类药物的残留量,喹诺酮药物定量限为0.06～1.50 μg/kg,效果较为显著。

而传统的LLE在水产品方面的使用较为受限,因此,针对水体基质方面的药物残留,盐析液液萃取备受关注,不失为一种好的处理方式。它是通过在待测水体或者待测溶液样品中加入一定量的盐溶物,从而使待测化合物能充分地从混合溶液中分离开来。由于其自身的性质,当其与样品溶液共存时,能够将样品中的痕量药残提取出来。尤其是对于渔业水体中喹诺酮类和磺胺类药物[15]时,此法操作简单,快速高效、成本低廉。除此之外,分散液液微萃取在检测水体中药物残留也有较好的应用。

1.1.2 固相萃取法(SPE)

SPE是在液-固萃取技术和色谱分离法相结合的基础上发展起来的,通过利用选择性吸附与选择性洗脱的类似色谱的分离方法对样品组分实现萃取、分离、纯化和富集,多用于水体及土壤中的药物残留测定[16]。这种技术相较于LLE,最大的进步在于摆脱了其复杂的操作流程、高成本的有机溶剂使用及对环境的污染等缺点,但同时它的批次间的重复性不高亦是事实[17]。为了提高SPE的重复性,可对进入萃取柱的样品进行进一步的除杂操作,例如马凯等[18]建立了增强型脂质去除固相萃取结合技术切换色谱技术快速测定水产品中4种硝基呋喃代谢物残留量,此法是以盐酸水解样品和衍生化,再加入乙腈提取盐析,随后利用萃取柱进行净化,结果表明,其残留物的重现性较好。同样的还有邱巧丽等[19]建立了固相萃取结合超高液相色谱-串联质谱法同时测定牛蛙中喹诺酮和磺胺类抗生素。

在固相萃取体系中,萃取剂的选择显得极为关键,它影响着待测样品的提取纯度,对萃取柱的寿命有着较大的影响,进而影响到整个实验的进程。因此,一些新型的材料被用作萃取剂,在国内外均被广泛使用,比如纳米磁性材料和分子印迹材料等等。FENG等[20]以Fe3O4和羟丙基-β-环糊精聚合物磁性纳米材料作为固相萃取剂,建立磁性固相萃取紫外可见光谱法分离分析孔雀石绿的新方法,所得结果令人满意。磁性固相萃取相较于传统SPE具有更多的优点,它可以通过外部磁场被快速分散或收集,以此来简化实际应用中复杂的操作过程。萃取时间较短、有机溶剂用量少、吸附速度快和富集物质种类多等,但不适合基质复杂的水样,且目前这项技术的研究时间较为短暂,还有更大的发展空间。

1.1.3 固相微萃取法(SPME)

SPME最早是在20世纪80年代被提出来的,该方法虽然是基于固相萃取发展起来的,但其萃取原理与SPE有所不同。SPME主要是根据待测物在基体和萃取相之间的非均相平衡为前提,而非将待测物全部萃取出来,从而使目标物吸附在萃取纤维的表面涂层上,待达到吸附平衡后,选择高效液相色谱(HPLC)或气相色谱(GC)进行联用,用于解析分离和测定待测组分,在食品风味差异的研究中有很多应用[21]。相较于SPE,SPME技术特别适合挥发和半挥发待测成分的分析。它的优点主要是方便快捷,对环境友好。

面对多种多样的科研需求,不同分支的SPME技术应运而生,比如活体SPME技术。在涉及到活体检测时,对样品进行的任何处理都要小心细致,而与传统活体致死性方法不同,活体SPME技术能够在不影响生物体指标的情况下对待测物质进行监测,同时能够保证对待测生物的创伤与刺激达到最低,避免造成较大的社会资源的浪费。孟恒立等[22]在一项追踪河鲀体内药物残留活体追踪及代谢过程的研究中,对河鲀样品使用固相微萃取技术,得到了极好的结果,证明在水产养殖中药物代谢过程中的研究,活体SPME技术更具优势。

