大方豆干贮藏期微生物群落及品质变化分析

大方豆干富含蛋白质、维生素、矿物质等营养物质[1],是贵州省毕节市大方县的地理标志产品,炙烤煎炸后的豆腐干豆香扑鼻、外酥里嫩、口感上佳,也是大方豆干火锅的主角,深受消费者喜爱。大方豆干制作时用黄浆水自然发酵的酸汤作为点卤剂,与CaSO4和MgCl2点卤的豆腐相比,在感官评价、质构、产量等方面具有更好的品质[2]。但是由于大方豆干目前多以小作坊形式进行生产,规范化、标准化程度不够,极高的水分含量和丰富的营养使得大方豆干成为微生物生长的合适基质,有研究发现部分腐败菌是在生产过程中引入的[3]。假单胞菌属、不动杆菌属、葡萄球菌(Staphylococcus)和肠杆菌科细菌等在腐败的豆制品中较常见[4],真菌也是导致豆腐腐败的重要原因,而且部分真菌毒素会积累并威胁人类和动物的生命[5]。微生物的生长和新陈代谢是豆制品腐败变质的主要原因,大方豆干易腐败变质、货架期短的问题是阻碍其工业化扩大生产的瓶颈。因此,研究大方豆干腐败菌相组成并找到合理的控制大方豆干微生物生长的措施,是提升大方豆干产量规模、扩大销售半径、降低食品安全问题发生概率亟待解决的问题。

高通量测序(high-throughput sequencing,HTS)因其信息量大、效率高的优点作为新一代测序技术对于阐明主要微生物至关重要[6],可有效弥补传统培养法在鉴定上的不足,能够更加准确、全面反映样本的微生物群落组成及其多样性。目前,大方豆干的标准化、规模化生产程度较低,且关于大方豆干中微生物群落相关研究鲜有报道。本研究对大方豆干在3个温度贮藏期的pH值、感官评分、菌落总数以及质构特性做出分析,基于扩增子测序分析大方豆干在3个温度下贮藏期的菌相演替变化规律,确定优势腐败菌,以期提高对大方豆干贮藏过程的品质变化、细菌和真菌多样性的认识,为其贮藏保鲜技术提供基础数据,为加快大方豆干标准化、规模化生产奠定基础。

1 材料与方法

1.1 大方豆干制备及取样

自制大方豆干制作工艺参照DB5205/T 6—2020《地理标志产品大方豆干(大方手撕豆腐)》中的方法和要求在食品加工实验室制备,点卤剂为自然发酵的黄浆水。将制作好的大方豆干分为3份,分别在37、25、4 ℃下贮藏,分别每隔6 h、12 h、3 d取样。

1.2 主要仪器与设备

T100型PCR扩增仪,美国Bio-Rad公司;Novaseq6000测序仪,美国 Illuimina公司;JE203型电子天平,上海浦春计量仪器有限公司;DW-HL218超低温冰箱,中科美菱低温科技股份有限公司;TMS-Pro 物性分析仪,美国FTC公司;PHS-3C型pH计,上海越平科学仪器有限公司。

1.3 pH、菌落总数及感官评价

1.3.1 pH、菌落总数

贮藏过程中菌落总数的测定参照GB 4789.2—2022《食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定》;pH值的测定参照GB 5009.237—2016《食品安全国家标准食品pH值的测定》。

选择10名具有一定评审技能的专业人员(5男5女),参照郑玉玺[7]的感官评分表并稍作修改,对样品的气味、色泽、口感、组织状态进行感官评价,结果取平均值。感官评分标准如表1所示。

1.4 质构特性

质构测定:取厚薄相对均匀的大方豆干,平均修剪为1.8 cm×1.8 cm左右大小(约四等分),注意避开存在缺陷的样品。将样品置于质构仪上采用二次下压法于质构仪TPA模式下测定。具体参数设置如下:探头型号P50,起始力1 N,测试速度为2 mm/s,形变量40%,测定豆腐样品的硬度、胶黏性、咀嚼性和弹性。每个样品测定8次,去除偏差比较大的值,取剩余值的平均值。

