干酪又称为奶酪、起司、芝士或乳酪,富含蛋白质、脂肪、维生素和矿物质等营养物质,具有极高的营养价值,被誉为乳中黄金[1]。马苏里拉干酪是一种源自意大利的美食瑰宝,具有细腻的口感和加热后良好的拉伸性,常被用于制作披萨、沙拉、意面等美食,已成为全球生产应用中最为广泛的干酪[2]。因历史原因和饮食习惯差异,长期以来中国的干酪市场并未得到充分发展。进入21世纪,随着人民生活水平的提高和饮食结构的多元化,马苏里拉干酪的需求量骤增[3]。人们不仅追求高营养价值的干酪产品,而且越来越注重产品的风味品质,干酪的风味是消费者选择产品和决定其品质的重要指标,其风味特征在很大程度上是由挥发性风味物质决定的[4]。研究表明,原料乳差异会显著影响马苏里拉干酪的品质[5]。由于乳中脂肪、蛋白质、矿物质等营养成分的含量和种类不同,会导致制作出的干酪在感官、营养成分、功能特性、结构质地和风味品质等方面都有差异。中国是全球第三大水牛养殖国家,其中,云南水牛乳产量居全国第二。槟榔江水牛属于河流型水牛,是云南独有的一种高产水牛,其产奶量是本地其他水牛产量的2.2倍[6]。槟榔江水牛乳的平均乳脂率、乳蛋白率、乳糖率和总固形物含量均高于荷斯坦牛乳,其中乳蛋白和乳脂含量分别约为荷斯坦牛乳的1.2倍和2.1倍[7],表明槟榔江水牛乳是一款营养价值丰富且加工潜力巨大的牛乳。
本实验利用云南槟榔江水牛乳进行马苏里拉干酪的制作,以荷斯坦牛乳为对照,通过分析2种原料乳制作干酪的色差、质构、蛋白水解度、热稳定性、游离氨基酸和游离脂肪酸等功能特性,探究槟榔江水牛乳对马苏里拉干酪质构特性和主要风味物质的影响,为槟榔江水牛乳马苏里拉干酪产品的开发和风味品质的控制提供参考。
云南槟榔江水牛乳,腾冲市巴福乐槟榔江水牛良种繁育有限公司;荷斯坦牛乳,云南腾冲艾爱摩拉牛乳业有限责任公司;小牛皱胃酶,深圳市富晟生物科技有限公司;发酵剂,丹尼斯克(中国)有限公司。
食品级CaCl2,河南万邦实业有限公司;亚甲基蓝,天津市光复精细化工研究所;三氯乙酸(trichloroacetic acid,TCA),上海宏瑞化工有限公司;浓硫酸,上海裕纳化工有限公司;NaCl、甲基红、磷酸、冰乙酸、硼酸,天津市凤船化学试剂科技有限公司;盐酸,川东化工有限公司;无水乙醚、石油醚,广东省精细化学品工程技术研究开发中心。
HH-M6六孔水浴锅、DHG201-0电热鼓风干燥箱,江苏新春兰科学仪器有限公司;PHSJ-4F型pH计,上海锦锚工业科技有限公司;CR-400/410色差仪,柯尼卡美能达株式会社;GJB1000-60均质机,常州市均质机械有限公司;LC-162C海尔冰箱,青岛海尔集团;HYP-308消化炉,上海纤检仪器有限公司;SX-4-10马弗炉,沈阳市节能电炉厂;AX223ZH/E电子天平,奥豪斯仪器(常州)有限公司;TA.XT Plus质构仪,英国Stable Micro System公司;1260 Infinity Ⅱ 高效液相色谱仪(配有G7129A自动进样器和G7121A荧光检测器)、7890A-5975C气相色谱质谱仪,美国安捷伦科技有限公司;L580R高速冷冻离心机,上海卢湘仪离心机仪器有限公司;SK3200HP 超声波清洗仪,上海科导超声仪器有限公司。
1.3.1 马苏里拉干酪的制备
参照ZHANG等[8]的方法,并稍作修改。
新鲜槟榔江水牛乳→巴氏杀菌(63 ℃,30 min)→冷却(38±2 ℃)→发酵剂(3 mg/mL)→搅拌溶解→pH值降至5.7→CaCl2溶液(质量分数为0.01%)→搅拌均匀→NaCl溶液溶解的凝乳酶(质量分数为0.2%)→搅拌均匀→凝乳(40 ℃水浴)→pH值降至5.3→切割、排乳清(50 ℃)→热烫拉伸(80 ℃)→拉伸堆叠→模型压制成型→真空包装→储藏(4 ℃)荷斯坦牛乳干酪制作方法除原料为新鲜荷斯坦牛乳外,其余制备步骤同上。
1.3.2 干酪的色差测定