1.1.4 快速固相分散萃取法(QuEChERS)

QuEChERS法于1989年在美国问世,它可以同时分散和萃取固体,本质上来说就是将固相萃取技术和基质固相分散技术结合在一起并加以完善的一种前处理方法。虽然最初这种方法是针对水果和蔬菜中农药残留提出的,但在水产品药物残留方面也有极好的效果[23],其相比于其他前处理技术的优点主要在于:方便快捷、回收率高、精密度高、分析物范围广和环保安全等。

CHENG[24] 以乙腈(含有1%的乙酸溶液)作为萃取溶液对样品进行初步处理,然后加入氯化钠等盐类促进溶剂与水相的分离,以达到净化的目的,然后结合超高效液相色谱-串联质谱法测定几种水产品中的药物残留量,其中包含孔雀石绿和氟喹诺酮类药物。这种方法测得结果的重现性好,灵敏度高。常波[25]通过优化实验排除甲醇,采用最佳的萃取试剂乙腈,乙腈在规避脂肪干扰的同时又能沉淀蛋白质,在一定程度上提高了氯霉素的提取率。QuEChERS-固相萃取-液质联用法测定水产品中氯霉素的方法经测试具有操作容易、结果准确、重现性好等优点,适用于批量水产品中氯霉素残留量的筛查,这与排除掉乙醛的实验结果相似[26]。

1.1.5 超临界流体萃取法(SFE)

超临界流体萃取技术是一种基于临界温度和压力之上来进行抽提、分离等操作的新型技术,在医药行业、天然香料、石油工业和金属离子方面均具有广泛的应用[27]。除此之外,在食品方面也有不少的应用,比如食品中的农药残留、食品脱色脱臭和萃取动植物油等。常用的超临界萃取剂有很多,比如NH3、C2H6、CO2等,但其中CO2由于其无色无味和惰性较大的物理性质在水产品样品前处理方面具有较好的应用,尤其是对于脂溶性和挥发性成分的提取。在超临界流体萃取技术中,主要分为两大部分:分离和萃取。第一个操作至关重要,它关系到超临界流体的萃取效率,并且受压力、温度和改性剂的影响[28]。董琨等[29]以CO2为萃取剂,向样品中加入含有乙酸的甲醇作为夹带剂,按照一定的萃取条件和色谱条件进行萃取和测定,所得的孔雀石绿的结果线性关系良好,证实其具有快捷、高效、操作方便和安全等优点。但超临界萃取技术缺点是所需设备比较精细,成本较高,此外由于其技术尚未成熟,还有待进一步优化。

1.2 场辅助前处理法

场辅助前处理方法主要分为MAE和UAE,二者都是借助外在的动力对前处理过程进行辅助,以达成更好的提取效果。

MAE是以微波的热量作为热源,对整个需要操作的系统进行加热,在此过程中根据样品成分对微波的选择性而将所需物质从样品中被提取出来的一种方法。不论是食品加工,亦或是活性成分提取中均有良好的应用[30],近来由于能够通过微波能来提取食品、土壤等这类固体样品中的有机物质,开辟了农药残留检测前处理的道路。在这种方法中,微波辅助提取的效率受到多种因素的影响,比如样品预处理的程度、萃取溶剂的选择、微波辐射条件以及温度的选择等。

UAE 在食品行业多用于食品的杀菌、干燥及保存等方面,比如畜禽肉类、水果蔬菜和水产海鲜等,它主要优点在于该种技术对于食品的营养成分影响很小,并且适当的技术联用还可以提高食品的整体质量。而由于其空化效应,也可用作提取目的的前处理过程。超声提取法具有使用有机溶剂较少,设备简单、安全高效等优点,但此技术对不稳定化合物具有破环作用,因此需要对样品处理过程做一些保护措施。陈涛等[31]在测定动物源食品中11种喹诺酮类药物残留的实验中,考虑到均质提取容易造成交叉污染,因而采取超声辅助提取技术,向样品中加入酸化乙腈对样品中的脂肪进行提取,同时为了提高其效率,在前期对提取液进行一次浓缩,最终得到较好的结果。在提高效率的同时,节约了资源,减少了污染。同样的,还有蒋翠红等[32]在GB/T 20361—2006《水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定高效液相色谱荧光检测法》的基础上进行了改进,将样品前处理的匀浆提取改为样品涡动和离心,且经超声波提取,提高了孔雀石绿的溶出效果,减少了匀浆带来的损失,在一定程度上提高了回收率,同时降低了成本,提高了提取的效率。

