豆干是我国传统食品,发展历史悠久,其营养丰富、均衡且容易被人体消化吸收,素有“植物肉”的美誉[1-2]。休闲豆干(leisure dried tofu,LD-tofu)则是将豆干经过卤制、调味、杀菌等工艺加工而成的小包装即食食品[3]。豆干通过卤制、调味后风味更独特,再经过真空包装和高温灭菌工序延长了货架期(达到45～90 d),使其更零食化、休闲化、方便化和市场化[3-4]。近年来,休闲豆干因具有独特的风味和丰富的营养物质而颇受消费者喜爱,已成为我国传统卤制品的典型代表,并随着大众消费者健康理念的提升以及消费习惯的改变,使得休闲豆干市场逐渐扩大[5-6]。但是,湖湘地区常采用富含多不饱和脂肪酸的菜籽油熬制卤汁[7-8],进而导致卤汁极易因温度、氧气、光照等条件诱导发生油脂氧化产生大量自由基和过氧化物[9],致使卤制品氧化酸败并引起食品安全风险。
有研究人员已证实,在25 ℃及贮藏环境下脂肪酸易发生氧化反应[10-11],氧化初级产物氢过氧化物会氧化蛋白质中的敏感氨基酸残基,从而破坏蛋白质空间结构,使蛋白质分子内空隙中的结合水转变为容易被微生物、酶、化学反应利用的自由水,进而影响休闲豆制品的风味、口感和营养价值[12-13]。近年来,如何对休闲豆干的品质进行有效控制,降低食品安全风险,使其能够在贮藏、运输、销售等流通领域中保持良好的质构特性、丰富的营养物质和独特的风味,是休闲豆干工业化生产需要解决的难点问题。基于以上研究现状,课题组前期研究了不同氧化引发剂(叶绿素、偶氮二异庚腈)诱导下卤汁和卤豆干营养成分的变化规律,发现叶绿素协同偶氮二异庚腈作用下卤豆干营养成分变化更显著[14]。但是,如何有效控制光酶引发剂诱导卤汁氧化引起休闲豆干品质变化的研究未见报道,成为该领域亟待解决的关键技术问题。
目前,抑制油脂氧化主要包括低温贮藏、气调保鲜、添加抗氧化剂等措施[15],其中茶多酚作为具有强抗氧化作用的天然抗氧化剂,在食品贮运、保鲜中广泛应用[16]。大量研究表明,茶多酚能够降低食品贮藏过程中硫代巴比妥酸反应物和亚硝酸含量,有效清除羟自由基(·OH)和DPPH自由基,抑制肉制品中挥发性物质形成和脂质过氧化[17-18]。然而,现有研究多集中于单一抗氧化剂或贮藏条件的影响,对光酶协同引发剂诱导的氧化机制及其针对性保护措施的研究仍存在空白。
因此,本研究采用茶多酚和光酶氧化引发剂(叶绿素和偶氮二异庚腈)同步处理卤汁,并采用不同试验组卤汁卤制豆干,分析不同试验组休闲豆干在90 d贮藏期内营养成分含量、特征氧化指标、质构特性、色差、分子间作用力和微观结构变化规律,揭示茶多酚对氧化引发剂诱导休闲豆干品质变化的保护作用。本研究首次将茶多酚与光酶引发剂联合应用于卤汁体系,系统探究茶多酚对氧化引发剂诱导作用下豆干长周期贮藏中多维度品质指标的保护效应,旨在突破传统抗氧化剂研究的短周期局限性,为复杂氧化场景下的豆干品质控制提供新策略。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
大豆、卤料、菜籽油等原料,邵阳市双清区志成商行;油溶性叶绿素、偶氮二异庚腈,天津市科密欧化学试剂有限公司;茶多酚标准品、1-丁醇、2-硫代巴比妥酸,上海源叶生物科技有限公司;无水硫酸钠、异辛烷、p-茴香胺,广东光华科技有限公司;冰乙酸、三氯甲烷、碘化钾、硫代硫酸钠、无水硫酸钠,迈森生物科技有限公司;其他化学试剂,国药集团化学试剂有限公司。
1.2 仪器与设备
