泡菜是中国、韩国和其他一些东亚国家的传统发酵食品,是由盐渍发酵蔬菜制成,含有多种营养物质和功能性物质,具有潜在的健康益处[1]。目前,泡菜的加工方法主要分为自然发酵和接种发酵两种,传统的自然发酵易受盐浓度、pH值和野生杂菌等因素影响,导致产品存在发酵周期长、发酵条件难控制、泡菜品质不稳定、亚硝酸盐和食盐含量高、安全性较差等缺点[2-3]。因此,泡菜中乳酸菌的分离鉴定和直投式发酵剂的制备目前被广泛研究[4]。泡菜所采用的原料、发酵方式、发酵环境等会使泡菜产生不同的风味。乳酸菌是泡菜发酵的主要菌群,影响泡菜的质量和感官特性[5]。乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、链球菌属(Streptococcus)、魏斯氏菌属(Weissella)和明串珠菌属(Leuconostoc)等均在泡菜的发酵中起着重要作用[6-7]。KIM等[8]发现与自然发酵的泡菜相比,采用乳酸乳球菌和柠檬明串珠菌混合发酵剂制作的白菜泡菜具有更长的保质期和更好的感官特性,且甘露醇和氨基酸含量显著增加。陆利霞等[9]使用植物乳植杆菌B2接种萝卜泡菜,发现其发酵周期、发酵酸度等各指标均优于自然发酵泡菜,同时增加了萝卜泡菜的挥发性风味物质种类和含量,使其发酵风味和香味增加,脆度改善。
马铃薯又称土豆,是茄科属植物,在世界范围内广泛种植,是作为主食食用的重要农作物之一[10]。作为一种粮食兼蔬菜作物,其富含碳水化合物,还含有一定量的膳食纤维、维生素(如维生素C和维生素B6)、矿物质和抗氧化物质[11]。近年来,随着对健康饮食关注的增加,马铃薯的研究逐渐向营养价值、功能性食品和新产品开发等方向拓展,马铃薯泡菜、马铃薯发酵食品等创新产品也逐渐受到关注[12]。
目前的泡菜市场多以大白菜、卷心菜、菠菜、萝卜、胡萝卜和黄瓜等蔬菜作为原料,马铃薯泡菜作为发酵蔬菜中的一种新颖产品,研究较为少见[13-14]。因此,本研究以马铃薯为主要原料,比较不同种类乳酸菌的生长特性、耐受能力以及降解亚硝酸盐的能力,旨在优化马铃薯泡菜的发酵工艺,为马铃薯泡菜产业的规模化发展提供参考依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
马铃薯、白砂糖、食盐购自哈尔滨市哈达友谊农贸市场;嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus HSP001,菌体浓度均为1.0×108～1.3×108 CFU/mL,下同)、唾液链球菌嗜热亚种(Streptococcus salivarius subsp. thermophilus)、植物乳植杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)、肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)、戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus),由哈尔滨商业大学食品工程学院分离保藏;MRS肉汤培养基,北京奥博星生物技术有限责任公司;亚铁氰化钾、乙酸锌、硼砂、对氨基苯磺酸、氨水、盐酸、盐酸萘乙二胺,哈尔滨福瑞泰生物用品有限公司。
1.2 仪器与设备
DHP-9162B电热恒温培养箱、DHG-9140A电热鼓风干燥箱,上海一恒科学仪器有限公司;LDZX-50FBS立式压力蒸汽灭菌器,上海申安医疗器械厂;DL-CJ-1ND无菌超净工作台,北京东联哈尔仪器制造有限公司;PHS-3C型pH计,北京赛多利斯科学仪器有限公司;BS224S分析天平,上海精密仪器有限公司;722E紫外分光光度计,光研科技南京有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 马铃薯泡菜的制作流程