1.5 高通量测序

将贮藏初期的新鲜样品编号为Xb;贮藏中期的样品分别编号为Z37b、Z25b、Z4b;贮藏后期的腐败样品分别编号为F37b、F25b、F4b进行取样(分组编号按Xb、Z37b、F37b、Z25b、F25b、Z4b、F4b的顺序为R1～R7);采用试剂盒提取基因组DNA,利用引物341F和806R对细菌的16S rRNA基因V3～V4可变区基因序列进行PCR扩增;利用ITS1F和ITS2对真菌ITS-1F可变区基因序列进行PCR扩增,后由诺禾致源科技(北京)有限公司基于Illumina NovaSeq 6000平台进行高通量测序。

1.6 统计分析及数据处理

参照BOKULICH等[8]的方法对原始测序数据进行质控、修剪、拼接、降噪、去除嵌合体后得到有效序列(effective tags),再进行标准化(抽平),并以100%的相似度进行聚类获得最终的扩增子序列变体(amplicon sequence variants,ASVs)以及特征表。利用R语言进行菌群多样性分析,并绘制菌群结构柱状图。理化指标实验均重复3次,折线图用Origin绘制,利用SPSS软件进行统计分析和方差分析,结果表示为“平均值±标准差”,不同字母表示差异显著(P<0.05)。

2 结果与分析

2.1 贮藏过程中pH、感官及菌落总数变化

实验室自制大方豆干工艺流程如下:

泡豆→磨浆→煮浆→点浆→压制→撒碱→冷藏24 h→成品

新鲜样品的pH值范围为中性偏碱。由图1可知3个温度贮藏下,随着时间的延长,豆干受微生物活动的影响而发生变质,产生氨基酸和有机酸等酸性物质,pH呈降低趋势,相对比较稳定;贮藏后期pH呈现轻微上升的趋势,可能是由于此阶段的微生物快速生长,新陈代谢产生了生物胺等碱性含氮物质[9]。新鲜大方豆干呈青白色,具有豆香味,感官得分9.38分;贮藏中后期,豆干香味变淡,表面出现黏腻感,感官评分显著下降;37 ℃第18 h、25 ℃第36 h、4 ℃第9天时,豆干发黄并呈现出酸臭味,达到感官拒绝状态。新鲜豆干的菌落总数为3.43 lg CFU/g,原因可能是实验室不能达到生产标准造成了一定的污染,随着贮藏时间的延长,菌落总数快速上升,3个温度趋势相似。

2.2 贮藏过程中质构特性的变化

不同贮藏温度下大方豆干的质构特性变化如表2所示,新鲜豆干软硬适中、质地紧密、韧性弹牙,不同温度贮藏下,硬度、弹性、咀嚼性整体皆呈下降趋势。硬度、咀嚼性在贮藏前期稍有上升,这有可能是因为初期大豆蛋白发生变性,从水与蛋白质结合的状态转变成蛋白质与蛋白质之间的作用;3个温度贮藏后期豆腐皆质地软榻、发酸变黏,胶黏性呈上升趋势,腐败微生物随着贮藏时间的延长活跃生长,产生蛋白酶诱导大豆蛋白降解,导致蛋白质网络的崩溃[10],这可能是硬度和咀嚼性降低的原因;新鲜样品的弹性最好,但贮藏期间豆干的弹性变化差异不显著,这与黄宝玲等[11]的研究结果相似。

2.3 微生物菌群α多样性分析

由表3可知,新鲜样品的Chao1指数最小,而其Shannon指数和Simpson指数都高于贮藏期样品,所以,新鲜样品细菌丰富度最低,多样性最高;25 ℃贮藏期间,Chao1指数大于其他2个温度贮藏的样品,样品细菌丰富度高于其他2组;4 ℃贮藏期间,Shannon指数和Simpson指数最小,样品细菌群落多样性最低。由表4可得25 ℃贮藏后期,Chao1指数、Shannon指数、Simpson指数都是最小的,样品真菌物种丰富度和均匀度最低。3个温度贮藏期间真菌Chao1指数、Shannon指数、Simpson指数整体皆呈下降趋势,表明在贮藏过程中真菌多样性和丰富度整体降低,原因可能是贮藏过程中营养物质逐渐被消耗,后期优势腐败菌占主导地位,且温度越高下降越快,这与郑家铭等[12]的研究结果相似。37 ℃贮藏末期Chao1指数大于另外2组,可能是由于高温适宜部分真菌的生长,真菌多样性和丰富度较高。

