树莓(Rubus idaeus L.)属于蔷薇科树莓属半灌木果树,又称“覆盆子”、“木莓”等,其分布广泛,种类丰富,目前已探明的树莓属有700多种,主要分布在北半球温带、寒带地区,在热带、亚热带和南半球也有少量分布。在我国境内生长种植的树莓品种有200多个,如常见的秋福、丰满红树莓、龙园秋丰、哈瑞太兹等。树莓果实色泽多样,以红色最为常见,还有黑色、紫色、黄色、蓝色等。红树莓果实色泽诱人,味酸甜,富含维生素、氨基酸、有机酸、花色苷等多种营养物质。有统计显示,截至2015年中国红树莓总产量已超过79 000 t,占世界红树莓总产量的18.58%,已成为红树莓生产大国[1]。
香气是评价树莓酒品质的重要指标,按其存在形式可分为游离态香气组分和结合态香气组分。游离态香气物质易被人们感知到,如醇类、酯类、醛类、萜烯类等,对树莓酒的风味形成具有重要作用。结合态香气物质通过糖苷键与单糖分子结合形成,由糖基(D-葡萄糖、L-阿拉伯糖等)、配基(萜烯类、脂肪醇类、羟基酯类、苯酚、苯基衍生物等)和糖苷键(β-糖苷键)组成[2],不具有呈香作用,但可在酸解或酶解过程中释放出具有挥发性的游离态香气物质,进而增加酒体风味,提高酒体品质。
中国的树莓产业虽然起步较晚,但因其保健功效和独特的风味、口感发展迅速,有关红树莓相关的科学研究和产品研发层出不穷,主要集中在红树莓中生物活性成分的分离鉴定和功能性评价[3],以及果酒、果汁、果酱等食品系列的开发方面[4]。尤其是树莓果酒,由于其独特的香气被越来越多的消费者青睐,例如,王家利等[5]研究了红树莓果主发酵和后发酵酒的游离态香气成分变化,发现乙醇、癸酸乙酯、辛酸乙酯等挥发性化合物在果酒主发酵和后发酵中变化明显。作者同时还对不同酵母发酵的红树莓果酒的游离态香气成分进行了较深入的研究,筛选出对红树莓果酒香气贡献较好性能的果酒酵母1399用于生产推荐[6]。另外,也有研究人员对红树莓酒陈酿期间的挥发性风味物质变化进行了分析,发现2,3-丁二醇、L-脯氨酸乙酯、乙基丁二酸单酯、异戊醇等挥发性化合物的相对含量较高[7]。此外,董曼等[8]研究了自然发酵和接种发酵2种不同发酵工艺对树莓酒游离态和结合态香气成分的影响,并采用气相色谱-嗅觉测定法(gas chromatography-olfactometry, GC-O)分析确定了乙酸乙酯、苯乙醇为主要游离态香气物质,庚酸和苯甲酸为主要结合态香气物质。但是纵观近10年的文献报道(在CNKI数据库以红树莓果酒为关键词进行检索)发现,目前有关红树莓果酒的研究主要集中在酿造工艺的优化、工艺对果酒品质以及活性成分的影响方面,有关红树莓果酒香气成分的研究仍然有限,特别是关于红树莓酒发酵阶段游离态和结合态香气成分变化情况的研究还鲜有报道。
因此,本研究以红树莓果实为原料,采用顶空固相微萃取结合气相色谱质谱(headspace solid-phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry,HS-SPME-GC-MS)联用仪,分析酒精发酵前期(pre-fermentation metabolism,PFM)、发酵中期(mid-stage of fermentation of alcohol,m-FA)和发酵结束(end-stage of fermentation of alcohol,e-FA)时红树莓酒游离态和结合态香气物质的种类与含量动态变化情况,并通过香气轮廓和主成分分析探究酒精发酵过程中红树莓酒游离态和结合态香气物质的气味特征变化,以期为树莓及发酵酒的品质提升研究积累一定的参考数据和理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
