高血糖是一种由长期高糖饮食引起的肥胖疾病[1]。随着生活水平的提高、饮食结构的变化以及肥胖人数的增加,高血糖的发病年龄逐渐年轻化且发病范围不断扩大[2]。若机体长期处于高血糖水平,将显著增加患糖尿病的概率。糖尿病是一种会对人体健康造成严重威胁的非传染性慢性疾病[3]。因此,血糖调控对于糖尿病及其并发症的预防与改善具有至关重要的作用。目前,糖尿病主要通过胰岛素注射和口服降糖药治疗[4]。然而,胰岛素注射存在作用时间短、成本高和低血糖等不良反应[5]。此外,高血糖患者长期使用双胍类降糖药可能会引起恶心、腹痛、胀气等不良反应,有一定的副作用[6]。因此,近年来开发降血糖的功能性食品逐渐成为研究热点。
青稞主要产于中国的青海、西藏、云南、四川等地区[7],富含蛋白质、淀粉、脂肪、维生素B等营养成分,具有调节血糖、补充体力、健脾养胃的功效,非常适合现代人在调整饮食模式时食用[8]。尽管已有研究探讨了青稞粉的降血糖效果,但随着时代的不断发展以及食品加工技艺的持续精进,以青稞为主要原料的食品品类愈发繁多,如青稞燕麦粥、青稞面包、青稞薯片、青稞饭卷、青稞鱼面、青稞气泡饮料等[9]。但青稞降血糖作用机制仍不明确,并且对青稞在茶饮品方面的开发研究较少。
基于此,本研究以C57BL/6J小鼠作为实验动物,饲喂高脂饲料建立高血糖模型,通过用青稞复配茶(highland barley blended tea,HBBT)干预模型鼠探究其降血糖、降血脂和减肥功效。研究结果可为HBBT对高血糖的改善效果及机制提供理论依据,并为青稞资源在功能食品中的应用提供参考。
1 材料与方法
1.1 主要材料与试剂
青稞复配茶(青稞、葛根、藤茶、红枸杞、杭白菊、甜菊叶),青海省新丁香粮油有限责任公司;无特定病原体动物(specific pathegon free,SPF)级雄性C57BL/6J小鼠,北京维通利华实验动物技术有限公司;超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)试剂盒、丙二醛(malondialdehyde,MDA)试剂盒、过氧化氢酶(catalase,CAT)试剂盒、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-PX)试剂盒、总胆固醇(total cholesterol,TC)试剂盒、甘油三酯(triglyceride,TG)试剂盒、低密度脂蛋白胆固醇(low-density lipoprotein cholesterol,LDL-C)试剂盒、高密度脂蛋白胆固醇(high-density lipoprotein cholesterol,HDL-C)试剂盒,南京建成生物工程研究所;胰岛素试剂盒、抵抗素试剂盒、脂联素(adiponectin,ADP)试剂盒、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(phosphoenolpyruvate carboxykinase,PEPCK)试剂盒、TNF-α试剂盒、IL-6试剂盒、IL-1β试剂盒,南京森贝伽生物科技有限公司;0.9%(质量分数)生理盐水,上海禾丰制药有限公司;盐酸二甲双胍片(药品),江苏德源药业股份有限公司;高脂饲料(D12492),江苏省协同医药生物工程有限责任公司;PBS、葡萄糖,均为分析纯,上海麦克林生化科技股份有限公司。
1.2 主要仪器与设备
AX224ZH/E电子分析天平,奥豪斯仪器(常州)有限公司;HHS数显恒温水浴锅,上海博讯实业有限公司医疗设备;LXJ-Ⅱ高速离心机,上海安亭科学仪器厂;UV-3200紫外分光光度计,上海美谱达仪器有限公司;FS-1电动匀浆机,上海比朗仪器有限公司;RT-6100酶标仪,深圳雷杜生命科学股份有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 青稞复配茶的制备
HBBT是按照青稞(6 g)、葛根(0.35 g)、枸杞(1 g)、藤茶(1 g)、杭白菊(0.3 g)和甜菊叶(0.03 g)的配比装入玉米纤维袋中配制而成。前期已经优化并得出最佳冲泡工艺:将茶包放入300 mL,100 ℃水中冲泡15 min,重复冲泡3次,然后将青稞复配茶旋蒸浓缩、冷冻干燥制备成茶粉末,按照不同比例复溶后干预小鼠。