ZJJC-100-RC-001智能集成制浆设备、FYLZ-1真空脉冲卤制设备,北京康得利智能科技有限公司;UDK139自动凯氏定氮仪,北京盈盛恒泰科技有限责任公司;LS-5质构仪,美国阿美特克有限公司;CR-400色差仪,日本柯尼卡美能达公司;T-8紫外可见分光光度计,南京菲勒仪器有限公司;MC1000扫描电子显微镜,日本HITACHI有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 卤汁与休闲豆干的制备
参考伍涛等[5]方法熬制和配制卤汁,根据前期实验设置引发剂(叶绿素和偶氮二异庚腈)浓度[14],并将卤汁与引发剂混合。卤汁设3个处理组,包括空白组、引发剂组和引发剂+茶多酚组,具体处理如下:
空白对照组:卤汁中不添加任何引发剂或茶多酚,避光贮藏;
引发剂组:卤汁中添加30 mg/kg叶绿素(光敏剂)与0.2 mmol偶氮二异庚腈(自由基引发剂);
引发剂+茶多酚组:在引发剂组基础上额外添加0.2%(质量分数)茶多酚。
所有组别卤汁均经均质处理后用于卤制豆干,确保处理条件一致性。按照HUANG等[2]方法制备豆干,将制作完成的豆腐白胚切块,置于85 ℃带式机烘干3 h,冷却后即得金黄色豆干。选取贮藏28 d各试验组卤汁,按照HUANG等[2]方法将豆干置于真空脉冲卤制设备中卤制80 min(0.03 MPa,80 ℃),真空包装后置于反式灭菌锅121 ℃杀菌15 min后得到休闲豆干。分别将各试验组休闲豆干置于25 ℃环境下贮藏90 d,在15、30、45、60、75、90 d贮藏时间节点每组随机选择豆干样品,进行营养成分含量、特征氧化指标、质构特性、色差、分子间作用力和微观结构检测。
1.3.2 休闲豆干营养成分测定
豆干样品蛋白质含量、脂肪含量、水分含量和碳水化合物含量参照HUANG等[2]方法进行测定。
1.3.3 休闲豆干质构特性测定
豆干样品质构特性(硬度、咀嚼度、内聚性、弹性)参照伍涛等[5]方法进行测定。
1.3.4 休闲豆干特征氧化指标测定
豆干样品过氧化值(peroxide value,POV)和硫代巴比妥酸反应物(thiobarbituric acid reactive substances,TBARS)值参照HUANG等[2]方法进行测定。
豆干样品茴香胺值和酸价参照侯天宇等[19]方法进行测定。
1.3.5 休闲豆干色差测定
采用CR-400型色差仪测定豆干样品的亮度(L*)、红度(a*)和黄度(b*)。
1.3.6 休闲豆干分子间作用力测定
参照毛佳怡[20]方法测定豆干样品分子间作用力(氢键作用力、二硫键作用力、疏水相互作用)。
1.3.7 休闲豆干微观结构测定
参照毛佳怡[20]方法采用扫描电子显微镜观察豆干样品微观结构。
1.4 数据处理及分析
每个样品均重复进行3次,实验数据均以“平均值±标准差”表示,使用SPSS 22.0和Origin 9.1进行统计分析和方差分析,显著性差异水平设置为P<0.05。
2 结果与分析
2.1 茶多酚和引发剂对休闲豆干营养成分的影响
不同贮藏时间下各试验组休闲豆干蛋白质、脂肪、水分和碳水化合物含量变化如图1所示。与空白对照组相比,引发剂组豆干蛋白质、脂肪和碳水化合物含量随贮藏时间延长而显著降低(P<0.05),贮藏90 d时分别为15.05 g/100 g、11.06 g/100 g、7.09 g/100 g;水分含量随贮藏时间延长而逐渐增高,从48.55 g/100 g显著增高至56.23 g/100 g(P<0.05)。这些结果与HUANG等[2]的研究结果一致且相互论证,推测是光酶引发剂诱导了卤汁中油脂氧化,进而引起豆干蛋白质和脂肪氧化,致使豆干蛋白质凝胶结构发生改变及束缚力减弱,最终导致豆干中碳水化合物流出和结合水转变为自由水。
