γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)是一种由L-谷氨酸钠在谷氨酸脱羧酶(glutamic acid decarboxylase,GAD)作用下产生的四碳氨基酸,广泛存在于微生物与动植物体内[1]。GABA是一种抑制性神经递质,与受体特异性结合后发挥降血压、抗焦虑、改善睡眠等多种生理功能[2-3]。随着社会压力的增大与年龄的增长,身体产生GABA的能力下降,补充适量的GABA能够改善焦虑和睡眠[4]。
GABA的生产方法有化学合成法、植物富集法和微生物发酵法[5]。化学合成法的反应温度高,常使用腐蚀性试剂,生产成本高且安全性低。植物富集法通过改变外界环境,使植物产生应激反应进而提高GABA产量[6]。植物富集法存在基质复杂,提取困难,成本高等问题,不适合工业化生产。微生物发酵法具有安全性高、成本低、周期短、不受资源和环境的限制等优点,成为了规模化生产GABA的理想途径,近年来成为研究热点。微生物发酵法生产GABA常用的菌种有酵母菌、霉菌、乳酸菌、大肠杆菌[7-8]。霉菌生长缓慢、发酵周期长,且有时会代谢毒素,因此实用性和安全性不高。酵母菌普遍GAD活力不足,因此GABA产量较低。乳酸菌是公认的食品安全级微生物,具有调节肠道菌群、抗氧化、提高机体免疫力等多种生理功能[9-10]。乳酸菌GAD活性普遍高于其他菌株,利用乳酸菌生产GABA在食品及医药领域更具优势。
本研究从酸菜中筛选出高产GABA的乳酸菌,对菌株发酵液中的GABA进行定性定量,对菌株的生长特性、产酸能力、耐酸耐胆盐能力、耐胃肠液能力、自凝聚能力和表面疏水性等益生特性进行分析,为今后利用乳酸菌生产GABA提供菌种资源,为后续GABA功能性食品的开发奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌种来源
本实验所用的菌株分离自农家自制酸菜。
1.1.2 药品及试剂
MRS培养基,青岛海博生物技术有限公司;L-谷氨酸钠、胃蛋白酶、胰蛋白酶,北京索莱宝科技有限公司;正丁醇、无水乙酸、茚三酮、硼酸、NaOH、苯酚、次氯酸钠、二甲苯,胆盐,上海沪试有限公司;GABA标品,坛墨质检标准物质中心;盐酸,安徽金奥冠新材料科技有限公司。
1.1.3 仪器与设备
BKQ-B50Ⅱ立式高压蒸汽灭菌锅,济南爱来宝医疗科技有限公司;ZWYR-D2401恒温振荡器,上海智城分析仪器制造有限公司;SW-CJ-1F超净工作台,成都市苏净科学器材有限公司;DNP-9022电热恒温培养箱,上海精宏有限公司;HH-S4A电热恒温水浴锅,北京能克方圆科技有限公司;PB-10 pH计,赛多利斯有限公司;CPJ3102电子天平,奥豪斯有限公司;Multiskan FC酶标仪、Multifuge X1R高速离心机、Evolution200紫外分光光度计,赛默飞世尔科技公司。
1.2 实验方法
1.2.1 菌种的分离与纯化
将酸菜汁接种到50 mL MRS肉汤培养基中,37 ℃,160 r/min培养24 h,取0.5 mL菌液梯度稀释,取20 μL稀释后菌液接种到MRS固体培养基涂布,37 ℃培养24 h。挑取单菌落在MRS固体培养基进行平板划线,37 ℃培养24 h,重复平板划线3次。
1.2.2 薄层层析法定性测定
将菌液以体积分数4%的接种量,接种至50 mL MRS发酵培养基(MRS液体培养基+10 g/L L-谷氨酸钠)中37 ℃,160 r/min培养48 h,发酵液于4 ℃,12 000 r/min离心5 min,取上清液进行薄层层析。
参考李欢等[11]的方法进行薄层层析法定性测定,展开剂为V(水)∶V(无水乙醇)∶V(正丁醇)=3∶1∶4,加入质量分数为0.4%茚三酮溶液作为显色剂。参比选择1 g/L GABA标准品和1 g/L L-谷氨酸钠,取1.5 μL发酵上清液点样,层析后放置90 ℃烘箱10 min。
1.2.3 Berthelot比色法定量测定