参考杨果果等[9]的方法,采用便携式色差仪对每个干酪样品的色差值进行测定,每个干酪样本随机选择3个位置进行测定,取平均值。综合L*(亮度)、a*(红度)、b*(黄度),计算总色差ΔE,总色差按公式(1)计算:
(1)
1.3.3 干酪的质构测定
参考WANG等[10]的方法,每个样品设置3个平行并分别进行测定。TA-XT2质构仪测定参数设置如下:将样品切成2 cm×2 cm×2 cm的小块;探头规格:R36形探头,直径38 mm;测试压缩比75%;探头下行速度2 cm/s;探头返回速度2 cm/s,2次间隔时间5 s,触发力4.0 g。
1.3.4 干酪的水解度测定
1.3.4.1 pH 4.6可溶性氮(pH 4.6 soluble nitrogen,pH 4.6-SN)含量的测定
参考李彤[11]的方法,将干酪研磨成细小颗粒,称取1.50 g置于离心管中,加入pH 4.6醋酸盐缓冲液25 mL,制备为匀浆,使用25 mL醋酸盐缓冲液冲洗,最后4 000 r/min离心20 min。取20 mL上清液置于消化管中,经过消化处理后,采用凯氏定氮法进行测定,其结果以该氮含量占干酪总氮量的百分比来表示。
1.3.4.2 质量分数为12%的三氯乙酸(trichloroacetic acid,TCA)可溶性氮含量的测定
参考邱婷等[12]的方法,将干酪研磨成细小颗粒,称取1.50 g置于离心管中,加入质量分数为12%TCA溶液(25 mL),充分搅拌制备为匀浆,再用20 mL质量分数为12% TCA溶液冲洗,4 000 r/min离心20 min。取20 mL上清液置于消化管中,经消化处理后,采用凯氏定氮法进行测定,其结果以该氮含量占干酪总氮量的百分比来表示。
1.3.5 干酪的热力学特性分析
采用差式扫描量热法(differential scanning calorimetry, DSC),取5 mg样品于铝制坩埚中,进行密封,同时放置空坩埚作为空白对照。样品在30 ℃放置5 min,以5 ℃/min的速度升高温度到150 ℃。N2作为保护气体,计算奶酪凝块的相变起始温度(T0)、峰值温度(Tp)和焓变(ΔH)[13]。
1.3.6 干酪游离氨基酸测定
以GB 5009.124—2016《食品安全国家标准 食品中氨基酸的测定》为标准,对样品进行预处理。称取干酪样品5 g加100 mL水均质5 min,水浴10 min,冷却至室温,3 000 r/min离心10 min,静置分层,吸出上清液,用0.45 μm滤膜过滤后,取0.5 mL,加入50 μL内标,滤液加入进样瓶,等待上机。采用高效液相色谱进行测定。色谱条件:色谱柱为岛津氨基酸分析柱;柱温50 ℃;波长338 nm,262 nm;衍生液OPA衍生试剂,稀释剂0.5%磷酸,50%乙腈,均为体积分数。
1.3.7 干酪游离脂肪酸测定
参照钟玉旺[14]的方法,称取干酪样品0.3 g进行甲酯化(加入3 mL正己烷、3 mL 0.8 mol/L的NaOH-甲醇溶液、20 μL内标物),在超声波水浴中充分振荡1 h后静置30 min,3 000 r/min离心10 min,静置分层,吸出上清液,用滤膜过滤后,采用GC-MS仪进行测定,用面积归一法进行定性定量。色谱条件:细柱HP5:99.999%N2;流速N2 30 mL/min,H2 30 mL/min,Air 300 mL/min;进样口温度240 ℃;检测器温度250 ℃。
如表1所示,2种干酪中的ΔE和a*值无显著差异(P>0.05),但L*值和b*值差异显著(P<0.05)。L*值与干酪样品的色泽明亮程度呈正相关[15]。槟榔江水牛乳干酪的L*值要显著高于荷斯坦牛乳干酪(P<0.05),这表明槟榔江水牛乳干酪相比较于荷斯坦牛乳干酪色泽更加明亮有光泽。b*值与牛乳中的胡萝卜素保留有关,b*值越高,表明干酪中的胡萝卜素保留越多[15]。本试验中槟榔江水牛乳干酪的b*值更高,说明其保留的胡萝卜素更多,营养更丰富。