A-蛋白质含量;B-脂肪含量;C-水分含量;D-碳水化合物含量
图1 茶多酚和引发剂作用下休闲豆干营养成分含量变化
Fig.1 Changes in nutritional components of LD-tofu treated with tea polyphenols and oxidation initiators
注:*表示引发剂+茶多酚组与引发剂组存在显著性差异(P<0.05)(下同)。
与引发剂组相比,引发剂+茶多酚组豆干蛋白质、脂肪和碳水化合物含量在15～60 d时均有较大幅度的增高,但在75～90 d无明显差异。其中,蛋白质和脂肪含量在引发剂+茶多酚组中上升幅度较大,在60 d时引发剂组豆干蛋白质和脂肪含量分别降低至16.42 g/100 g、11.73 g/100 g,而引发剂+茶多酚组豆干蛋白质和脂肪含量分别为18.39 g/100 g、12.76 g/100 g(均接近空白对照组)。在15～60 d时,引发剂+茶多酚组豆干水分含量有小幅上升变化趋势,而在75～90 d时逐渐上升,但上升幅度明显小于引发剂组。以上结果表明茶多酚能有效抑制豆干营养成分变化,其原因可能是茶多酚具有强抗氧化特性[21],与引发剂同步添加到卤汁中,能有效抑制卤汁中油脂氧化,进而能有效保护贮藏期豆干中营养成分变化。
2.2 茶多酚和引发剂对休闲豆干特征氧化指标的影响
引发剂组豆干POV、酸价、TBARS值和茴香胺值均随贮藏时间延长而显著增高(P<0.05),贮藏90 d时分别为0.42 g/100 g、1.88 mg/g、3.38 mg/kg、93.17,与空白对照相比分别增高了0.33 g/100 g、1.20 mg/g、2.21 mg/kg、79.93(图2)。POV、酸价、TBARS值和茴香胺值均是评价脂肪氧化酸败程度的参考指标,是评价食品贮藏期间质量好坏的重要指标之一[2,9]。研究表明,当POV大于0.2 g/100 g、或酸价大于1.0 mg/g、或TBARS值大于2.0 mg/kg时,脂质会氧化产生难闻的气味[2,22]。在本研究中引发剂组豆干POV在15 d时超过了限值要求,酸价和TBARS值在30 d超过了限值要求,表明叶绿素、偶氮二异庚腈诱导作用下豆干在贮藏期极易发生氧化现象。
A-POV;B-酸价;C-TBARS值;D-茴香胺值
图2 茶多酚和引发剂作用下休闲豆干特征氧化指标变化
Fig.2 Changes in characteristic oxidation indexes of LD-tofu treated with tea polyphenols and oxidation initiators
引发剂+茶多酚组豆干POV、酸价、TBARS值和茴香胺值随贮藏时间延长而逐渐增高,但始终低于引发剂组。在贮藏60 d时,引发剂+茶多酚组豆干POV、酸价和TBARS值分别为0.13 g/100 g、0.98 mg/g、2.14 mg/kg,均在油脂氧化酸败限值以内,表明茶多酚在60 d内对光酶引发剂诱导油脂氧化具有较强的抑制作用。这种效应可归因于茶多酚能有效清除自由基和抑制氧合酶活性[23],可抑制过氧化物和丙二醛(饱和脂肪酸氧化和降解的衍生物)的生成。另外,研究人员发现茶多酚可通过抑制脂质自由基链式反应(如阻断赖氨酸氧化酶活性)及与血红素铁结合(降低促氧化活性),显著延缓肉制品的氧化劣变[24],这可能是因为豆制品和肉制品基质成分不同造成的抗氧化效果差异。
2.3 茶多酚和引发剂对休闲豆干质构特性的影响
