兰州百合属于百合科植物,是一种多年生草本植物,是川百合的一个变种。兰州百合种植历史悠久,距今已有400多年[1]。当地特定的地理位置和高寒阴湿的气候条件,造就了兰州百合肉质肥厚、味道香甜、纤维稀少、外观洁白如玉的优质特征,是我国独特且重要的一种可食用百合[2]。百合主要含淀粉、蛋白质、氨基酸以及大量的钙、磷、铁等矿物质,同时含有生物素、秋水碱等多种生物碱。在中医药学中,百合被广泛用作药材,甚至有“百合为之无挂碍,九天神女生姿彩”的美誉,常以鳞茎和珠芽作为药、食两用部位,始载于汉朝《神农本草经》,具有清肺化痰、滋润肺部[3]、润肤养颜的作用[4-6]。此外,百合还具备其他食材无法媲美的独特清香气味[7]。
百合是兰州重要的农业特色产业。目前,兰州百合仍以鲜销菜用为主,其加工技术相对传统,创新力度不够,兰州百合的加工产品仅为真空包装鲜百合、百合干等为数不多的几种初加工产品,精深加工产品匮乏[8]。这导致百合产品的种类和附加值有限,难以满足市场上日益多样化的需求。为了提升百合产品的竞争力,需要加强加工技术的研发和创新,引入现代化、智能化的加工设备和技术。以传统果酒酿造技术为基础,通过对配方和工艺的调整,以期酿造出各种不同口味和风格的特色酒,开发多样化、风格和口感等个性突出的产品,以迎合现代消费者个性化和多元化需求[9-10]。
兰州百合淀粉含量较高的特性,决定了其适合作为酿酒原料[11],其淀粉含量在1.43%～15.97%,多糖含量在8.72%～19.42%,总黄酮含量在0.08%～0.82%[12],其独特清香气味物质有桉树脑、(E)-β-罗勒烯、芳樟醇和苯甲酸甲酯[13]。并且开发以百合为原料的百合酿制酒还能够有效留存百合中的营养成分和清香风味,开发价值很大。但目前,由于成熟的商业酿酒酵母发酵剂的研发多以酿造葡萄酒等水果酒或以谷物、薯类等原料酿造白酒为目标,因而现有不同类型的酵母发酵剂原料适应的差异性较大,且风味代谢物质呈现多元化现象。DACHERY等[14]在葡萄酒中的研究发现酵母F15发酵所酿酒更显果香、醇厚,可以有效降低葡萄酒中生物胺的含量,提升酒的安全性。MEDINA等[15]在霞多丽葡萄酒中的研究表明酵母F15所酿酒体丰满和谐、圆润醇厚、品种典型性强,能增强葡萄酒的结构感。F15与非酿酒酵母混合发酵能增加葡萄酒中的香气物质,提升葡萄酒的品质[16]。PELTON[17]在葡萄酒中研究得出LAFFORT酵母CX9其发酵性能稳定,有独特的风味特征,对多种葡萄酒品种和酿造条件都具有较强的适应性,能在不同的环境条件下保持良好的发酵效率,确保酿酒过程的顺利进行。黄杰等[18]等在桑葚酒研究中得出安琪酵母能在酸性环境中稳定发酵,有利于酒的酿造。安琪酵母还能够降酸提酯、显著改善酒的口感和风味、使酒体更加醇厚、香气浓郁[19]。对于开发百合酿造酒而言,选育新的酵母菌株或筛选适合百合的酿酒发酵剂极为迫切。
为此,本研究拟以“兰州百合”为原料,筛选适宜的发酵剂并应用生物发酵技术手段研制百合发酵果酒产品,为兰州百合产业升级提供科技支撑,并以此增加百合的附加值,进一步提高兰州百合的知名度,提高农产品竞争力,以期为发展本地区的特色农业产业、增加农民收入以及带动乡村振兴贡献力量。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 材料
新鲜百合,新鲜无机械损伤、无异味,由兰州市七里河区西果园镇牟家坪村种植农场提供,为同一块地的秋季采摘百合。采摘后低温(4 ℃)运输至实验室冷藏备用。
1.1.2 发酵剂类型
根据耐酸性、降糖速度、产酒精能力以及产香能力,选用3种不同性能的商业酵母发酵剂,分别为法国LAFFORT酵母F15、法国LAFFORT酵母CX9以及安琪酵母(表1)。
表1 发酵剂类型
Table 1 Types of fermentation starters
发酵剂发酵性能生产商家法国LAFFORT酵母F15耐高酒精度(16%vol);发酵所需的温度范围:20^32 ℃;发酵过程中所需的氮含量适中;产生的挥发性酸和H2S含量低;产生大量的甘油丙三醇,提升酒的甜感;唤醒葡萄品种芳香的能力强大;具有增强提取葡萄中的多酚类物质的潜力法国LAF-FORT公司法国LAFFORT酵母CX9酒精耐受性最高达16%vol;发酵温度(最适温度):14^22 ℃;发酵过程中所需的氮含量适中;具有较高的发酵活性和较短的滞后期法国LAF-FORT公司安琪酵母耐酸、耐浓乙醇、耐高糖环境的特点。酵母是单体菌种,主要是酒化功能安琪酵母股份有限公司