1.3 其他前处理方法

除了以上较为常见常用的前处理技术,还有一些不常使用的方法,比如凝胶渗透色谱(gel permeation chromatography,GPC)技术和在线净化技术。GPC是一种原理基于体积排除的分离方法,其广泛应用于兽药残留的分析[33]。GPC 可以用来分离和测定小分子的有机物,对性质相同而体积具有差异的高分子同系物也适用,但当它面对化学结构不同但分子质量相同的化合物时便会显得乏力。GPC 技术具有操作简单、省时、对色素和脂肪的净化效果好等一系列特点,但这项技术在水产品药物残留方面的应用却比较少。而且共提取的化合物(包括痕量脂质)可能存在于GPC系统的洗脱液中,对后续分析造成干扰,因此一般需要与其他技术联合使用,比如串联吸附色谱等,其本质与在线净化技术类似,通过将前处理方法与检测技术结合在一起,能够更加方便高效地检测食品中的药物残留。在线净化技术能够同时去除多种杂质,比如脂肪和蛋白,从而简化样品处理步骤,同时能够避免人为操作的误差,使实验更加高效。

2 水产品药物残留检测方法研究进展

2.1 色谱法

色谱法是一种实验室常用的检测方法,主要是液相色谱和气相色谱。两者之间,液相色谱尤其是高效液相色谱(HPLC)更为通用。HPLC由于其具有强大的分离能力和极高的灵敏度,在许多方面都有广泛的应用,比如涉及食品安全的食品添加剂方面、涉及人体安全的药品及化妆品等[34]。除此之外,HPLC法还广泛应用于药物残留检测,目前国家标准多以此法与质谱联合起来作为检测方法,是经典的药物残留检测方法。BERGWERFF等[35]使用Mcllvaine缓冲液-乙腈的混合物从动物组织中提取孔雀石绿的残留物,并在芳香族磺酸固相萃取柱上纯化,然后使用HPLC对其进行检测,在鲶鱼、鳗鱼和虹鳟鱼等多种鱼类中成功测定孔雀石绿以及其代谢物白孔雀石绿,检测限为1 μg/kg。该方法可快速获得结果,适用于常规分析。王丽娟等[36]采用正交试验法考察液相色谱法检测喹诺酮类药物保留时间漂移现象的主要影响因素。最终得出结论:造成分析物色谱峰漂移的主要因素是流动相种类。在流动相中添加缓冲盐和优化前处理方法,可以明显改善目标分析物保留时间的漂移,改进后诺氟沙星、环丙沙星和恩诺沙星漂移率分别降低9.11%、7.74%和7.97%。通过实验获得最佳检测条件,以期为基层检测单位提供可选方法。

而面对一些较为复杂的样品时,仅仅依靠高效液相色谱略显乏力,此时集分离与分析为一体的技术就显得尤为重要,高效液相色谱-串联质谱技术(HPLC-MS)在国内外备受关注,是国内检测水产品中药物残留的标准方法,它常常被用于食品和生活用品的药物残留检测中,比如畜禽类、水产品、化妆品以及水体中[37]。二者的联用中,高效液相色谱的作用主要是分离,质谱注重于分析,因此该技术具有较高的灵敏度,对一些基质复杂以及多残留的样品也有很好的应用。梁晶晶等[38]用高效液相色谱-串联质谱法快速测定水产品中19种喹诺酮类药物残留,对样品的净化、浓缩、液相色谱分离及串联质谱等相关检测参数进行优化,其检出限均为0.5 μg/kg。