1.3.1.1 乳酸菌接种发酵
工艺流程:
马铃薯清洗→去皮→切块→熟化→接种→添加辅料→发酵→包装→灭菌→储存
工艺要点:
1)马铃薯预处理:将新鲜马铃薯洗净、去皮,切为长50 mm、宽10 mm、高10 mm的马铃薯块。
2)熟化:将马铃薯块放入100 ℃开水浸泡10 s,同时去除表面淀粉。
3)接种:向无菌发酵罐中添加无氯水(过滤水或煮沸后放凉的水),使水与马铃薯的比例为2∶1(mL∶g),接入乳酸菌(以水的体积计)。
4)添加辅料:向发酵液中加入4%生姜、3%白砂糖、3%香辛料和盐(以马铃薯的质量计)。
5)发酵:使用真空泵将发酵罐内空气排净,密封,将其置于25 ℃发酵箱中发酵数天。
6)包装及灭菌:将成品置于无菌的密封食品玻璃罐内,将玻璃罐放入锅中,确保水位淹没过瓶口后进行水浴,开水滚煮2 min,使足够的热量能够传递到瓶内,达到灭菌效果。
7)包装:灭菌后立即将瓶子从热水中取出,放置至室温后冷藏保存。
1.3.1.2 自然发酵
按1.3.1.1节中的步骤去除3)接种。
1.3.2 马铃薯发酵泡菜优质乳酸菌筛选
1.3.2.1 乳酸菌生长曲线的测定
在MRS液体培养基中以4%(体积分数,下同)接种量分别接种5种乳酸菌,37 ℃下静置培养48 h,每隔4 h取样,测定吸光度,将所测得OD600nm值绘制成曲线。
1.3.2.2 乳酸菌产酸能力的测定
在MRS液体培养基中以4%接种量分别接种5种乳酸菌,37 ℃下静置培养48 h,每隔4 h取样,测其pH值,将所测得pH值绘制成曲线。
1.3.2.3 乳酸菌耐酸能力的测定
分别用1 mol/L的HCl和1 mol/L的NaOH调节MRS液体培养基,使其pH值达到3.0、3.5、4.0、4.5、5.0。在上述液体培养基中以4%接种量分别接种5种乳酸菌,37 ℃下静置培养48 h,测定吸光度,将所测得OD600nm值绘制成曲线。
1.3.2.4 乳酸菌耐盐能力的测定
用NaCl调节MRS液体培养基,使其盐质量分数达到2%、4%、6%、8%、10%。在上述液体培养基中以4%接种量分别接种5种乳酸菌,37 ℃下静置培养48 h,测定吸光度,将所测得OD600nm值绘制成曲线。
1.3.2.5 乳酸菌降解亚硝酸盐能力的测定
用NaNO2调节MRS液体培养基,使其NaNO2质量浓度值达到125 mg/L。在上述液体培养基中以4%接种量分别接种5种乳酸菌,37 ℃下静置培养48 h,每隔12 h取样,计算乳酸菌的亚硝酸盐降解率。亚硝酸盐降解率计算如公式(1)所示:
亚硝酸盐降解率
(1)
式中:ρ0,初始亚硝酸盐含量,μg/mL;ρ1,培养液中亚硝酸盐含量,μg/mL。
1.3.3 pH的测定
利用pH计测定。
1.3.4 亚硝酸盐含量的测定
利用GB 5009.33—2016《食品安全国家标准 食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定》中的盐酸萘乙二胺法测定。
1.3.5 感官特性的测定
评价分数是根据10位评价者的平均值来计算的,参考汪立平等[2]的方法。评价按照样品感官质量的方法和标准进行(表1),包括外观、气味、滋味、脆度和整体接受度5个部分。
表1 马铃薯泡菜的感官评分标准
Table 1 Sensory evaluation criteria for potato kimchi
评价指标各指标分值评分标准/分外观20形状均一、色泽均匀、呈淡黄色(17～20)大体形状均一、略有碎块、色泽一般(13～16)碎块较多、色泽不均(1～12)气味20具有浓郁的发酵香气、无异味(17～20)存在发酵香气、无腐烂味(13～16)无发酵香气、有异味(1～12)滋味20酸度和咸度适中、酸味纯正、口感好(17～20)酸度和咸度一般,口感一般(13～16)酸度和咸度过高或过低(1～12)脆度20爽脆可口(17～20)组织较软、脆度一般(13～16)组织过软、无脆性(1～12)整体接受度20整体感觉理想,易接受(17～20)整体感觉一般,可以接受(13～16)整体感觉较差,不接受(1～12)