材料:红树莓(品种:哈瑞太兹;挑选果实大小、成熟度一致,无机械损伤,无病虫害的红树莓果),2022年采自甘肃定西地区。果实可溶性固形物为11.5°Brix,总酸含量为19.38 g/L,pH值为2.72。
试剂:氯化钠(分析纯)、二氯甲烷(分析纯)、甲醇(分析纯)、VITILEVURE CSM酿酒高活性干酵母,上海康禧食品饮业有限公司;2-辛醇、3-羟基己酸乙酯、C9～C20烷烃标样,Sigma-Aldrich公司。
1.2 实验方法
1.2.1 酿造工艺
红树莓酒的酿造工艺流程如下所示:
1.2.2 主要技术要点
红树莓浆果加入20%的水匀浆,添加30 mg/L的SO2(以偏重亚硫酸钾的形式),然后加入80 mg/L的果胶酶,接着接入0.6 g/kg活化酵母菌开始发酵,温度控制在20～22 ℃,每天搅拌3次,待比重降至1.0以下终止发酵(发酵时间约为8 d),进行分离过滤,酒样(加入15 mg/L SO2)在4 ℃下密封保存。
根据发酵工艺,按比重分别在酒精发酵前期(PFM)、发酵中期(m-FA)和发酵结束(e-FA)3个点取样,每个点取样量为250 mL,置于棕色瓶中,迅速在-20 ℃冰箱保存,每个处理重复3次。
1.2.3 指标测定
1.2.3.1 红树莓酒理化指标测定
酒精度参照GB 5009.225—2023《食品安全国家标准 酒和食用酒精中乙醇浓度的测定》确定,还原糖(葡萄糖计)、总酸(酒石酸计)、挥发酸(乙酸计)、pH参照GB/T 15038—2006 《葡萄酒、果酒通用分析方法》测定。参照吴娟弟等[9]的方法计算L*、a*、b*值。
1.2.3.2 挥发性化合物的提取与检测
参照WEN等[10]的方法提取游离态挥发性化合物,参照YUE等[11]的方法提取结合态挥发性化合物。
定性分析:借助NIST、Wiley和香精香料数据库的物质信息(选择匹配度大于800的检索程序完成),以及计算相对保留指数(差值绝对值小于50的化合物)综合判定。定量分析:采用内标法进行半定量分析[12],其中3-羟基己酸乙酯定量酯类物质,2-辛醇定量醛酮类、醇类、萜烯类等其他香气物质。
1.3 数据处理
利用Microsoft Office Excel 2019对实验所得数据进行处理,Origin 2021软件绘制柱状图、雷达图,主成分分析使用IBM SPSS Statistics 27判断凯泽-迈耶-奥尔金(Kaiser-Meyer-Olkin,KMO)抽样充分性度量值,Origin 2021绘制双标图。使用IBM SPSS Statistics 27中的Duncan’s多重比较在P<0.05下对数据进行差异显著性分析,使用在线软件Hiplot(https://hiplot.com.cn/cloud-tool/drawing-tool/list)绘制热图。
2 结果与分析
2.1 红树莓酒理化指标
对红树莓酒进行理化指标测定,结果见表1。发酵过程中酒精度、挥发酸含量呈上升趋势,发酵末期还原糖含量为5.80 g/L,挥发酸含量小于1.2 g/L,均符合GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》对果酒理化指标的要求。此外,通过颜色分析观察到,红树莓酒的颜色随发酵进行逐渐加深(L*值降低了5.39%,且P<0.05),e-FA较PFM红色(a*)和黄色(b*)颜色组分分别提高1.20%和45.64%(P<0.05),表现出深红色调的颜色状态。
表1 红树莓酒理化指标测定
Table 1 Physical and chemical parameters of red raspberry wines