表1 干酪的色差对比
Table 1 Color indexes of cheese
注:不同小写字母间表示实验组间存在显著性差异(P<0.05)(下同)。
指标槟榔江水牛乳干酪荷斯坦牛乳干酪L∗值88.10±0.30a80.51±0.20ba∗值-1.97±0.01a-0.17±0.02ab∗值13.93±0.02a20.32±0.10bΔE14.15±0.02a14.18±0.04a
干酪的质地不仅直接影响干酪的口感,还会影响干酪的风味,且不同品种的干酪所表现的质地特性有所不同。结果如表2所示,槟榔江水牛乳干酪和荷斯坦牛乳干酪在硬度、胶黏性、咀嚼性上具有显著差异(P<0.05)。槟榔江水牛乳干酪的硬度较强,便于包装储存和运输,且胶黏性和咀嚼性优于荷斯坦牛乳干酪,给予消费者良好的咀嚼口感。2种干酪在弹性、凝聚性、黏附性、回复性上差异不显著(P>0.05),但从数值上看,槟榔江水牛乳干酪的弹性更高,凝聚性和回复性更好,黏附性更低。FANG等[16]研究发现,干酪的消化性和黏附性呈负相关,即槟榔江水牛乳干酪更容易被人体消化吸收。
表2 干酪的质构测定结果
Table 2 Results of texture determination of cheese
组别硬度/g弹性/cm凝聚性胶黏性黏附性咀嚼性回复性/cm槟榔江水牛乳干酪1 270.20±20.00a0.86±0.01a0.82±0.00a1 048.48±20.00a-2.05±0.10a903.35±10.00a0.47±0.00a荷斯坦牛乳干酪542.34±20.00b0.81±0.01a0.76±0.00a414.39±10.00b-2.28±0.10a337.09±13.00b0.37±0.00a
蛋白水解对干酪的质地风味等都具有重要影响,干酪的蛋白水解度一般用pH 4.6-SN和质量分数为12%的TCA-SN来表示[17]。其中pH 4.6-SN一般用来表示蛋白水解的广度,主要是由于凝乳酶的作用而产生。质量分数为12%的TCA-SN一般用来表示蛋白水解的深度,由凝乳酶和发酵菌种产生的肽酶共同作用而产生。如图1所示,槟榔江水牛乳干酪在pH 4.6-SN、质量分数为12%的TCA-SN两个方面的水解度均显著高于荷斯坦牛乳干酪(P<0.05)。槟榔江水牛乳干酪含有较多的短链肽,短链肽经过进一步的水解可最终分解生成多种氨基酸和挥发性物质,它们是干酪风味物质的重要来源之一[18],这也是二者感官差异的潜在原因之一。
图1 干酪的蛋白水解度
Fig.1 Degree of protein hydrolysis of cheese
注:不同小写字母间表示实验组间存在显著性差异(P<0.05)。
a-槟榔江水牛乳干酪;b-荷斯坦牛乳干酪
图2 干酪游离氨基酸测定谱图
Fig.2 Determination of free amino acid spectrum in cheese
如表3所示,2种干酪的起始温度T0相同,熔融温度TP为蛋白质的热变性温度,焓变值ΔH为放热量,可通过蛋白质热变性、焓变值来判断干酪的热稳定性[19]。槟榔江水牛乳干酪的熔融温度TP和焓变值ΔH均大于荷斯坦牛乳干酪,表明槟榔江水牛乳干酪的蛋白稳定性高于荷斯坦牛乳干酪,其原因是槟榔江水牛乳和荷斯坦牛乳中的酪蛋白和蛋白含量均有差异,分别将其制成干酪后,干酪的酪蛋白结构及聚集程度均有差异,因此导致了干酪熔融温度不同。
表3 干酪的DSC分析数据
Table 3 DSC analytical data of cheese
组别T0/℃TP/℃ΔH/(J/g)槟榔江水牛乳干酪50.30109.30159.30荷斯坦牛乳干酪50.30101.50140.50