豆干是由蛋白-蛋白、蛋白-水通过分子间相互作用力维系的凝胶结构,易受到温度、离子强度、pH等因素影响[2,8]。硬度是指使食品达到一定变形所需要的力,咀嚼性综合反映了样品对咀嚼的持续抵抗性[25]。本研究中,引发剂组豆干硬度和咀嚼度显著低于空白对照组和引发剂+茶多酚组(P<0.05),且随贮藏时间延长逐渐下降(图3)。经过90 d贮藏,引发剂组豆干硬度和咀嚼度分别从11.25 N、8.96 N下降至8.08 N、6.46 N,其原因可能是豆干为高蛋白质凝胶食品,当水分含量上升、蛋白质含量下降,豆干分子间凝胶强度减小而导致豆干硬度和咀嚼性降低。
A-硬度;B-咀嚼度;C-内聚性;D-弹性
图3 茶多酚和引发剂作用下休闲豆干质构特性变化
Fig.3 Changes in texture characteristics of LD-tofu treated with tea polyphenols and oxidation initiators
内聚性是指食品形成凝聚态的能力,弹性则反映了食物受力按压后能迅速恢复到原有形状的能力[25]。品质优良的豆干具有较好的内聚性和弹性,质地柔软,食用口感好[6]。本研究中,空白对照组豆干内聚性和弹性降低幅度较小。在贮藏60 d时,引发剂组豆干内聚性和弹性分别降低至0.98、0.85,而引发剂+茶多酚组豆干内聚性和弹性分别为1.23、0.88,接近于空白对照组(1.32、0.89)。许多研究表明,豆制品质量品质与其内聚性和弹性密切相关[2,25],这不仅表明茶多酚能在60 d内对光酶诱导油脂氧化引起豆干质构变化起到抑制作用,而且进一步证实了豆干品质劣变与其凝胶结构发生改变密切相关。
2.4 茶多酚和引发剂对休闲豆干色差的影响
不同贮藏时间下各试验组休闲豆干色差变化如图4所示。各试验组豆干a*值均随贮藏时间延长出现小幅增高趋势,这与课题组前期研究发现豆干在贮藏期内红度会逐渐加深的结果一致[13]。与空白对照组相比,引发剂组豆干L*值随贮藏时间延长呈先小幅增高后显著降低趋势(P<0.05),而引发剂+茶多酚组豆干L*值在15～60 d无显著变化(P>0.05),但在75～90 d显著降低(P<0.05)。此外,引发剂组和引发剂+茶多酚组豆干b*值随贮藏时间延长逐渐增高,但引发剂+茶多酚组豆干b*值始终低于引发剂组,贮藏90 d时b*值分别为43.21、40.19。
A-L*值;B-a*值;C-b*值
图4 茶多酚和引发剂作用下休闲豆干色差变化
Fig.4 Changes in color difference of LD-tofu treated with tea polyphenols and oxidation initiators
研究表明,L*值大小代表产品亮暗程度,而b*值大小则代表产品黄蓝程度[13]。本研究中,引发剂组豆干在贮藏过程中逐渐变暗、变黄,推测其原因可能是:(1)氧化产生的醛类物质(如己醛、壬醛),在高温或长期贮存中发生缩合或聚合反应,生成黄褐色聚合物(如醛醇缩合物),导致豆干色泽由浅变深[9];(2)氧化终产物(如丙二醛)与蛋白质、氨基酸中的氨基发生美拉德反应,导致颜色变暗[5];(3)豆干表层油脂色素被自由基破坏,导致豆干表面淡黄色逐渐变暗、变黄。特别的是,在15～60 d时引发剂+茶多酚组豆干色差值接近于空白对照组,表明茶多酚对光酶诱导油脂氧化引起豆干颜色变化的现象具有明显的抑制作用,但豆干卤制和贮藏过程中特定氧化产物(如醛类物质、丙二醛)含量变化规律及其与色差的关联性还需进一步探究。