酒精发酵酒精度/%vol还原糖/(g/L)总酸/(g/L)挥发酸/(g/L)pHL*a*b*PFM-73.07±0.06a18.61±0.01a-2.73±0.01c68.31±0.14a63.95±0.08b32.01±0.49cm-FA2.06±0.00a20.40±0.00b18.40±0.12b0.09±0.01b2.80±0.00b63.00±0.01c64.58±0.00a59.46±0.23ae-FA3.01±0.01b5.80±0.10c15.00±0.00c0.20±0.02a2.83±0.01a64.63±0.10b64.72±0.03a46.62±0.27b
注:“-”代表未检测到该物质。
2.2 红树莓果酒发酵过程中香气成分的变化
采用HS-SPME-GC-MS对供试样品的游离态和结合态挥发性成分进行定性和定量分析,共鉴定出61种香气化合物,其中游离态香气成分52种,结合态香气30种,包括醇类、醛类、酯类、萜烯类、酮类和酚类六大类化合物。
在红树莓果酒发酵的PFM、m-FA和e-FA阶段分别检测出33、42、44种游离态香气成分(附表1,https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.036801,下同)。三阶段共有的香气组分有25种,其中2-庚醇、辛酸乙酯、己酸乙酯、癸酸乙酯的含量相对较高。在PFM阶段,其香气组分的含量主要以醇类和酯类化合物为主,这与前人对树莓汁的研究结果一致[13]。醇类主要包括2-庚醇(19.97 μg/L)、1-辛烯-3-醇(0.77 μg/L)和1-壬醇(0.44 μg/L)等。其中2-庚醇具有水果香、花香;1-辛烯-3-醇具有蘑菇气味;1-壬醇具有青草香。酯类物质主要是乙基酯类化合物,包括具有花香和果香的辛酸乙酯(5.55 μg/L)和丁酸乙酯(1.60 μg/L),以及仅表现果香的癸酸乙酯(2.68 μg/L)、己酸乙酯(1.67 μg/L)和乙酸己酯(0.95 μg/L)。进入m-FA和e-FA阶段,酯类和醇类化合物在整体香气组分中占比逐渐增高,其中主要的香气组分为辛酸乙酯(454.80～836.63 μg/L)、乙酸异戊酯(328.00～375.72 μg/L)、己酸乙酯(80.63～391.26 μg/L)、正戊醇(80.35～128.69 μg/L)、癸酸乙酯(75.12～170.98 μg/L)。它们的存在使红树莓酒具有浓郁的果香、花香和少许青草香。此外,研究显示辛酸乙酯、乙酸异戊酯、己酸乙酯、癸酸乙酯还是草莓果酒的主要香气物质[14]。由此可知,红树莓发酵过程中香气以醇类和酯类为主,且随着酒精发酵的进行,香气化合物的含量整体呈现上升趋势,从PFM的36.81 μg/L增加到e-FA的2 133.85 μg/L。
与游离态香气物质相比,结合态香气物质在酒精发酵过程中香气物质的种类和含量都有所减少。PFM、m-FA和e-FA分别检测出25、30、30种(附表2),不同发酵时期共有的香气组分有25种,其中含量较高的分别为2-庚醇、2-乙基己醇和芳樟醇。随着发酵的进行,结合态香气组分的总含量差异不大,为24.57～29.39 μg/L。其中醇类化合物的总含量在发酵阶段最高(15.59～18.09 μg/L),其次是萜烯类(3.76～6.58 μg/L)、醛类(4.35～2.63 μg/L),而酮类和酚类的含量相对较低,e-FA分别占总含量的4.32%和0.04%。以上结果表明,醇类、醛类和萜烯类是红树莓酒中的主要的风味物质。因此,基于已报道的文献资料,并综合考虑各挥发性物质含量、阈值水平和气味活性值(odorant activity value,OAV)等因素,试验最终筛选出21种主要游离态香气物质和10种主要结合态香气物质进行具体分析[15-17]。
表2 红树莓酒酒精发酵过程中游离态和结合态香气物质的OAV