干酪中的游离氨基酸是在蛋白质水解过程中产生的,是干酪特征风味物质的来源之一,是影响干酪风味的重要因素,尤其在干酪后熟阶段,游离氨基酸是主要的呈味物质[20]。图1为游离氨基酸色谱图。氨基酸含量及种类如表4所示,2种干酪中共检测出11种游离氨基酸,其中包括2种半必需氨基酸(胱氨酸和酪氨酸)、5种必需氨基酸(缬氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、亮氨酸)和1种婴儿必需氨基酸(组氨酸)。槟榔江水牛乳干酪中的甲硫氨酸和胱氨酸含量均高于荷斯坦牛乳干酪。其中,甲硫氨酸是人体必需氨基酸,对机体内蛋白质合成、脂质代谢、生物活性化合物前体及氧化还原反应等过程起到重要的调控作用。胱氨酸是一种对食品风味有影响的氨基酸[21],其加热分解后产生的物质可能为干酪的风味带来积极影响。天冬氨酸、酪氨酸和甲硫氨酸的含量在2种干酪中都比较高,天冬氨酸参与鸟氨酸循环,降低血液中氮和CO2的量,增强肝功能,消除疲劳[22];酪氨酸是一种重要的营养必需氨基酸,在维持生物机体正常的新陈代谢、生长、发育过程中发挥着十分关键作用。
表4 干酪中游离氨基酸含量 单位:mg/100 g
Table 4 Content of free amino acid in cheese
注:*表示半必需氨基酸;**表示必需氨基酸;***表示婴儿必须氨基酸。
氨基酸种类槟榔江水牛乳干酪荷斯坦牛乳干酪天冬氨酸(Asp)16.600±0.000a18.900±0.000a谷氨酸(Glu)2.640±0.010a2.845±0.015a组氨酸(His)∗∗∗1.005±0.015a1.160±0.000a丙氨酸(Ala)2.160±0.030b4.435±0.005a酪氨酸(Tyr)∗8.710±0.000b14.100±0.100a胱氨酸(Cys)∗1.925±0.015a1.880±0.030a缬氨酸(Val)∗∗1.275±0.005b3.850±0.030a甲硫氨酸(Met)∗∗53.650±0.150a37.750±0.050b苯丙氨酸(Phe)∗∗1.930±0.050b17.900±0.200a赖氨酸(Lys)∗∗0.614±0.034b2.565±0.065a亮氨酸(Leu)∗∗0.887±0.027b16.150±0.050a总游离氨基酸91.00±0.000b121.5±0.500a
2.5.1 干酪中游离氨基酸的主成分分析(principal component analysis,PCA)和偏最小二乘判别分析(partial least squares discriminant analysis,PLS-DA)
如图3-a所示,第一主成分的贡献率为99.9%,第二主成分的贡献率为0.1%,累计贡献率为100%,反映出2种原料乳干酪游离氨基酸的大部分信息,且槟榔江水牛乳干酪分布在横坐标的正半轴,荷斯坦牛乳干酪分布在横坐标的负半轴,2组之间差异显著,说明2种原料乳制作干酪中游离氨基酸的组成与含量之间差异较大。由图3-b可知,胱氨酸和甲硫氨酸对槟榔江水牛乳干酪的影响较大,苯丙氨酸、赖氨酸和亮氨酸对荷斯坦牛乳干酪有较大影响。通过PLS-DA筛选VIP得分>1的物质,从图3-c可以看出,造成2种干酪游离氨基酸组成与含量差异的主要物质为苯丙氨酸、甲硫氨酸和亮氨酸,表明这3种游离氨基酸对干酪特征风味的形成有重要影响。
a-PCA图;b-载荷图;c-VIP图
图3 干酪游离氨基酸PCA和PLS-DA结果
Fig.3 PCA and PLS-DA results of free amino acids in cheese
注:SNR表示槟榔江水牛乳干酪;HST表示荷斯坦牛乳干酪(下图同)。
2.5.2 干酪中游离氨基酸的热图分析