2.5 茶多酚和引发剂对休闲豆干蛋白质分子间作用力的影响
不同贮藏时间下各试验组休闲豆干蛋白质分子间作用力变化如表1所示。空白组豆干氢键作用力和疏水相互作用随贮藏时间延长出现小幅度增强的变化趋势,贮藏90 d后分别从初始值0.15、0.22上升至0.21、0.29。引发剂组豆干氢键作用力和疏水相互作用显著高于空白对照组和引发剂+茶多酚组(P<0.05),经过90 d贮藏分别增高了0.21、0.25。引发剂组豆干蛋白质分子间氢键作用力显著升高,其原因可能是在引发剂诱导油脂氧化会产生大量的自由基和极性分子,而这些极性分子能够增强蛋白质分子之间的氢键形成及其稳定性[14,26]。而引发剂组豆干蛋白质分子间疏水相互作用增强,一方面可能是蛋白质氧化过程中表面的氨基酸发生氧化使疏水性基团逐渐转变为亲水基团[27];另一方面则可能是因为油脂氧化产生的自由基氧化蛋白质内部的氨基酸残基,致使蛋白质去折叠而使其疏水基团暴露出来,最终导致蛋白质分子间疏水相互作用明显增强[28]。
表1 茶多酚和引发剂作用下休闲豆干蛋白质分子间作用力变化
Table 1 Changes in intermolecular forces of LD-tofu treated with tea polyphenols and oxidation initiators
作用力组别0 d15 d30 d45 d60 d75 d90 d氢键作用力 空白组0.16±0.03a0.14±0.03a0.15±0.01a0.17±0.05ab0.18±0.04b0.21±0.04c引发剂组0.15±0.01a0.18±0.03b0.20±0.02b0.26±0.05c0.31±0.02d0.35±0.03e0.36±0.02e引发剂+茶多酚组0.16±0.02a0.17±0.02a0.19±0.02b0.18±0.03b0.21±0.06b0.28±0.03c二硫键作用力空白组2.49±0.01a2.45±0.01a2.37±0.06b2.35±0.01b2.28±0.05c2.21±0.03d引发剂组2.46±0.02a2.16±0.08b2.10±0.05b1.75±0.02c1.60±0.02d1.48±0.03e1.33±0.03f引发剂+茶多酚组2.51±0.02a2.49±0.03a2.44±0.05b2.29±0.03c2.19±0.02d1.94±0.02e疏水相互作用空白组0.21±0.04a0.19±0.03a0.20±0.04a0.23±0.03a0.28±0.03b0.29±0.03b引发剂组0.22±0.01a0.24±0.02a0.27±0.01b0.29±0.04b0.37±0.03c0.45±0.01d0.47±0.03d引发剂+茶多酚组0.20±0.03a0.21±0.02a0.22±0.05a0.26±0.04b0.25±0.04b0.32±0.04c
注:不同小写字母表示不同贮藏时间组之间存在显著性差异(P<0.05)。
本研究中,空白组豆干蛋白质分子间二硫键作用力随贮藏时间延长呈小幅降低的变化趋势。与空白组相比,引发剂组豆干蛋白质分子间二硫键作用力随贮藏时间延长而显著降低(P<0.05),贮藏90 d时为1.33,降幅达45.93%。许多研究表明,二硫键是豆干蛋白质分子间主要的作用力,但容易在高温长时间贮藏过程中发生氧化减弱的现象,而当二硫键出现不可逆断裂时,易促使蛋白质分子从有序构象转变为无序状态,降低豆干的持水性和弹性[2,29]。此外,大豆蛋白(如β-伴大豆球蛋白)的三级结构和四级结构稳定性依赖于分子内/间二硫键的分布,二硫键断裂或二硫键作用力减弱会导致蛋白质展开和疏水基团暴露,进而影响蛋白凝胶网络的形成[30]。另有研究表明,氧化诱导的酪氨酸交联或二硫键异构化可能形成非共价聚集物[31],改变豆干凝胶的微观结构,这与本研究结果一致而且相互验证。