1.3.6 优质乳酸菌发酵马铃薯泡菜的条件优化
1.3.6.1 接种量对马铃薯泡菜品质的影响
设定盐质量分数4%(以马铃薯的质量计),发酵时间8 d。改变接种量为1%、2%、3%、4%、5%(以水的体积计),测定发酵后马铃薯泡菜的感官评分。
1.3.6.2 盐浓度对马铃薯泡菜品质的影响
设定嗜酸乳杆菌的接种量为4%,发酵时间8 d。改变盐质量分数为1%、2%、3%、4%、5%,测定发酵后马铃薯泡菜的感官评分。
1.3.6.3 发酵时间对马铃薯泡菜品质的影响
设定嗜酸乳杆菌的接种量为4%,盐质量分数4%。改变发酵时间为6、7、8、9、10 d,测定发酵后马铃薯泡菜的感官评分。
1.3.6.4 马铃薯泡菜的制备工艺优化
试验以接种量(A)、盐浓度(B)和发酵时间(C)作为自变量,马铃薯泡菜的感官评分作为评价指标,按表2所示的因素水平表设计L9(33)正交试验。
表2 L9(33)正交试验方案设计
Table 2 L9(33)Orthogonal experiment scheme design
水平/因素接种量/%盐质量分数/%发酵时间/d1218232934310
2 结果与分析
2.1 马铃薯发酵泡菜优质乳酸菌筛选评价
2.1.1 乳酸菌的生长曲线
菌株的生长情况是评估乳酸菌发酵周期和活力的重要指标。在发酵初期,由于营养物质充足,乳酸菌能够快速利用碳水化合物繁殖,导致细胞浓度显著提升。而随着发酵的进行,不同菌株在发酵过程中表现出不同的生长特性[15]。如图1所示,5种乳酸菌在发酵4～16 h时间段内处于对数生长期,而在22～28 h,各菌株生长进入稳定期,乳酸菌生长趋势与张艳芳等[16]相似。其中,植物乳植杆菌、唾液链球菌嗜热亚种和嗜酸乳杆菌的生长情况最好,最大OD值分别为2.439、2.328和2.180,优于肠膜明串珠菌和戊糖片球菌。
图1 乳酸菌的生长曲线
Fig.1 Growth curve of lactic acid bacteria
2.1.2 乳酸菌的产酸曲线
如图2所示,植物乳植杆菌、嗜酸乳杆菌和唾液链球菌嗜热亚种均表现出较强的产酸能力,体系中pH最低值分别为2.98、3.07和3.09。肠膜明串珠菌在五者中具有最弱的产酸能力,在发酵40 h达到最低pH值3.22。刘辉等[17]研究发现植物乳植杆菌具有很强的产酸能力和亚硝酸盐降解能力,原因是植物乳植杆菌具有较强的耐酸性,可以在酸性环境中存活和繁殖,代谢途径较为高效,能够迅速将糖类转化为乳酸。同时这也与其基因组、酶活性和代谢调控机制有关[18]。
图2 乳酸菌的产酸曲线
Fig.2 Acid production curve of lactic acid bacteria
2.1.3 乳酸菌的耐酸曲线
如图3所示,在pH值为3.0～4.0的酸性环境中,嗜酸乳杆菌、戊糖片球菌和植物乳植杆菌表现出更强的耐酸能力,在pH 3.0时,嗜酸乳杆菌的OD值最大,为1.457。以上3种乳酸菌具有较强耐酸能力的原因离不开其特殊的细胞膜组成,细胞膜的流动性和膜蛋白的特性决定了它们在酸性条件下较强的生存能力。并且它们能够通过主动排酸、合成酸性缓冲物质或调节胞内酶活性等方式,有效维持细胞内的pH平衡,从而使它们在严格的条件下保持活性并产生乳酸[19]。
图3 乳酸菌的耐酸曲线
Fig.3 Acid tolerance curve of lactic acid bacteria
2.1.4 乳酸菌的耐盐曲线