如图4所示,槟榔江水牛乳干酪聚为一类,荷斯坦牛乳干酪聚为一类,说明2种原料乳制作干酪的游离氨基酸组成与含量具有明显的特征性和差异性。由图4可知,荷斯坦牛乳干酪的游离氨基酸含量高于槟榔江水牛乳干酪,但槟榔江水牛乳干酪中的甲硫氨酸和胱氨酸含量更高。其中,甲硫氨酸作为人体必需氨基酸,适量摄入有助于维持身体健康;胱氨酸具有促进细胞氧化还原、中和毒素等生理活性[23]。热图分析结果与PCA结果一致。
图4 干酪游离氨基酸热图
Fig.4 Heatmap of free amino acids in cheese
游离脂肪酸色谱图见图5,脂肪酸含量及种类结果如表5所示,2种干酪共检测出31种游离脂肪酸,槟榔江水牛乳干酪共检出30种,比荷斯坦牛乳干酪多检测出3种(反油酸、反亚油酸、二十三酸),荷斯坦牛乳干酪共检出27种,其中芥酸是其特有的,且槟榔江水牛乳干酪的总游离脂肪酸含量显著高于荷斯坦牛乳干酪(P<0.05)。研究表明,不饱和脂肪酸是人体不可缺少的一种脂肪酸,它能保证细胞的正常生理功能,降低血液中胆固醇,改善血液循环等[24]。2种原料乳制作的干酪共检出14种不饱和脂肪酸,且槟榔江水牛乳干酪组的含量显著高于荷斯坦牛乳干酪(P<0.05)。饱和脂肪酸可以为人体提供能量,帮助吸收脂溶性维生素,其中,C12∶0、C14∶0、C16∶0、C18∶0等饱和脂肪酸的含量较高一些,干酪的风味会更加圆润[25]。槟榔江水牛乳干酪的饱和脂肪酸含量显著高于荷斯坦牛乳干酪(P<0.05),且其中的月桂酸、豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸和花生酸含量均比荷斯坦牛乳干酪高,说明槟榔江水牛乳干酪的风味更加圆润。
a-槟榔江水牛乳干酪组;b-荷斯坦牛乳干酪组
图5 干酪游离脂肪酸测定谱图
Fig.5 Determination of free fatty acid spectrum in cheese
表5 干酪中游离脂肪酸含量 单位:mg/100 g
Table 5 Content of free fatty acids in cheese
名称槟榔江水牛乳干酪荷斯坦牛乳干酪丁酸(C4∶0)∗9.462±0.000a11.224±0.094a己酸(C6∶0)∗8.822±0.010a10.662±0.109a辛酸(C8∶0)∗7.794±0.010a7.251±0.039a葵酸(C10∶0)∗22.081±0.031a18.295±0.062a十一烷酸(C11∶0)∗0.409±0.052未检出月桂酸(C12∶0)∗36.044±0.021a25.241±0.016a十三烷酸(C13∶0)∗2.203±0.000a0.882±0.008a豆蔻酸(C14∶0)∗218.979±0.178a112.564±0.031b肉豆蔻烯酸(C14∶1)∗∗9.682±0.010a8.515±0.008a十五烷酸(C15∶0)∗30.578±0.094a12.254±0.031a棕榈酸(C16∶0)∗742.776±0.441a462.696±0.593b棕榈油酸(C16∶1)∗∗42.852±0.031a27.661±0.047a十七烷酸(C17∶0)∗17.267±0.042a9.553±0.000a硬脂酸(C18∶0)∗339.897±0.126a268.086±0.156b反油酸(C18∶1n9t)∗∗9.903±0.147未检出油酸(C18∶1)∗∗548.742±0.577a508.558±0.265b
续表5
注:*表示饱和脂肪酸;**表示不饱和脂肪酸。