参考王冰聪[12]的方法进行Berthelot比色法定量测定,配制0、0.10、0.40、0.60、1.00、2.00、4.00 g/L 的GABA标准溶液,稀释4倍后取各浓度标准液0.5 mL,加入0.2 mL硼酸盐缓冲液(0.2 mol/L,pH=9.0),1 mL体积分数为6%苯酚溶液和0.4 mL体积分数为9% NaClO溶液。振荡2 min后放入沸水水浴10 min,再冰浴20 min,振荡2 min后加入2 mL体积分数为60%乙醇溶液,于645 nm波长下检测吸光度。建立标准曲线后,发酵上清液处理同1.2.3节。
1.2.4 乳酸菌的形态学鉴定
将纯化好的菌种在MRS固体培养基上进行平板划线,37 ℃培养24 h,观察菌落形态、颜色、边缘隆起,挑取单菌落进行革兰氏染色,观察菌体形态特征。
1.2.5 乳酸菌的分子生物学鉴定
16S rDNA序列委托华大基因科技有限公司测定。测定引物分别为AGAGTTTGATCCTGGCTCAG、TACGGCTACCTTGTTACGACTT。PCR反应体系(总体积25 μL):PCR Mix 21 μL,Primer F和Primer R各1 μL,DNA模板2 μL。PCR扩增条件:96 ℃预变性5 min,96 ℃变性30 s,56 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,35个循环,72 ℃再延伸5 min,4 ℃保存。将测序结果与GenBank数据库中已知序列进行BLAST比对,采用MEGA 11.0构建系统发育树。
1.2.6 生长曲线、产酸曲线和GABA产量积累曲线的测定
菌株以体积分数1%的接种量,接种MRS肉汤培养基中37 ℃,160 r/min培养24 h,每间隔2 h检测菌株发酵液在600 nm的吸光度和pH值。以1%的接种量,将菌株接种到MRS肉汤培养基中,37 ℃,160 r/min培养48 h,每间隔4 h检测发酵液GABA含量。
1.2.7 耐酸与耐胆盐能力的测定
菌株以体积分数1%的接种量,分别接种到pH=4、pH=3、胆盐质量浓度1 g/L的MRS肉汤培养基中,37 ℃,160 r/min培养,在0、2、4 h取菌株发酵液进行梯度稀释,取10 μL稀释后的菌株发酵液于MRS固体培养基上涂布,37 ℃培养24 h,进行平板活菌计数和存活率计算,如公式(1)所示:
菌株存活率
(1)
式中:A0,0 h活菌数,CFU/mL;A1,处理后活菌数,CFU/mL。
1.2.8 耐胃肠液能力的测定
将菌液4 ℃,12 000 r/min离心5 min,生理盐水洗涤沉淀后再离心,3 mL人工胃液(pH=3,3 g/L胃蛋白酶)与沉淀混匀,37 ℃培养3 h,取1 mL处理后的菌液与9 mL人工肠液混合,37 ℃培养2 h。计算菌株在人工胃肠液的活菌数和存活率。
1.2.9 自凝聚与表面疏水性的测定
将菌液4 ℃,12 000 r/min离心5 min,生理盐水洗涤沉淀后再离心,用生理盐水重悬至OD600=0.5±0.02,37 ℃静置培养,0、2、4、6、8 h取上清液测定波长600 nm处的吸光度,自凝集性计算如公式(2)所示:
自凝集性
(2)
式中:A0,0 h吸光度;A1,菌液静置后的吸光度。
将菌液4 ℃,12 000 r/min离心5 min,生理盐水洗涤沉淀后再离心,用生理盐水重悬至OD600=0.4±0.05,取2 mL菌液与同体积二甲苯混合,振荡后静置,取1、2、3 h混合物的下层水相,测定600 nm处的吸光度,疏水作用力计算如公式(3)所示:
疏水作用力
(3)
式中:A0,菌液与二甲苯混合前的吸光度;A,菌液与二甲苯混合后的吸光度。
1.3 数据处理
实验数据使用Origin、Excel进行作图和数据统计分析,实验均重复3次,数据以“平均值±标准差”表示。
2 结果与分析
2.1 产GABA菌株的筛选
通过薄层层析法对GABA进行定性。由图1-a可知,各菌株发酵液有和GABA标准品Rf值相同的部分,其中菌株C1和G6-2的颜色较深,产GABA的能力较强。
a-菌株发酵液薄层层析;b-菌株发酵液GABA含量