1.1.3 主要试剂
α-淀粉酶,上海源叶生物科技有限公司;抗坏血酸,褚诚华源生物科技有限公司;柠檬酸,天津市光复科技发展有限公司;果胶酶,山东隆科特酶制剂有限公司;糖化酶50 000活力,江苏博立生物制品有限公司;乳酸,河南金丹乳酸科技股份有限公司;CaCl2,焦作市冠通化工有限公司制造;无水葡萄糖,西王药业有限公司;小苏打,天津渤化永利化工股份有限公司,以上试剂均为食品级。
1.2 仪器与设备
5 L玻璃发酵罐,上海百仑生物科技有限公司;PHS-3C酸度计,上海仪电科学仪器股份有限公司;RAL-1手持糖度计,日本爱拓科技有限公司;GT10-1高速台式离心机,北京时代北利离心机有限公司;SPX-150-Ⅱ生化培养箱,上海跃进医疗器械有限公司;RE-6000A旋转蒸发器,上海亚荣生化仪器厂;TU-1810PC紫外可见分光光度计,北京普析通用仪器有限责任公司;HZQ-X100恒温振荡培养箱,太仓市豪诚实验仪器制造。
1.3 实验方法
1.3.1 百合酒的工艺流程[7]
兰州百合→清洗、剥瓣→护色、灭菌→漂洗→破碎打浆→酶解→糊化→糖化→百合浊汁→接种发酵→发酵工艺→调配→过滤→澄清→灭菌灌装→感官评价。
1.3.2 发酵实验
按上述流程制备的百合浊汁,用食用白砂糖调节糖度至22 °Brix,分别装入3只2.5 L的玻璃瓶内(充料系数75%)。将活化好的3种商业酵母发酵剂,按照0.025%的接种量分别接入装有1.8 L百合浊汁的玻璃瓶内,置于28 ℃的恒温培养箱中发酵8 d,定期测定发酵液的酒精度、糖度等基本理化指标,测定处理重复3次。最后对发酵样品进行感官评定,测定酒中挥发性风味物质。
1.3.3 菌种筛选的依据
以降糖速度和产酒精能力为依据,首先考察3种商业酵母对百合原料的适应性。结合GC-MS技术测定挥发性风味物质,评价其产香能力,筛选适宜百合酒生产的最佳发酵剂。
1.3.4 理化指标的测定
1)酒精度测定:参照GB 5009.225—2023的《食品安全国家标准 酒和食用酒精中乙醇浓度的测定》。
2)还原糖含量测定:采用GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》中规定的斐林试剂法。
3)挥发性风味物质测定:参考鲁榕榕等[20]的方法,略做修改。
GC-MS条件:色谱柱(30 m×250 μm×0.25 μm);进样口温度250 ℃;柱温起始温度45 ℃,以3.5 ℃/min升至220 ℃,保持2 min;载气:高纯氦气(99.999%);载体流速1.03 mL/min;MS四极杆温度150 ℃;离子源温度230 ℃;扫描范围:35～550 m/z;电子能量:70 eV。
4)百合风味物质的提取:参考刘琳等[21]的方法略做修改,采用固相微萃取(solid-phase microextraction,SPME)法提取百合酒中的风味物质:取5 mL百合酒样品于香味瓶中加入10 μL的2-辛醇相微萃取头放入小瓶中,在距液体表面约1 cm处吸附30 min后,将微萃取头快速插入气相色谱仪的进气口,在250 ℃下解吸10 min。吸附后,将吸附头快速插入气相色谱仪的进气口,然后在250 ℃下拉出10 min。
5)定性和定量分析:采用内标法定量。取正构烷烃(C7～C22)的混标进行GC-MS分析,参考相关文献[22]进行定性分析。
6)相对气味活度值(relative odor activity value,ROAV)的测定:参考刘登勇等[23]的方法并稍作修改,百合酒中关键挥发性物质采用相对气味活性值(odor activity value,OAV)分析法先确定对百合酒贡献最大的组分,OAV计算如公式(1)所示:
(1)
式中:C,绝对浓度,μg/g;I,感觉阈值,μg/g。
规定对样品风味贡献最大的挥发性组分ROAV,其计算如公式(2)所示:
(2)