Table 2 OAV of free and bound aroma compounds during alcoholic fermentation of red raspberry wine
保留时间/min化合物阈值/(μg/L)OAV值APFMAm-FAAe-FABPFMBm-FABe-FA香气描述香气类型28.552-庚醇4100.050.060.050.020.030.02水果香、花香2、330.13正己醇8 000<0.01<0.01<0.01<0.01<0.01<0.01草本植物、青草味132.63反-2-己烯醇15 000<0.01<0.01<0.01 -<0.01<0.01青草香、水果气味1、334.571-辛烯-3-醇200.040.070.08-0.020.02蘑菇香、水果香、油脂1、3、434.86正庚醇2 500<0.01<0.01<0.01<0.01<0.01<0.01葡萄味336.362-乙基己醇260 000<0.01<0.01<0.01<0.01<0.01<0.01花香、脂肪气味2、439.27正辛醇3 000<0.01<0.01<0.01<0.01<0.01<0.01茉莉香、柠檬味2、343.401-壬醇600<0.010.010.02<0.01<0.01<0.01青草味151.57苯甲醇10 000<0.01<0.01<0.01<0.01<0.01<0.01果香、花香2、316.55异丁醇40 000-<0.01<0.01 - - -溶剂味、青草香1、522.71正戊醇1 000-0.080.13-<0.01<0.01辛辣、青草香1、647.30正癸醇500-<0.01<0.01 - - -花香252.84苯乙醇1 000-0.010.02<0.01<0.01<0.01玫瑰231.60反-3-己烯醇1 000-<0.01<0.01 - - -树脂、青草香138.532,3-丁二醇12 000--<0.01 - - -黄油、乳酪454.68月桂醇10 000----<0.01<0.01脂肪气味423.86己酸乙酯140.125.7627.95---草莓、苹果325.98乙酸己酯50.198.744.38---苹果、樱桃333.89辛酸乙酯600<0.010.761.39---花香、梨、白兰地酒香2、3、442.51癸酸乙酯2000.010.380.85---果香、椰子313.08丁酸乙酯200.080.070.11---丁香、草莓味、菠萝2、317.60乙酸异戊酯30-10.9312.52---果香、香蕉味329.10庚酸乙酯300-0.020.04---水果香、花香2、331.78辛酸甲酯200-0.230.34---柑橘香335.67乙酸辛酯12 000-<0.01<0.01---水果香340.77癸酸甲酯50-0.130.24---花香、果香2、349.38乙酸苯乙酯250-0.040.07---玫瑰花312.25α-蒎烯6<0.01 - ----松香气味138.75芳樟醇100.250.961.090.220.500.36玫瑰香、柑橘味2、348.75橙花醇300<0.01<0.01<0.01<0.01<0.01<0.01橙花、玫瑰、柠檬2、344.96α-松油醇330<0.01<0.01<0.01<0.01<0.01<0.01樟脑、辛辣味1、647.44香茅醇40--<0.01<0.010.03柠檬、柑橘香350.41香叶醇10---0.120.100.12橙花,玫瑰、天竺葵219.67β-蒎烯140--0.09---松节油、青草香115.31正己醛4.50.200.01-0.200.100.07青草味、苹果香1、323.05反-2-己烯醛170.06--0.070.050.03绿叶清香、水果香1、326.81正辛醛170<0.01