图1 菌株发酵液的薄层层析图和GABA含量图
Fig.1 Thin layer chromatography and GABA content of the fermentation broth of the strain
通过Berthelot比色法对GABA进行定量。GABA含量的线性回归方程为y=0.181 7x-0.005 5,R2=0.999 3。参照薄层层析的结果,选取6株高产GABA的菌株发酵液进行定量。由图1-b可知,C1菌株发酵液GABA含量最高,为1.45 g/L。
2.2 菌株的形态学特性
结果如图2所示,6株菌的菌落为乳白色,表面光滑湿润,中央突起,对各菌株进行革兰氏染色,菌株均为革兰氏阳性菌,其中C5为球形,其他菌株均为短杆状。
a-菌落形态图;b-菌体形态图
图2 菌株的菌落形态图和菌体形态图
Fig.2 The colony morphology and cell morphology of the strain
2.3 乳酸菌的分子生物学鉴定
对6株高产GABA乳酸菌进行16S rDNA测序。如表1所示,C1为布氏乳杆菌(Lactobacillus buchneri),C5为戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus),G5-2、G6-2、H6、I3-1均为植物乳植杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)。
表1 乳酸菌鉴定结果
Table 1 Identification results of lactic acid bacteria
菌株编号菌株种类拉丁文I3-1植物乳植杆菌L.plantarumG5-2植物乳植杆菌L.plantarumG6-2植物乳植杆菌L.plantarumH6植物乳植杆菌L.plantarumC1布氏乳杆菌L.buchneriC5戊糖片球菌P.pentosaceus
2.4 生长和产酸曲线
由图3-a可知,6株乳酸菌生长曲线呈“S”型,C1与C5从2 h开始率先进入对数生长期,2～16 h为对数生长期,最终C1的OD600值最高为2.39。由图3-b可知,C1与C5从2 h发酵液pH迅速下降,与生长曲线趋势一致,从12 h开始C1的菌浓度和产酸能力反超C5。最终G5-2产酸效果最好,pH值为3.76,C1发酵液pH值为3.83。
a-生长曲线;b-产酸曲线
图3 菌株的生长曲线和产酸曲线
Fig.3 The growth curve and acid production curve of the strain
2.5 GABA产量积累曲线
GABA的产量积累受到GAD活性影响。L-谷氨酸钠在GAD作用下脱羧消耗质子产生GABA,是乳酸菌抵抗酸胁迫、维持细胞内酸碱平衡的重要方式[13]。不同菌株的GAD活性和GAD最适pH不同,环境pH值在GAD最适pH范围时GAD活性最强[14]。GABA的发酵过程分为菌体生长阶段和GABA合成阶段[15]。由图4可知,0～16 h布氏乳杆菌C1处于菌体生长阶段,GABA产量积累缓慢,16 h时培养基pH值达到3.96,菌株GAD活性良好,GABA产量积累迅速,48 h时GABA产量达到1.45 g/L。
图4 GABA产量积累曲线图
Fig.4 GABA yield accumulation curve
2.6 乳酸菌耐酸能力
在胃液低pH下存活是乳酸菌发挥益生功能的前提。由表2可知,6株乳酸菌在pH=4时存活率菌超过100%,可以正常生长繁殖。在pH=3时G6-2存活率最高为95.50%,C5存活率最低为17.38%,H6和C1存活率也较为良好,分别为87.10%和83.18%。
表2 不同菌株的耐酸能力
Table 2 Acid resistance of different strains