但同时该技术所需的仪器设备更加昂贵,一定程度上限制了该技术的广泛使用。将合适的前处理技术与HPLC-MS结合使用,能够降低成本,并具有更高的检测效率。徐媛原等[39]建立QuEChERS-超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)测定水产品中50种兽药残留(包括喹诺酮)的方法,其中50种兽药校准曲线相关系数均大于0.997,检出限为0.032～0.356 mg/kg,平均回收率为60.7%～114.0%,相对标准差为1.06%～14.10%。

2.2 免疫分析法

免疫分析法主要分为两大类:电泳技术和标记技术(酶联免疫技术、化学发光免疫技术和胶体金免疫技术等等)。其在药物分析中的应用十分广泛,不同的分支在不同领域都有很好的应用,比如化学发光法免疫技术在病毒研究中十分常见[40],而酶联免疫技术(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)和胶体金免疫技术(gold Immune chromatographic assay,GICA)更侧重于食品中毒素的检测。

ELISA依赖抗原抗体结合的特异性,在食品毒素方面的研究一直遥遥领先,尤其是畜禽肉制品和粮食作物,比如稻谷和猪肉等。除此之外,在水产品药物残留方面也有诸多应用,抗体的选择是ELISA的核心,王强等[41]通过制备酶标抗体Mab-CIP-HRP建立了水产品中氟喹诺酮药物残留的检测方法,这种直接竞争ELISA法得出较好的结果:氟喹诺酮药物的检测限均不超过0.50 ng/mL,可用于氟喹诺酮类多残留的快速测定。谢焕龙等[42]基于杂交抗体模型开发了用于测定孔雀石绿的间接竞争性ELISA法,同样得出了较好的结果。在ELISA法的基础上,结合使用适当的前处理技术,能够对步骤起到不错的简化效果,同时也能节约时间,降低成本。杨金易等[43]首次建立了QuEChERS前处理技术结合酶联免疫快速检测方法,对水产品中氟喹诺酮药物兽药多残留测定,检出限为0.008 7 μg/kg,这与HPLC得出的结果相关系数R2=0.989 7,符合喹诺酮类药物残留的测定要求。但ELISA的缺点也不容忽视,灵活性差、灵敏度低、耗时长等也都是这项技术的缺陷。

GICA在食品安全领域的应用十分广泛,不论是涉及致病菌还是药物残留的检测,它都有较好的应用[44]。GICA是在20世纪90年代基于现代单克隆抗体技术和新材料技术发展壮大起来一种新型快速检测技术,它相较于常见的实验室检测方法,具有很多优点,比如,操作方便易上手、材料简单易携带和成本较低等等。对于GICA技术的准确性,李倩等[45]对其进行了验证实验:对带鱼进行前处理优化后,将胶体金免疫层析技术与国标检测方法进行对比得出,胶体金免疫层析法可以检出阴性样品,且检测结果与国标法一致。同样的还有宗婧婧等[46],采用胶体金免疫层析法检测水产品中15种喹诺酮药物,得出残留药物的检出限为0.3～5.0 μg/kg,也与国标法的结果相一致。但由于其检测方法较为单一,对于痕量物质的检测有些力不从心,且不能同时进行多残留检测,这也在一定程度上限制了它的使用。

2.3 毛细管电泳法(CE)

毛细管电泳法广泛应用于生物分析、纳米材料毒性研究,同时也是一种常用的用于药物残留检测的方法,它是在1981 年由 LUCKAS和JORGENSON研究建立的,该方法基于电泳技术。联合微型工具毛细管,具有实现分离效率高、分析速度快和样品消耗量少等优点,因此成为分离领域中一种广泛应用的技术。但其进样精度相较于HPLC低,定量分析时以内标法为宜[47]。