<0.01<0.01<0.01<0.01<0.01脂肪味、果味3、431.94壬醛11.303.533.141.080.690.66柑橘香、花香、脂肪味2、3、433.65反-2-辛烯醛30.06-----脂肪味、水果香3、436.71癸醛100<0.010.010.02<0.01<0.01<0.01甜橙、橘子、油脂3、437.83苯甲醛350<0.01<0.01<0.01<0.01<0.01<0.01苦杏仁、植物味1、621.022-庚酮650<0.01<0.01<0.01<0.01<0.01<0.01水果香326.622-辛酮5<0.010.550.05---青草香、花香1、329.26甲基庚烯酮50<0.01<0.01<0.01<0.01<0.01<0.01水果香356.20苯酚5 900---<0.01<0.01<0.01药香、烟熏5、6
注:A:游离态;B:结合态;1:草本香,2:花香,3:果香,4:脂肪味,5:化学味,6:香料味;“-”代表未检测到该物质。
2.2.1 发酵过程中供试样品主要游离态香气物质分析
酒精发酵阶段共检测到醇类物质16种,其中2-庚醇、正戊醇、苯乙醇、1-辛烯-3-醇和1-壬醇5种为主要挥发性化合物,特别是2-庚醇,在PFM占醇类物质总含量的81.95%。由附图1-a～附图1-e(https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.036801,下同)可知,随着发酵的进行,大多数醇类物质含量呈上升趋势。其中,1-辛烯-3-醇和1-壬醇是红树莓果实中存在的香气组分,e-FA含量分别达到1.65 μg/L和10.11 μg/L,是PFM的0.93和22.98倍(P<0.05)。此外,还存在一些由酒精发酵产生的香气化合物,例如正戊醇,从m-FA含量逐渐增加,较PFM提高了80.35 μg/L,e-FA含量达到128.69 μg/L,是m-FA的1.60倍(P<0.05)。类似的现象在苯乙醇的含量变化中也有体现(e-FA是m-FA的1.96倍),这与赵驰等[18]对李子果酒的研究结果一致。除此之外,还存在少许与以上所述趋势不同的香气化合物,如2-庚醇,其含量在m-FA达到最高,为24.55 μg/L,后下降至21.39 μg/L。
图1 不同发酵阶段游离态和结合态香气物质热图
Fig.1 Heat maps of free and bound aroma compounds at different fermentation stages
注:A:游离态;B:结合态。
从样品中检测到10种主要酯类化合物,随着酒精发酵的进行含量都逐渐增加。其中己酸乙酯、乙酸己酯、辛酸乙酯等表现花果香的5种酯类物质自发酵起始含量就呈现逐渐增加的变化(附图1-f～附图1-j)。例如,辛酸乙酯在酒精发酵阶段含量显著增加(P<0.05),在e-FA是m-FA的1.84倍,并且是e-FA红树莓酒中含量最高的化合物,含量为836.63 μg/L,这对增加酒体的花果香有积极意义。其他4种酯类己酸乙酯、乙酸己酯、癸酸乙酯和丁酸乙酯,其含量分别为1.67～391.26 μg/L、0.95～21.90 μg/L、2.68～170.98 μg/L和1.48～2.23 μg/L。而乙酸异戊酯、辛酸甲酯、庚酸乙酯、癸酸甲酯和乙酸苯乙酯5种具有香蕉、柑橘、玫瑰花等特征的酯类物质仅在m-FA和e-FA被检测到,其含量也呈上升趋势,e-FA含量分别为375.72 μg/L、67.55 μg/L、11.40 μg/L、12.13 μg/L和17.38 μg/L,比m-FA分别提高了12.70%、59.82%、30.78%、45.26%和38.49%,差异均显著(P<0.05)。此外,与辛酸乙酯趋势不同的乙酸己酯在酒精发酵过程中的含量呈先升后降的单峰型变化,在m-FA达到最高,含量为43.70 μg/L。