菌株pH=4 pH=30 h活菌数/(lg CFU/mL)4 h活菌数/(lg CFU/mL)存活率/%0 h活菌数/(lg CFU/mL)4 h活菌数/(lg CFU/mL)存活率/%I3-17.23±0.957.36±0.95134.907.53±0.957.17±1.2443.65G5-27.21±0.857.57±1.14229.097.51±0.987.41±0.8779.43G6-27.27±1.177.77±0.75316.237.43±1.157.41±0.9495.50H67.39±1.167.66±0.89186.217.49±0.847.43±1.0587.10C17.32±1.117.49±0.95147.917.31±1.187.23±0.8483.18C57.06±0.797.11±0.93112.207.11±0.996.35±1.0717.38
2.7 乳酸菌耐胆盐能力
胆盐由肝细胞分泌,参与脂肪的消化和吸收。小肠中存在一定浓度的胆盐,乳酸菌在肠道定殖需要一定的耐胆盐能力。由表3可知,I3-1、G5-2、G6-2、H6四株乳酸菌不耐受胆盐,C1的存活率最高,2 h和4 h存活率分别为95.50%和85.11%。
表3 不同菌株的耐胆盐能力
Table 3 Bile salt tolerance of different strains
菌株0 h活菌数/(lg CFU/mL)2 h活菌数/(lg CFU/mL)4 h活菌数/(lg CFU/mL)2 h存活率/%4 h存活率/%I3-17.51±1.170000G5-27.50±0.870000G6-27.58±0.940000H67.68±1.030000C17.68±0.987.66±1.087.61±0.8895.5085.11C57.39±0.896.98±0.956.94±1.0238.9035.48
2.8 耐胃肠液能力
耐胃肠液能力可反映菌株在消化道环境中的耐受能力。由表4可知,在人工胃液中培养3 h后C1存活率最高,达到69.18%,转入人工肠液再培养2 h后为12.30%。其他菌株在人工胃肠液的存活率均较低。
表4 不同菌株的耐胃肠液能力
Table 4 Gastrointestinal fluid resistance of different strains
菌株0 h胃液培养3 h肠液培养2 h胃液培养3 h肠液培养2 h活菌数/(lg CFU/mL)活菌数/(lg CFU/mL)活菌数/(lg CFU/mL)存活率/%存活率/%I3-17.61±1.036.57±0.986.15±0.849.123.47G5-27.94±0.936.90±1.026.70±0.949.125.75G6-27.81±0.976.64±0.956.65±1.026.766.92H67.83±0.886.58±0.926.56±0.985.625.37C17.74±1.127.58±1.056.83±1.0769.1812.30C57.77±0.866.83±1.075.78±0.9111.481.02
2.9 自凝聚性和表面疏水性
研究表明,自凝聚性和表面疏水性与Caco-2细胞黏附率呈正相关,在益生菌肠道定殖中发挥重要作用[16]。由图5-a可知,2 h时C1自凝聚性最强达到14.19%,4、6、8 h时H6凝集性最强分别为33.57%、39.54%和42.36%。C1在4、6、8 h时凝集性为18.84%、26.65%和29.20%。由图5-b可知,H6的表面疏水性最强,在3 h达到73.81%。C1的表面疏水性较弱,在3 h达到55.56%。
a-自凝聚性;b-表面疏水性
图5 菌株的自凝聚性和表面疏水性
Fig.5 Self-agglomeration ability and surface hydrophobicity of the strain
3 讨论与结论
随着生活节奏的加快和生活方式的改变,人们常常出现失眠、焦虑、血压升高等症状。GABA作为一种抑制性的神经递质,具有帮助睡眠、缓解焦虑、降血压等功效[17]。乳酸菌是是公认的食品安全级微生物,同时也是益生菌,具有调节肠道菌群、抗氧化、提高机体免疫力等多种生理功能。选择乳酸菌生产GABA具有安全、高效、成本低廉等多种优势,所以筛选高产GABA且具有良好益生特性的乳酸菌是市场的迫切需求。本研究选用农家自制酸菜为原料,对高产GABA且益生特性良好的乳酸菌进行筛选鉴定和分析。