式中:Ci,不同挥发性组分的相对含量;Cmax,对样品总体风味贡献最大挥发性组分的相对含量;Ti,各挥发组分的感觉阈值,μg/g;Tmax,对样品总体风味贡献最大组分的挥发性组分的感觉阈值,μg/g。
1.3.5 感官评价
根据GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》的要求,邀请了6位感官评价经验丰富的同学从百合酒的外观、香味、滋味、澄清度和典型性5个方面进行感官评价,感官评价标准如表2所示,最终评分以这6位同学的平均得分为准,满分为100分。参考相关文献[7]并略做修改,评价结果用雷达图表示。
表2 感官评价标准
Table 2 Sensory evaluation standards
项目优质特点品质较差外观(5分)呈淡黄色、悦目协调、澄清透明、有光泽色泽不均匀或褐变严重、浑浊、有悬浮物、光泽度差香味(30分)具有协调愉悦的百合香和酒香、无异香香气不足、不协调、不悦人、有异香滋味(40分)酒体丰满、醇厚柔和、酸甜适当、有典型的百合味酒体寡淡、不协调、酸甜不适口、苦、平淡、有异味典型性(20分)具有百合风味、具有典型性无百合风味、缺乏典型性澄清度(5分)透亮没有明显悬浮物浑浊有明显悬浮物
1.4 处理数据
采用SPSS Statistics 24.0软件进行显著性差异和主成分分析,使用Excel 2016进行数据整理,采用Origin 2022软件对数据处理结果进行绘图,用Heatmap软件进行热图分析。
2 结果与分析
2.1 酵母发酵剂对百合原料的适应性
为了考察3种商业酵母对百合原料酿酒的适应性,开展了降糖速度、产酒精能力和pH值变化的动态测定实验,结果如图1所示。
图1 三种酵母发酵剂降糖速度的比较
Fig.1 Comparison of the speed of sugar content decline of three kinds of yeast starters
由图1可知,在发酵的0～2 d内,3种发酵剂的糖度均呈现迅速下降趋势,具体表现为:酵母F15和酵母CX9的降糖速度相近,但均低于安琪酵母的降糖速度;在第4天时,安琪酵母和酵母CX9的降糖速度比酵母F15更快;当发酵至4 d之后,酵母F15的降糖速度明显高于安琪酵母和酵母CX9。在第8天时,酵母F15酿酒残留糖度仅为8 °Brix。综上,发酵时间越久,酵母F15的发酵能力越优于安琪酵母和酵母CX9。
图2结果显示,在发酵的0～2 d内,酵母F15和酵母CX9的产酒精能力相似,都在快速上升,但安琪酵母的产酒精能力高于酵母F15和酵母CX9;在发酵的2～4 d内,安琪酵母、酵母F15和酵母CX93种酵母的产酒精量都在缓慢增加;在第4天时,酵母CX9的产酒精量最低,酵母F15的产酒精量略高于安琪酵母和酵母CX9;在发酵的第4～6天内,酵母CX9的产酒精量增加较快,安琪酵母和酵母F15的产酒精量低于酵母CX9;在发酵的第6天之后,酵母F15的产酒精量急剧增加。
图2 三种酵母发酵剂产酒精能力的比较
Fig.2 Comparison of alcohol production capacity of three yeast starters
由图3可知,3种酵母发酵剂的pH值均呈现先下降后上升趋势。在发酵的0～2 d内,由于酵母菌开始活跃生长并代谢糖分,酵母菌在有氧和无氧条件下都会进行呼吸作用,产生CO2,pH值骤然下降,其中酵母F15下降速度最快;在发酵至2 d之后,pH值开始上升,2～4 d内pH值上升幅度最大,这是由于氨基酸分解和糖代谢的滞后。
图3 三种酵母发酵剂pH值的变化
Fig.3 Changes in pH value of three yeasts starters
2.2 百合酒的感官评价
如图4所示,酵母F15最具有百合典型性特征,百合香味、滋味最浓郁,感官评分达到87分。酵母CX9发酵酒感官评分70分,安琪酵母发酵酒感官评分75分。综上所述,感官评价最好的是酵母F15发酵百合酒。
图4 感官评价雷达图
Fig.4 Sensory evaluation radar chart
2.3 不同发酵剂发酵百合酒的理化指标