从供试样品中检测到9种萜烯类物质,其中芳樟醇(玫瑰香、柑橘味)是主要的萜烯类化合物,在PFM阶段占萜烯类总含量的60.81%,在酒精发酵过程中含量逐渐增加,发酵末期为10.87 μg/L,是PFM的4.29倍(P<0.05)(附图1-p)。此外,其他萜烯类化合物虽然OAV<0.01,但其对红树莓酒的风味具有积极贡献。其中,橙花醇(玫瑰、柠檬)、α-松油醇(樟脑、辛辣味)和香茅醇(柑橘香)的趋势与芳樟醇一致,e-FA含量分别为0.22、0.90、0.36 μg/L。α-蒎烯仅在红树莓浆果中检测到,含量为0.03 μg/L,为红树莓浆果提供松香气味。而β-蒎烯仅在e-FA产生,含量为12.28 μg/L,赋予红树莓酒松节油、青草香的风味特征。
醛类物质在酒精发酵阶段共检测到8种,其中壬醛(蜡香、柑橘香、花香)、癸醛(甜橙、橘子、油脂)、正己醛(青草味、果香)和反-2-己烯醛(青香、果香)为主要挥发性化合物(附图1-q～附图1-t)。壬醛和癸醛含量在酒精发酵阶段逐渐增加,e-FA分别为3.14 μg/L和1.70 μg/L,而与壬醛和癸醛含量变化不同的正己醛(PFM含量为0.91 μg/L)和反-2-己烯醛(PFM含量为0.98 μg/L)呈下降趋势,在e-FA和m-FA均未被检测到,可能是因为醛类化合物极不稳定,在发酵过程中酯化形成酯类化合物[19]。
此外,本实验还检测出4种酮类物质,其中2-辛酮(青草香、花香)为主要的香气组分。由附图1-u可知,2-辛酮含量在酒精发酵阶段呈先升后降趋势,但整体变化不明显,含量分别为0.02、2.75、0.27 μg/L。
2.2.2 发酵过程中供试样品主要结合态香气物质分析
在结合态香气物质中,共检测到30种香气化合物,包括14种醇类、7种醛类、5种萜烯类、3种酮类和1种酚类化合物。酒精发酵过程中游离态和结合态存在较大差异。主要结合态香气化合物含量由高到低依次为2-庚醇、芳樟醇、2-乙基己醇、苯甲醇、反-2-己烯醛、香叶醇、壬醛、2-庚酮、正己醛、1-辛烯-3-醇。
由附图2-a可知,2-庚醇含量在酒精发酵过程中先升后降,e-FA含量为9.91 μg/L,比游离态降低了46.33%,这与芳樟醇和苯甲醇的变化趋势一致,e-FA游离态芳樟醇是结合态的3.02倍,苯甲醇的含量为1.78 μg/L,比PFM下降了14.01%,不过差异并不明显(P>0.05),其中苯甲醇和芳樟醇也在猕猴桃中被检测到[20]。而表现花香、脂肪气味的2-乙基己醇则呈先降后升的趋势,但e-FA含量(1.74 μg/L)低于发酵初期(2.19 μg/L),比PFM下降了20.55%(P<0.05),类似的趋势在香叶醇和2-庚酮中也有体现,不同的是香叶醇的含量在e-FA(1.22 μg/L)略高于PFM(1.15 μg/L),是PFM的1.06倍,而2-庚酮的含量在PFM和e-FA基本不变,PFM为1.06 μg/L,e-FA为1.05 μg/L。反-2-己烯醛和正己醛以及壬醛在酒精发酵阶段含量均持续下降,e-FA分别为0.46、0.31、0.66 μg/L,比PFM降低了61.98%、34.44%和38.89%,差异均显著(P<0.05)。1-辛烯-3-醇在PFM并未检测到,从m-FA开始含量逐渐增加,e-FA含量为0.40 μg/L,比m-FA提高了7.50%,这可能是生物转化的结果[21]。
a-香气轮廓;b-PCA
图2 不同发酵阶段游离态香气物质香气轮廓和PCA
Fig.2 Analysis of aroma profiles and principal component analysis of free aroma compounds at different fermentation stages