大多数乳酸菌在低盐浓度下生长良好(质量分数0%～3%),不同种类的乳酸菌对盐的耐受能力存在差异,如植物乳植杆菌和戊糖片球菌在高盐条件下的耐受性较强,而某些乳酸菌种在高盐环境中生长会受到抑制[20]。如图4所示,在盐质量分数为1%～3%时,5种乳酸菌都表现出较好的生长情况。然而,在盐质量分数达到4%～5%时,唾液链球菌嗜热亚种和嗜酸乳杆菌的生长能力明显减弱。从菌体的生长趋势来看,植物乳植杆菌和戊糖片球菌能够在较高的盐浓度下生长,原因是其可通过多种机制适应盐胁迫,包括产生保护性物质,以维持细胞内外的渗透平衡[21]。
图4 乳酸菌的耐盐曲线
Fig.4 Salt tolerance curve of lactic acid bacteria
2.1.5 乳酸菌降解亚硝酸盐的能力
乳酸菌能够通过发酵过程将亚硝酸盐转化为无害的氮气或其他简单化合物,从而减少体系中的亚硝酸盐含量,提高食品安全性[22]。如图5所示,在发酵36 h时,5种乳酸菌的亚硝酸盐降解率均高于70%;在发酵48 h时,亚硝酸盐降解率均高于80%。其中,嗜酸乳杆菌表现出最强的降解亚硝酸盐能力,亚硝酸盐降解率在48 h时达到94.62%。其次是植物乳植杆菌,在48 h时达到91.74%。
图5 乳酸菌降解亚硝酸盐的能力
Fig.5 Nitrite dagrading ability of lactic acid bacteria
综上,植物乳植杆菌的菌体生物量最大,产酸和耐盐能力最强,同时具有较好的耐酸和降解亚硝酸盐能力。因此,本试验选取植物乳植杆菌作为马铃薯泡菜的发酵菌种进行后续试验。
2.2 优质乳酸菌发酵马铃薯泡菜的条件优化及品质评价
2.2.1 接种量对马铃薯泡菜品质的影响
由图6可知,马铃薯泡菜的感官评分随着接种量的增加呈先降低后升高的趋势,滋味和脆度分值在超过3%添加量后显著下降,整体感官评分在接种量3%达到最高值88.42。原因是在发酵初期接种量较少时,植物乳植杆菌的代谢活动迅速增加,加速乳酸的产生,在达到某一临界点后,过量的微生物代谢使体系内酸性或有毒副产品积累,从而抑制其他微生物的生长或导致发酵过程的停滞,使发酵泡菜的风味变得刺鼻,阻碍部分风味的形成。与此同时,体系内代谢产物的不平衡(酸、醇或其他挥发性化合物)也将导致其出现异味或不愉快的风味[23]。
图6 接种量对泡菜感官评分的影响
Fig.6 Effect of inoculation amount on sensory evaluation of kimchi
2.2.2 盐浓度对马铃薯泡菜品质的影响
由图7可知,马铃薯泡菜的感官评分在盐质量分数2%时达到最大值89.52,随后逐渐降低。随着盐浓度的升高,气味和脆度呈逐渐下降趋势,超过盐质量分数3%后下降速度加快。一个原因是盐浓度过高导致植物乳植杆菌的生物量减少,进而影响发酵效果和风味的丰富性[24]。另外,过重的盐味可能掩盖体系内其他的风味成分,使泡菜口感单一,缺乏层次感[25]。
图7 盐质量分数对泡菜感官评分的影响
Fig.7 Effect of salt concentration on sensory evaluation of kimchi
2.2.3 发酵时间对马铃薯泡菜品质的影响
发酵时间直接影响泡菜的风味形成,在发酵初期,产品的风味物质(如乳酸、醇类和酯类)生成不足,泡菜味道较为单一和清淡。随着发酵时间的延长,植物乳植杆菌的代谢活动增加,风味成分逐渐丰富,泡菜的酸味和香气会更加明显[26]。但较长的发酵时间也会使泡菜变得过于酸涩,影响食用体验[27]。由图8可知,随着发酵时间的增长,马铃薯泡菜的气味、滋味和整体接受度大体呈升高趋势,脆度逐渐减小,总体评分在第9天达到最大值88.36,然后小幅度降低。
图8 发酵时间对泡菜感官评分的影响
Fig.8 Effect of fermentation time on sensory evaluation of kimchi
2.2.4 马铃薯泡菜的工艺优化