3种酿酒酵母发酵百合酒的理化指标如表3所示,从表中可以直观的看出,酵母F15具有明显的降糖速度快、产酒精能力强的优势。发酵8 d时酒精度为11.2%vol,残糖为8.3 °Brix,综合上述基本理化指标,结合感官评价,初步判断酵母F15为百合酒适宜发酵剂。
表3 不同发酵剂发酵百合酒的理化指标
Table 3 Physicochemical indexes of lily wines fermented with different fermentation agents starters
发酵剂酒精度/%vol残糖/°Brix感官评分酵母F1511.28.387酵母CX99.610.370安琪酵母8.710.6775
2.4 不同发酵剂和百合浊汁中挥发性风味物质种类及含量
不同发酵剂发酵百合酒及百合浊汁挥发性风味物质检测结果见电子版增强出版附表1(https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.041432)。共检测出89种风味化合物,3种酒均含有的风味化合物有37种,其中辛酸乙酯、癸酸乙酯和苯乙醇在不同酵母酿造的酒中含量都比较高。酵母CX9、酵母F15、安琪酵母发酵酒中风味物质种类分别为52、70和61种,酵母F15发酵酒中挥发性风味物质种类最多。百合浊汁中挥发性风味物质有15种,发酵之后挥发性风味物质种类和含量都大幅度增加。实验结果表明酵母CX9发酵酒中辛酸乙酯含量达到(1 750.169 7±819.350 7) μg/L,癸酸乙酯为(1 609.596 4±703.629 2) μg/L,苯乙醇含量为(1 822.890 3±785.009 2) μg/L。酵母F15发酵酒中辛酸乙酯含量达到(1 454.495 3±235.198 2) μg/L,癸酸乙酯为(1 484.781 0±371.236 7) μg/L,苯乙醇含量为(2 301.272 1±85.703 3) μg/L。安琪酵母发酵酒中辛酸乙酯含量达到(970.832 1±413.717 2) μg/L,癸酸乙酯为(1 060.877 0±559.832 7) μg/L,苯乙醇含量为(1 963.435 9±230.608 5) μg/L。大多数醇是酵母发酵的副产物,而一些醇是由碳酸和氨基酸的脱氨作用产生的。萜烯类风味物质虽然在酒中的感官阈值较低,但其浓郁的花香和果香味是百合中特征香气的主要贡献者[24]。
2.5 挥发性物质聚类分析
对挥发性风味物质进行热图分析,确定不同发酵剂发酵酒的香气特征,图5是酵母CX9,酵母F15,安琪酵母3种不同发酵剂发酵酒的热图,蓝色区域表明挥发性物质含量最高,构成了百合酒的独特风味。酵母F15发酵酒中主要挥发性风味物质有苯乙醇、缩醛、乙酸己酯等;酵母CX9发酵酒中主要挥发性物质有辛酸乙酯、癸酸乙酯、壬酸乙酯等;安琪酵母发酵酒中主要挥发性风味物质有丁基羟基甲苯、1-癸醇等。如图5所示,其中酵母F15发酵酒的蓝色区域面积最大,挥发性风味物质含量最高。
图5 百合酒挥发性物质含量热图
Fig.5 Heat map of volatile matter content of lily wine
2.6 基于ROAV分析百合酒的关键香气成分
使用ROAV方法进一步确定百合酒发酵过程中对风味有重要贡献的关键挥发性化合物,结合挥发性风味物质的阈值,确定原汁中的关键香气成分。ROAV评分在0.1～1的物质对风味有修饰作用,而ROAV评分在1～100的物质是影响风味的关键物质[25]。如表4所示,主要呈味物质是正己酸乙酯、癸酸乙酯、辛酸乙酯、庚酸乙酯、乙酸苯乙酯、苯乙醇;辅味物质有苯乙烯、壬酸乙酯等。酵母F15发酵酒中ROAV评分在1～100的有9种;安琪酵母发酵酒中有8种;酵母CX9发酵酒中有6种。酵母F15发酵酒中具有重要贡献的关键挥发性化合物最多,赋予了百合酒水果香、脂肪香、花香、玫瑰香,其中癸酸乙酯ROVA最高,可赋予百合酒浓郁的水果香。百合浊汁中挥发性物质含量太低,没有达到嗅觉阈值,因此没有产生明显的香气,与发酵相关的物质有正己酸乙酯、癸酸乙酯、辛酸乙酯、庚酸乙酯、乙酸苯乙酯、缩醛、苯乙醇等。
表4 百合酒中关键挥发性风味物质
Table 4 Key volatile flavor substances in lily wine