2.4 大方豆干贮藏过程的细菌群落组成

从不同贮藏温度下贮藏过程中取得的21个样品中共注释到的细菌隶属于8门、11纲、29目、45科、62属。基于门和属水平对不同温度贮藏期样品的细菌群落结构进行分析,结果如图2所示。由图2-a可知,在门水平上,新鲜样品的绝对优势菌门为变形菌门(Proteobacteria)(87.9%);37 ℃贮藏期优势菌门为厚壁菌门(Firmicutes),中期和后期的相对丰度分别为68.58%和74.11%;25 ℃贮藏中期变形菌门的相对丰度达到54.64%高于厚壁菌门,贮藏后期优势菌门变为厚壁菌门相对丰度达到54.30%;4 ℃贮藏过程中的优势菌门为变形菌门,中期和后期其相对丰度分别为80.53%和61.75%,拟杆菌门(Bacteroidetes)相对丰度达到25.20%远高于其他组。变形菌门、厚壁菌门和拟杆菌门也是导致干腌肉制品的变质和变味的主要菌门,其积累使得诺邓火腿的风味存在缺陷[13],在碎牛肉样本腐败菌中也占主导地位,相对丰度分别达到69.6%和29%[14]。

由图2-b可知,在属水平上,新鲜样品的细菌属种类最为丰富,other bacteria(相对丰度按从高到低排序30以后的其他菌群相对丰度之和)占比达36.13%,优势细菌属为肠杆菌属(Enterbacter)(25.75%);37 ℃贮藏中期优势细菌属为不动杆菌属(Acinetobacter)(24.39%),贮藏后期变为芽孢杆菌属(Bacillus)(38.18%)。贮藏过程中芽孢杆菌主要诱导大豆蛋白降解,其生长导致蛋白质网络的崩溃和主要大豆蛋白的降解,尤其是11S球蛋白的酸亚基,此外,芽孢杆菌发酵后大豆蛋白中β-折叠和β-转角结构的含量降低,但α-螺旋增加。α-螺旋和β-折叠通常被认为是比无规则卷曲和β-转角更有规律的二级结构[10]。芽孢杆菌水解大豆蛋白过程中,由有序到无序的二级结构的构象转变导致了质构质量变差,硬度和咀嚼性大幅下降[15]。微生物大量消耗蛋白质降解产生的氨基酸,并发生脱氨和脱羧反应,产生氨和生物胺,这是高蛋白的肉类豆制品等贮藏后期质量变差产生臭味的原因,同样也导致贮藏后期pH轻微上升;25、37 ℃贮藏期细菌组成相似,但优势细菌属为不动杆菌,中期和后期相对丰度分别为43.99%和27.53%。与闫彦君等[16]的研究结果相似,不动杆菌属是整个豆腐皮常温贮藏期的优势菌属;4 ℃贮藏期间的主要细菌属与前2种温度下的细菌组成差异较大,优势细菌属为假单胞属(Pseudomonas),贮藏中期和后期相对丰度为69.88%和53.21%。咸淡水对虾和热带咸水虾低温贮藏过程中的主要微生物也是假单胞菌属[9,17],假单胞菌属的作用主要集中在N-乙酰基-D-苯丙氨酸和5-羟赖氨酸等物质的产生上,对尸胺和精胺的产生有潜在影响,这可能是影响大方豆腐气味变化的主要原因。

2.5 大方豆干贮藏过程的真菌群落组成

从21个豆干样品中共注释到的真菌隶属于9门、31纲、81目、179科、314属。基于门和属水平对不同贮藏过程中样品的真菌群落结构进行分析,结果如图3所示。由图3-a可知,在门水平上,新鲜样品的优势菌门为子囊菌门(Ascomycota)(53.44%);37 ℃贮藏中期优势菌门为子囊菌门(46.46%),后期变为担子菌门(Basidiomycota)(44.89%);25、4 ℃贮藏期的优势菌门都是担子菌门。与DING等[18]的研究结果相似,它们也是灰色腐乳所有发酵阶段的主要真菌门。