结合单因素试验结果,以接种量、盐浓度和发酵时间为自变量,以泡菜的感官评分为参考指标,正交优化植物乳植杆菌发酵马铃薯泡菜的工艺,得到的试验结果如表3和表4所示。根据极差结果可知,各因素对马铃薯泡菜感官评分的影响大小为接种量>发酵时间>盐浓度,最佳发酵条件为植物乳植杆菌3%,盐质量分数2%,发酵时间9 d。根据方差结果可知,接种量对马铃薯泡菜的感官评分产生极显著影响(P<0.01),发酵时间和盐浓度影响显著(P<0.05)。
表3 正交试验结果
Table 3 Results of orthogonal experiment
试验号ABC感官评分111188.64212292.84313391.06421291.85522392.13623190.66731387.4832188.52933289.87k190.84789.29789.273k291.54791.16391.520k388.59790.53090.197Rj2.9501.8662.247最优组合:A2B2C2
表4 方差分析
Table 4 Analysis of variance
注:F0.05(2,2)=19.00,F0.01(2,2)=99.00,*表示显著性差异(P<0.05),**表示显著性差异(P<0.01)。
因素偏差平方和自由度F比显著性感官评分A14.2552131.991∗∗B5.407250.065∗C7.651270.843∗误差0.10821.000
2.2.5 优质乳酸菌发酵马铃薯泡菜的的品质评价
由图9所示,自然发酵体系中亚硝酸盐含量随着发酵时间的增加先迅速升高,在第6天达到最大值12.85 mg/kg,而后在第8天降低至6.61 mg/kg并保持平稳。而植物乳植杆菌泡菜体系中的亚硝酸盐含量相对平稳,第4天上升至4.39 mg/kg,随后逐渐降低,第9天低至2.92 mg/kg,与空白组相比,亚硝酸盐含量下降了52.21%。因为在发酵初期,植物乳植杆菌的活动尚处于适应阶段,微生物的代谢速率相对较低。此时,体系中存在的亚硝酸盐未被有效利用,从而导致亚硝酸盐含量的暂时升高。当发酵进入中后期,植物乳植杆菌的代谢活性逐渐增强,其主要代谢途径会开始将亚硝酸盐作为电子受体,通过还原反应转化为氮气等其他化合物。这个过程会导致亚硝酸盐的迅速减少,从而使其含量下降[28]。
图9 发酵方式对马铃薯泡菜亚硝酸盐含量的影响
Fig.9 Effect of fermentation method on nitrite content in potato kimchi
由图10所示,接种了植物乳植杆菌的马铃薯泡菜在气味、滋味、脆度和整体接受度方面均优于自然发酵,其中脆度的差值最大,植物乳植杆菌发酵比自然发酵高了4.1。前者的感官评分总分为91.5,后者为80.4。原因是植物乳植杆菌在发酵过程中会生成多种风味化合物和香气成分,如酯类、醇类和酸类,这些成分可以显著提升泡菜的感官特性,使其更具吸引力[29]。
图10 发酵方式对马铃薯泡菜感官评价的影响
Fig.10 Effect of fermentation method on sensory evaluation in potato kimchi
3 结论
本研究从嗜酸乳杆菌、唾液链球菌嗜热亚种、植物乳植杆菌、肠膜明串珠菌和戊糖片球菌中筛选出具有较强产酸、耐酸、耐盐和降解亚硝酸盐能力的乳酸菌进行发酵马铃薯泡菜的探究。试验以马铃薯为研究对象,优化了嗜酸乳杆菌发酵马铃薯泡菜的工艺,并与自然发酵泡菜进行对照,突出了其在降解亚硝酸盐和提升品质方面的贡献。各因素对马铃薯泡菜感官评分的影响大小为接种量>发酵时间>盐浓度,最佳发酵条件为植物乳植杆菌3%(体积分数),盐质量分数2%,发酵时间9 d。在此工艺条件下,第9天的亚硝酸盐含量低至2.92 mg/kg,与自然发酵相比下降了52.21%。且接种了植物乳植杆菌的马铃薯泡菜在气味、滋味、脆度和整体接受度方面均优于自然发酵,感官评分总分为91.5。
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