序号CAS号挥发性成分阈值/(μg/kg)ROAV酵母CX9酵母F15安琪酵母香气描述酯类2035-99-6辛酸异戊酯870.090.100.13水果香628-97-7棕榈酸乙酯2 0000.020.010.02水果香、奶油味142-92-7乙酸己酯1150.020.05-水果香124-06-1十四酸乙酯4 000--0.47椰香123-92-2乙酸异戊酯5000.01-0.01香蕉味123-66-0正己酸乙酯54.534.734.22甜味、水果香123-29-5壬酸乙酯3770.010.010.01水果香112-17-4乙酸癸酯2250.010.020.03水果香112-14-1醋酸辛酯450-0.010.01茉莉香
续表4
序号CAS号挥发性成分阈值/(μg/kg)ROAV酵母CX9酵母F15安琪酵母香气描述酯类110-38-3癸酸乙酯5100.00100.00100.00水果香106-33-2月桂酸乙酯5 9000.030.020.03花香106-32-1辛酸乙酯707.777.006.54水果香106-30-9庚酸乙酯1.90.722.421.24朗姆味103-45-7乙酸苯乙酯202.223.362.74花香、蜂蜜味萜烯类100-42-5苯乙烯650.000.02-花香醛酮类3796-70-1香叶基丙酮60-2.94-水果香112-31-2癸醛4.12.326.301.74玫瑰香111-13-7仲辛酮500.280.020.03泥土味105-57-7缩醛4.90.280.020.03泥土味104-67-6桃醛2.1-0.01-水果、奶油香98-86-2苯乙酮650.54-0.39花香醇类505-10-23-甲硫基丙醇123.230.050.160.19甜味112-53-8十二醇1612.5817.2220.56脂肪香112-30-11-癸醇25-0.010.01酒香111-87-5正辛醇125.80.010.010.01柑橘、玫瑰香111-70-6正庚醇3300.010.010.01柑橘香111-27-3正己醇820-0.380.42甜味78-83-1异丁醇6 505.20.04--绿茶香71-41-0正戊醇1 600-0.01-杂醇油味60-12-8苯乙醇450.491.142.01玫瑰香其他334-48-5正癸酸10 0000.130.220.27水果香128-37-0丁基羟基甲苯5000.050.040.06橡胶味124-07-2辛酸3 0000.01-0.01水果香
注：-表示在商业酵母中未检出该呈味物质。
2.7 PCA结果分析
对3种不同发酵剂发酵酒进行主成分分析,如表5所示提取到8个主成分,如图6所示,PC1和PC2总方差贡献率分别为41.5%、29.3%。3种不同发酵剂发酵酒挥发性物质有差异,其中酯类和醇类对风味影响最大。综上所述,结合ROVA分析,酵母F15是百合酒最适发酵剂。
图6 PCA得分图
Fig.6 PCA scoring plot
表5 主成分特征值及方差贡献率
Table 5 Principal component eigenvalues and variance contribution
PC特征值方差贡献率/%累计方差贡献率/%137.75741.541.5226.62629.370.8314.68616.186.944.4694.991.852.5362.894.662.1442.497.071.6981.998.981.0841.1100.0
3 结论
本实验基于百合酒酿造工艺流程体系,以酒精度和降糖速度为依据,通过感官评分、原料适应性评价,结合顶空固相微萃取气质联用技术对百合酒中挥发性风味物质进行测定分析,采用相对气味活性值和主成分分析法,比较百合酒酿造的适宜商业酵母发酵剂。结果表明酵母F15发酵剂具有高酒精度、降糖速度快的特点;酵母F15产酯香物质种类多、含量高,且高级醇类物质含量低,优于其他2种发酵剂,适宜酿造百合酒。该发酵剂所酿百合酒成品呈现出色泽鲜艳、清澈透明,酒体丰满厚重,完美展示了百合酒特有的风味特点。
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