名称槟榔江水牛乳干酪荷斯坦牛乳干酪反亚油酸(C18∶2TT)∗∗0.336±0.021未检出亚油酸(C18∶2)∗∗25.763±0.021b58.725±0.297a花生酸(C20∶0)∗6.000±0.042a3.739±0.055aγ-亚麻酸(C18∶3,n-6)∗∗0.378±0.000a0.663±0.055a二十碳烯酸(C20∶1)∗∗1.080±0.010a2.107±0.062a亚麻酸(C18∶3)∗∗4.416±0.010a4.394±0.008a二十一碳酸(C21∶0)∗1.563±0.010a0.570±0.086a顺-11,14-二十碳二烯酸(C20∶2)∗∗0.346±0.010a0.351±0.101a山嵛酸(C22∶0)∗2.518±0.021a1.413±0.008a顺-8,11,14-二十碳三烯酸(C20∶3)∗∗1.227±0.010a1.397±0.055a芥酸(C22∶1)∗∗未检出0.429±0.055二十碳四烯酸(C20∶4)∗∗2.171±0.010a2.279±0.016a二十三酸(C23∶0)∗1.636±0.000未检出二十四烷酸(C24∶0)∗2.685±0.021a0.991±0.039a神经酸(C24∶1)∗∗0.399±0.000a0.515±0.016a不饱和脂肪酸647.296±0.692a615.594±0.421b饱和脂肪酸1 450.715±0.703a945.420±0.421b总游离脂肪酸2 098.010±0.010a1 561.016±0.000b
2.6.1 干酪中游离脂肪酸的PCA和PLS-DA结果
从图6-a可知,第一主成分的贡献率为100%,槟榔江水牛乳干酪分布在横坐标的正半轴,且组内差异较小;荷斯坦牛乳干酪均匀分布在横轴的负半轴,组内差异较为明显。2组干酪在横轴上相距较远,表明2种干酪所含的游离脂肪酸组成和含量存在较大差异。从图6-b可知,豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、油酸和亚麻酸对槟榔江水牛乳干酪的影响较大,而亚油酸和顺-11,14-二十碳二烯酸对荷斯坦牛乳干酪有较大影响。通过PLS-DA筛选出VIP得分>1的物质,由图6-c可知,棕榈酸、豆蔻酸、硬脂酸、油酸和亚油酸是造成2种原料乳制作干酪的游离脂肪酸组成与含量差异的主要物质,表明这5种游离脂肪酸对干酪特征风味的形成有重要影响。
a-PCA图;b-载荷图;c-VIP图
图6 干酪游离脂肪酸PCA和PLS-DA结果
Fig.6 PCA and PLS-DA results of free fatty acids in cheese
2.6.2 干酪中游离脂肪酸的热图分析
由图7可知,2种原料乳制作干酪的游离脂肪酸组成与含量之间有明显的特征性和差异性。槟榔江水牛乳干酪中的硬脂酸、棕榈酸、豆蔻酸、月桂酸、二十三酸、棕榈油酸、十三烷酸、十七烷酸、十五烷酸、山嵛酸、二十四烷酸、葵酸、油酸、肉豆蔻烯酸、反油酸、花生酸、二十一碳酸、辛酸、反亚油酸、十一烷酸、亚麻酸的相对丰度较高;而荷斯坦牛乳干酪中的神经酸、芥酸、二十碳四烯酸、γ-亚麻酸、二十碳烯酸、丁酸、己酸、亚油酸的的丰度较高。热图分析结果与PCA结果一致。
图7 干酪中的游离脂肪酸热图
Fig.7 Heatmap of free fatty acids in cheese
注:图中数字与表5序号所代表的物质相对应。
研究通过对比槟榔江水牛乳和荷斯坦牛乳制作的马苏里拉干酪在色差、质构、蛋白水解度、热稳定性、游离氨基酸和游离脂肪酸等方面的差异,发现槟榔江水牛乳马苏里拉干酪的硬度、胶黏性、咀嚼性、回复性均优于荷斯坦牛乳所制作的干酪,且热稳定性更好,蛋白水解度更高。从槟榔江水牛乳马苏里拉干酪中共检测出11种游离氨基酸和30种游离脂肪酸,通过PCA和PLS-DA得知,3种氨基酸(苯丙氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸)和5种脂肪酸(棕榈酸、豆蔻酸、硬脂酸、油酸、亚油酸)对2种原料乳制作干酪的特征风味形成具有重要影响。研究为云南槟榔江水牛乳马苏里拉干酪的加工应用提供参考。
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