本研究从酸菜中筛选得到6株高产GABA的乳酸菌,布氏乳杆菌(L.buchneri)C1菌株发酵液GABA含量最高,为1.45 g/L。吕欣然等[18]从东北传统腌渍蔬菜中筛选出植物乳植杆菌,GABA产量为0.48 g/L。王清清等[19]对乳酸菌进行航天诱变,得到植物乳植杆菌L1-51和乳酸片球菌L21-48,GABA产量分别为0.77 g/L和0.48 g/L,两菌株共培养响应面优化后GABA产量为1.68 g/L。马莉等[20]从浆水中分离出植物乳植杆菌,对GABA产量进行响应面优化,最终产量为0.78 g/L。李朔[21]从发酵食品中发现一株GABA产量2.114 g/L的植物乳植杆菌,进行发酵条件和培养基优化后GABA产量达到6.152 g/L。施生玲等[22]从牦牛乳酸奶中筛选出GABA产量1.8 g/L的乳酸菌,进行发酵条件优化后GABA产量达到4.11 g/L。金忆文[23]从传统泡菜中筛选出GABA产量5.64 g/L的短乳杆菌,后对该菌株进行气液相等离子体诱变促使菌株GABA产量提高4.37%。林杨[24]从传统发酵乳制品中筛选出高产GABA的戊糖乳杆菌,利用常压室温等离子体诱变和发酵培养条件优化后GABA产量达到3.69 g/L。研究者以L-谷氨酸代替L-谷氨酸钠作为发酵底物,对发酵培养基进行优化后进行分批发酵,最终GABA产量高达205 g/L[25]。面团发酵剂中分离出的高产GABA乳酸菌,采用响应面法优化发酵条件,GABA产量达到49.42 g/L[26]。传统发酵饮料中分离出的希氏乳杆菌,通过发酵条件优化和补料分批发酵,GABA产量达到239 g/L[27]。
乳酸菌在胃肠环境存活并发挥益生功能,需要具备良好的生长速度、耐酸耐胆盐能力、耐胃肠液能力、自凝聚性和表面疏水性。C1的生长繁殖速度最快,24 h时OD600值为2.39。G5-2、G6-2、H6和C1的产酸效果较好,24 h时发酵液pH值分别为3.76、3.77、3.78和3.83。G6-2、H6和C1的耐酸能力较强,存活率分别为95.50%、87.10%、83.18%。C1的耐胆盐能力最强,存活率为85.11%,I3-1、G5-2、G6-2和H6四株乳酸菌不耐胆盐,存活率都为0。C1的耐胃肠液能力最强,存活率为12.30%。2 h时C1自凝聚性在6株菌中最强达到14.19%,4、6、8 h时C1自凝集性为18.84%、26.65%和29.20%。C1的表面疏水性,在3 h达到55.56%。孙世鑫等[28]筛选出高产GABA乳酸菌,24 h时OD600值为0.8,发酵液pH值为5.5,耐酸实验中存活率为65%,不耐胆盐,4 h时自凝聚性和表面疏水性不足10%。吕欣然等[18]筛选出高产GABA乳酸菌,24 h时OD600值为1.9,发酵液pH值为3.7,耐酸实验中存活率为28.33%,耐胆盐实验存活率为55.56%。马莉[29]的植物乳植杆菌不仅生长繁殖能力强,而且在0.3%的高胆盐和pH值2.5的酸性环境下培养3 h后存活率仍在85%以上。徐毓琴等[30]从泡菜中筛选出的植物乳植杆菌,pH值2.0条件下培养4 h后存活率接近100%,0.3%胆盐条件下培养4 h后存活率为9.26%～2.78%。可见对比其他菌株,布氏乳杆菌C1具有良好的生长速度、产酸能力、耐酸耐胆盐能力、自凝聚性和表面疏水性。
综上所述,本研究从农家酸菜中中分离得到高产GABA且益生特性良好的布氏乳杆菌C1,GABA产量为1.45 g/L。该菌株生长繁殖速度快,产酸效果好,具有良好的耐酸耐胆盐能力和耐胃肠液能力,具有一定的自凝集性和表面疏水性。本研究为今后利用乳酸菌生产GABA提供菌种资源,为后续GABA功能性食品的开发奠定基础。
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