2.3 主要游离态和结合态香气物质可视化分析
为了更大程度地呈现酒精发酵阶段主要游离态和结合态香气物质含量变化情况,将不同阶段的同种香气物质的含量经数据归一化处理,得到不同阶段的供试样品的主要香气化合物含量比较热图。由图1可知,游离态香气成分聚为2大类3小类,3个阶段的供试样品均各自聚集,其中第1大类被分为2小类,分别是m-FA和e-FA,PFM聚集在第2大类。表明m-FA和e-FA游离态香气成分表现具有相似性,而与PFM游离态香气情况差异较大,这可能是由于微生物发酵醇类、酯类、醛酮类等香气成分增加引起的。结合态香气均属于一大类,说明酒精发酵过程中结合态成分表达模式具有相似性。以上结果表明,酒精发酵过程中主要游离态和结合态香气成分之间存在差异。
2.3.1 发酵过程中主要游离态化合物香气轮廓变化和主成分分析(principal components analysis, PCA)
为了进一步比较酒精发酵阶段红树莓酒主要挥发性化合物的呈香特征,对21种主要游离态挥发性化合物进行香气轮廓分析,由图2-a可知,酒精发酵期间供试样品的香气轮廓较为相似,主要表现为果香和花香特征。随着酒精发酵的进行,果香特征增加最明显,较PFM提高了95.58%,这主要与e-FA己酸乙酯、乙酸异戊酯、乙酸己酯等挥发性化合物含量的增加有关(表2)。其次是花香,其他香气特征变化不明显。
进一步主成分分析得出(KMO=0.648>0.6),PC1和PC2的方差贡献率分别为76.96%和16.13%,累积贡献率为93.09%,具有较高的代表性,适合降维分析标准。供试样品根据测定阶段的不同明显地被分布在图2-b中的3个区域,其中PFM样品位于图中的第二象限,其主要与表现青草香型的正己醛和反-2-已烯醛的高含量有关。m-FA位于图中的第四象限,与壬醛、2-辛酮、2-庚醇和乙酸己酯等表现柑橘、花香、青草香和果香的香气化合物密切相关。e-FA位于图中的第一象限,主要表现为大部分具有果香、花香的酯类化合物,并与癸酸乙酯、己酸乙酯、辛酸甲酯等表现果香的化合物以及表现花果香香气特征的辛酸乙酯、丁酸乙酯、庚酸乙酯、癸酸甲酯等化合物的高含量相关。以上结果表明,随着酒精发酵的进行,红树莓酒的香气特征由发酵初期C6化合物表现的青草香型逐渐转变为大部分由酯类物质呈现的果香、花香气味。
2.3.2 发酵过程中主要结合态化合物香气轮廓变化和主成分分析
尽管结合态香气化合物通常不具备直接呈香能力,本研究仍参照游离态挥发性成分的分析方法,对10种主要结合态挥发性化合物进行香气轮廓分析及PCA,以评估其潜在香气贡献。由图3-a可知,红树莓在酒精发酵阶段以花香和果香为主,脂肪味次之,发酵过程中各香气特征基本保持不变。PCA分析表明(KMO=0.650>0.6)(图3-b),PFM供试样品与2-乙基己醇、壬醛、C6醛(正己醛和反-2-己烯醛)的高含量有关,主要反映花香、果香、脂肪味、青草香特征。m-FA供试样品与2-庚醇、芳樟醇密切相关,主要表现为花香、果香特征。苯乙醇和1-辛烯-3-醇与e-FA酒样密切相关,主要反映花香、脂肪味和青草香特征。
a-香气轮廓;b-PCA
图3 不同发酵阶段红树莓酒结合态香气物质香气轮廓和PCA
Fig.3 Analysis of aroma profiles and principal component analysis of bound aroma compounds in red raspberry wine at different fermentation stages
3 讨论