陈宗保等[48]建立了一种利用改性纳米金粒子富集与毛细血管电泳-电化学发光法测定水产品中氟喹诺酮类药物残留的分析方法,结果是经改性后的分析物在0.05～10.00 μmol/L的浓度内,线性关系良好,检测限可达0.20 μmol/L。用于鳗鱼分析时,回收率为94.5%～112%。同时,这种方法也用来测定水产品中硝基呋喃类药物的残留量[49]。

2.4 电化学传感器法

电化学传感器一般是通过电化学反应过程的电信号(电位、电流和阻抗等)对待测物进行检测的一种化学分析方法。而因其发展迅速、特异性强、操作方便,并且便于实时检测,在生命科学领域、食品安全检测领域等等都有广泛的应用[50]。在生物传感器的构造中,生物分子识别元件和信号转化元件是2个很重要的部分,根据识别分子元件可将传感器分成不同的种类,而在食品检测中主要分为2种:电化学酶传感器和电化学免疫传感器。

电化学酶传感器是基于酶的选择性催化与识别作用,通过酶与底物特异性催化而发生各种类型的反应,最终引起化学物质浓度变化,通过信号转换元件变为可测的电流或电位。尚晶晶[51]通过选择性制备酶传感器,优化其检测条件,建立了一种纳米电化学酶传感器法快速测定水产品中孔雀石绿的含量,得到的结果较好,提供了一种新的思路。电化学免疫传感器的原理是抗原抗体的特异性结合,在此方面也有很多学者利用二者结合高效地检测水产品中的药物残留,尽管这种方法简单且成本低,但其缺点也很明显,制备的固体吸附材料多为一次性耗材,难以保证实验的重现性,而且检测过程受外部环境的影响较大等等。

2.5 光谱法

表面增强拉曼光谱法(surface-enhanced Raman spectroscopy,SERS)是一种常见的快速检测技术,因其操作方便快捷、结果准确迅速,在食品安全和医学检验领域都有极广泛的应用[52],该技术是在20世纪70年代由国外学者FLEISHMANN等提出的,其原理是用通常的拉曼光谱法测定吸附在胶质金属颗粒如银、金或铜表面的样品,或吸附在这些金属片的粗糙表面上的样品。李晨等[53]建立了水产品孔雀石绿和结晶紫残留物的快速表面增强拉曼光谱法。通过预处理后测定胶体金、浸出物和混凝剂的用量,确定孔雀石绿和结晶紫在虾蟹中的检出限为1.00 mg/kg,鱼贝类中检测限为0.50 mg/kg,满足快速检测的定性要求。增强因子是表征SERS性能好坏的重要指数,张苑怡[54]将SERS与虚拟分子印迹技术结合筛选出合适的纳米基底,以此来检测鱼肉中的孔雀石绿,这种方法不仅保留了拉曼光谱的特性,而且能够排除非目标物质的干扰。

3 总结与展望

随着人们生活水平的提高以及水产品需求量的不断增长,国内水产养殖规模也越来越大,为了产量而使用过量的抗菌类药物以及违法添加鱼类禁用药物的现象屡见不鲜。而这些添加的药物在经过代谢后会以不同的渠道被人类摄入,最终在人体内富集,对人体造成极大的危害。因此需要定期对养殖场的各种水产品进行药残的测定,但由于水产品样品基质效应复杂,所以对样品进行前处理也是一个极其繁琐的过程。虽然现在已有许多富集浓缩分离的技术在样品前处理过程中被使用,但依旧存在瓶颈,如液相萃取方法的成本高,对环境不友好。固相萃取方法较为受限,萃取剂制备难度高,通常需要与其他辅助萃取方法结合使用。因此,探索更加环保、简便快捷、经济高效的样品前处理技术,开发新型材料用于样品前处理过程也将成为研究热点。实验室检测方法耗时长,仪器昂贵,成本高,快速检测条件限制多,灵敏度不高,这些劣势也将检测技术推向更加经济高效的方向。因此,开发一种成本低廉、环保高效、快速便捷的前处理技术是水产品药物残留检测的重要前提,同时研发一种更为准确快速、方便实用的检测技术也是未来的发展趋势。

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