由图3-b可知,在属水平上,21个豆干样品中共注释到314个属,说明大方豆干贮藏过程中真菌多样性极其丰富,且在不同的贮藏温度下贮藏的样品在属水平上的分布差异较大,新鲜样品的优势菌属为曲霉菌属(Aspergillus)(33.52%),与永川豆豉发酵初期的优势真菌属相同[19];37 ℃贮藏期优势菌属为汉逊酵母属(Ogataea),中期和后期相对丰度分别为28.02%和23.10%;25 ℃贮藏中期优势菌属为节担菌属(Wallemia)(36.52%),后期变为丝孢酵母属(Cutaneotrichosporon)(73.82%),它是一种可以用作生物催化剂以提高油脂生产的含油酵母[20];4 ℃贮藏期间的优势菌属为红酵母属(Rhodotorula),中期和后期相对丰度分别为70.85%和69.67%。红酵母属是一种以产生β-胡萝卜素、γ-胡萝卜素等红色素而闻名的酵母属[21],而新鲜优质的豆腐呈浅黄色或白色,所以4 ℃下贮藏腐败的大方豆干表明会出现红色点状物质。

2.6 不同贮藏温度下大方豆干菌群的Beta多样性分析

为了更直观地揭示不同贮藏温度下豆干样品菌群的相似度,基于Weighted unifrac距离来进行主坐标分析[22],结果如图4所示。如图4-a所示,PC1和PC2的贡献率分别为69.33%和21.61 %,不同的样品分布在不同的象限,说明不同贮藏温度和时间下的微生物结构具有一定的差异性。新鲜样品和4 ℃贮藏期的样品单独分布在2个象限,说明这2组样品的细菌组成相比其他组差异较大;25、37 ℃贮藏期的样品分布在同一象限,说明这2组样品的细菌组成比较相似。由图4-b可知,PC1和PC2的贡献率分别为60.11%和12.17%,各个样品能较好地分离开,不同温度贮藏下真菌的组成也存在差异,R5组与其他组距离较远,结合图4-b分析,25 ℃贮藏后期的样品真菌组成与其他组差异较大。

3 结论

本研究将大方豆干放在3个温度贮藏,经过测定主要理化指标的变化,确定在未添加防腐剂的条件下,37、25、4 ℃下分别能贮藏18 h、36 h、9 d;3个温度贮藏期间理化指标变化趋势相似,受微生物活动的影响,pH逐渐下降后期轻微上浮;菌落总数逐渐上升,感官评分直线下降;硬度和咀嚼性先上升后下降,弹性有下降趋势但变化不明显。高通量测序结果表明,从21个样品中共注释到8个细菌门、62个细菌属、9个真菌门、314个真菌属,贮藏过程中菌群结构组成逐渐单一化,且温度越高下降越快。在门水平上,新鲜样品及4 ℃贮藏期的优势细菌门为变形菌门,37、25 ℃贮藏期的优势腐败细菌门厚壁菌门,25 ℃贮藏期的放线菌门相对丰度高于其他2组,厚壁菌门和放线菌门中细菌大多数是具有分解纤维素和粗蛋白功能的革兰氏阳性菌,对腐败过程具有较强的促进作用[23]。4 ℃贮藏期的优势腐败细菌门为变形菌门,低温抑制促腐菌的生长,却适宜变形菌的繁殖;在属水平上,新鲜样品的优势细菌属为肠杆菌属,37、25、4 ℃贮藏期的优势腐败细菌属分别为芽孢杆菌属、不动杆菌属、假单胞菌属,与刘梦竹等[24]的研究结果相似,鸡肉25 ℃贮藏期的优势细菌属为不动杆菌属,4、0 ℃贮藏期的优势细菌属为假单胞菌属。3个温度下的优势腐败细菌属不同,而郑家铭等[12]研究发现10、15、25 ℃贮藏下的巴氏杀菌乳的优势细菌属均为芽孢杆菌属;共有的优势真菌门为担子菌门、子囊菌门。在属水平上,新鲜样品的优势菌属为曲霉菌属,37、25、4 ℃贮藏期的优势腐败真菌属分别为汉逊酵母属、丝孢酵母属、红酵母属,3个温度下的优势腐败真菌菌群组成不同,而张文齐等[25]发现4种不同温度条件下采集保存的甘南牧区牦牛酸奶各分类水平真菌群落组成基本相同,仅组成比例不同。通过此研究,已经鉴定出不同贮藏温度下大方豆干的优势腐败菌属,旨在为大方豆干的贮藏保鲜技术提供指导,在后续研究中需要对其有针对性地进行监测和控制,以减少有害微生物的污染,可挑选添加绿色健康的保鲜剂,延长大方豆干的货架期。

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