与引发剂组相比,引发剂+茶多酚组豆干蛋白质分子间作用力在15～60 d时接近于空白对照组,表明茶多酚对光酶引发剂诱导油脂氧化引起豆干蛋白质分子间作用力变化的现象具有明显的保护作用,其原因在于豆干蛋白质分子间作用力变化与自由基和极性基团含量密切相关,茶多酚能有效清除自由基并抑制极性基团的形成[21],进而能有效抑制蛋白质分子间作用力发生改变。
2.6 茶多酚和引发剂对休闲豆干微观结构的影响
不同贮藏时间下各试验组休闲豆干微观结构变化如图5所示。空白对照组豆干蛋白凝胶结构较致密、紧凑,孔隙小且数量较少,随贮藏时间延长网络空隙略有变大和增多的变化趋势。引发剂组豆干微观结构在贮藏30 d时出现明显的孔隙增大、凹凸不平的现象,贮藏60 d时孔径持续变大、凝胶结构出现断裂现象,贮藏90 d时蛋白质断裂面增多、出现大量絮状网格。与引发剂组相比,引发剂+茶多酚组豆干微观结构孔隙增大现象得到明显改善,无较明显断裂现象出现。
图5 茶多酚和引发剂作用下休闲豆干微观结构变化
Fig.5 Changes in microstructure of LD-tofu treated with tea polyphenols and oxidation initiators
各试验组豆干微观结构变化与其质构特性变化相关联,一方面揭示了引发剂诱导油脂氧化易引起蛋白质氧化及其凝胶结构崩塌,进而导致营养成分和质构特性变化的假说;另一方面也阐明了茶多酚能有效保护引发剂诱导豆干品质特性变化,基于茶多酚强抗氧化作用能有效维持蛋白质凝胶结构和持水性,进而保护豆干营养成分和质构特性变化。此外,茶多酚的保护作用在75～90 d减弱,可能与以下因素相关:(1)茶多酚自身氧化消耗导致自由基清除能力下降;(2)长期贮藏中氧化产物(如丙二醛)的积累引发次级氧化反应,抵消茶多酚的抑制效果;(3)蛋白质凝胶网络的渐进性损伤超出茶多酚的修复阈值。后续研究可结合液相色谱-质谱联用技术分析茶多酚降解动力学及氧化产物互作机制,以进一步阐明时间依赖性效应。
结合休闲豆干分子间作用力与微观结构分析可知,茶多酚可通过清除自由基(如·OH),抑制蛋白质侧链氨基酸(如半胱氨酸)的氧化,从而减少二硫键的不可逆断裂[23,28]。此外,茶多酚的疏水基团可与暴露的蛋白质疏水区域结合,阻碍其进一步聚集[23],维持凝胶网络的致密性(图5)。这一机制与HOFFMANN等[30]提出的β-伴大豆球蛋白稳定性理论一致,即二硫键与疏水相互作用的协同效应对凝胶结构至关重要。
3 结论
本研究从营养成分、特征氧化指标、质构特性和微观结构等角度分析氧化引发剂对休闲豆干品质特性的影响及茶多酚的保护作用。结果表明,引发剂能诱导豆干特征氧化指标和b*值显著增高,营养成分、质构特性、L*值和二硫键作用力逐渐降低,蛋白质凝胶结构出现孔隙增大、结构断裂现象。0.2%茶多酚可在15～60 d通过抑制蛋白质氧化、二硫键断裂、疏水基团暴露和凝胶网络结构破坏,对氧化引发剂诱导的豆干品质特性变化具有显著保护作用。该研究结果可为拓宽茶多酚应用和休闲豆干质量安全控制提供理论依据,后续将进一步探究茶多酚与氧化产物相互作用、特定氧化产物含量与色差关联性。
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