香气是评价红树莓酒品质的关键指标,对红树莓酒的感官质量有重要影响。为了进一步了解红树莓发酵过程中的呈香变化,本试验研究了酒精发酵阶段游离态和结合态香气化合物的变化,结果表明,酒精发酵阶段游离态和结合态香气物质种类和含量存在差异。酒精发酵期间检测出游离态香气52种,总含量呈上升趋势,e-FA达到最高值。其中高级醇是酵母酒精发酵的副产物,主要通过降解代谢和合成代谢2种途径生成,其含量受发酵条件、红树莓物理化学成分等多种因素影响[22],常具有强烈的刺激性气味,适量的高级醇可以增强果酒的果香和花香特征,但浓度过高会降低果酒的品质[23]。本试验中,高级醇的总含量随着酒精发酵的进行逐渐增加,e-FA达到最大值,且在酒样中的总含量低于1 000 μg/L(平均总含量203.69 μg/L),因此对红树莓酒的香气有积极的贡献。酯类化合物一部分存在于树莓汁中,一部分可在酒精发酵过程中由酵母的生物合成或脂肪酶催化酸和醇而生成[24],因此,随着酒精发酵的进行,大部分酯类物质的总量逐渐递增,e-FA含量最高,其中辛酸乙酯是红树莓酒e-FA含量最高的化合物。醛酮类物质在酒精发酵过程中各有差异,例如C6化合物中的正己醛和反-2-己烯醛,随着酒精发酵的进行含量逐渐降低。树莓汁中C6化合物的合成依赖于4种酶,它们催化这些化合物的合成,其中脂氧合酶和过氧化氢裂解酶尤为重要,可通过催化不饱和亚油酸和亚麻酸反应生成C6醛[25]。萜烯类化合物在酒精发酵过程中总含量呈上升趋势,这类化合物可在水果中以游离态的形式存在,也可在酒精发酵过程中产生[26]。
结合态香气物质作为一种潜在香气来源,对红树莓酒的香气没有直接贡献,可在发酵过程中通过酸解或酶解转化为具有挥发性的游离态香气物质,从而起到增香的作用。本研究中检测到结合态香气物质30种,且游离态和结合态香气物质种类和含量相差较大,检测到游离态和结合态共有的主要化合物6种,除了正己醛和反-2-己烯醛之外,其他共有的游离态香气化合物含量均高于结合态香气化合物。其中游离态和结合态壬醛的含量在红树莓发酵过程中呈相反的变化趋势。随着酒精发酵的进行,游离态壬醛含量上升,而结合态含量下降,推测可能是β-葡萄糖苷酶活性上升引起的。萜烯类物质易与糖类物质结合形成结合态香气物质,本研究中,芳樟醇和香叶醇2种主要结合态化合物在酒精发酵过程呈现缓慢上升的趋势。结合态醇类和酮类含量整体呈下降趋势,但m-FA各物质含量存在差异,推测可能与发酵过程中基质的动态变化以及β-葡萄糖苷酶活性有关。总的来说,结合态香气物质在酒精发酵过程中整体变化不明显,这可能与酵母自身水解酶的种类和活性存在差异有关。除此之外,发酵基质也会影响酶的活性,研究发现,pH值为2.9～3.8有利于葡萄酒中结合态萜烯类物质发生酸水解,从而释放挥发性苷元[27]。而较低的pH值会使酵母中糖苷酶的稳定性丧失,导致酶的活性下降[28]。本试验中红树莓酒发酵过程中的pH值较低(2.73～2.83),推测也是影响结合态香气物质变化不明显的原因之一。
4 结论
本研究采用HS-SPME-GC-MS探究红树莓在酒精发酵过程中游离态和结合态化合物香气的变化,共检出61种香气组分,其中游离态香气52种,醇类16种、酯类15种、萜烯类9种、醛类8种、酮类4种,发酵前期以醇类为主,酯类物质的含量随发酵的进行增加最明显。结合态香气30种,醇类14种、醛类7种、萜烯类5种、酮类3种,酚类1种,发酵过程中以醇类物质为主。香气轮廓和PCA表明,游离态香气发酵前期以C6化合物为主,发酵末期以大部分酯类化合物为主,推测红树莓酒样品的香气特征可能由发酵初的青草香特点逐渐转变为发酵结束时的果香和花香特征。结合态香气化合物香气特征略有变化,以花果香特征为主,推测可通过进一步的工艺优化以促进结合态香气物质的酶解释放,进而提高红树莓酒的品质。
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