1.3.2 动物实验
该研究所涉及动物实验由江南大学实验动物伦理委员会审议通过,许可证号:SYXK(苏)2021-0056,伦理编号:JN.No20240115c0680530[009]。将雄性6周龄SPF级健康C57BL/6J小鼠作为实验对象,分为6组,空白组(CG)10只,模型组(MG)及青稞复配茶低剂量组(T-LG)、中剂量组(T-MG)、高剂量组(T-HG)每组各12只,阳性药物组(PG)10只,共68只。12 h光照/黑暗循环,光照时间段为8:00～20:00,在常规条件下饲养,室温为20～26 ℃,湿度为40%～70%,补充饮食饮水,并保持动物房洁净卫生。
小鼠首先在SPF级动物房中适应环境7 d,期间自由摄取纯净水和基础饲料。适应期后,对小鼠进行体重和血糖检测,记录初始血糖值。CG组继续饲喂普通饲料和水,而MG组、PG组及青稞复配茶低、中、高剂量组则饲喂高脂定制饲料。每周固定时间称量体重和检测空腹血糖值(fasting blood glucose,FBG),持续9周。当小鼠体重超过正常对照组20%,随机血糖值高于11.1 mmol/L,并且至少2只小鼠血脂指标超过正常范围时,认为模型建立成功,并记录此时的体重和血糖值。
模型建立成功后,CG组继续饲喂普通饲料,其他组在继续饲喂高脂饲料的同时,开始进行药物干预。MG组和CG组小鼠每天给予生理盐水灌胃(0.1 mL/10 g),PG组小鼠给予盐酸二甲双胍溶液灌胃(150 mg/kg),而青稞复配茶组小鼠则给予不同剂量的青稞复配茶灌胃:低剂量组(1.45 g/kg)、中剂量组(2.9 g/kg)、高剂量组(5.8 g/kg)。每周调整青稞茶灌胃剂量以适应小鼠体重的变化,并在灌胃前后定期测量小鼠的FBG。整个实验过程中,每天观察并记录小鼠的精神状况,直至实验结束。
在实验的最后阶段,小鼠禁食不禁水8 h后称重和麻醉,通过眼眶静脉采血法收集血液,静置后离心取血清,用于测定血清生化指标和炎症因子等指标。随后对小鼠进行断颈处理,取出肝脏并称重,肝脏组织用4%(质量分数)多聚甲醛固定后进行苏木精-伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色,观察肝脏的形态变化。其余组织则保存于-80 ℃冰箱中以备后续分析。
1.3.3 血糖指标测定
1.3.3.1 FBG测定
小鼠适应环境1周后,饲养期间每周固定时间对小鼠禁食不禁水8 h后采用尾尖穿刺采血法检测小鼠FBG[10]。
1.3.3.2 口服糖耐量测定
给予小鼠4周的阳性药物及青稞复配茶灌胃后,对小鼠禁食8 h但不禁水。实验中用2.00 g/(kg·bw)的葡萄糖溶液,分别给予6组小鼠灌胃。之后在0、30、60、90、120 min时,采取尾尖穿刺取血的方式检测各组小鼠的血糖水平[11]。记录各组小鼠的血糖变化,并计算和分析血糖曲线下面积(area under the curve,AUC)。
1.3.4 理化指标测定
血清TC、TG、LDL-C、HDL-C、胰岛素、抵抗素、ADP、TNF-α、IL-6、IL-1β及肝脏中的TC、TG、SOD、MDA、CAT、GSH-PX、PEPCK依据试剂盒操作指南检测。
1.3.5 肝脏组织切片染色
将新鲜的小鼠肝组织保存在4%(质量分数)多聚甲醛溶液中固定,石蜡包埋处理后进行HE染色,最后在光学显微镜下观察[12]。
1.4 数据处理
对数据进行分析,计量资料用“平均数±标准偏差”表示。用Graphpad Prism 9和OriginPro 2021做图,组间比较采用单因素方差分析和t检验,P<0.05表示有显著统计学差异。
2 结果与分析
2.1 HBBT活性物质测定
使用苯酚-硫酸法测定青稞复配茶中多糖的含量。采用紫外分光光度法测定总黄酮和总多酚的含量。采用HPLC检测葛根素和二氢杨梅素含量,结果如表1所示。
表1 在最佳冲泡工艺参数下青稞复配茶提取物的主要活性物质含量
Table 1 Main active substance content of highland barley blended tea extract under optimal brewing process parameters
主要活性成分含量单位多酚143.39±2.72mg/包黄酮24.56±0.39mg/包多糖419.3±4.47mg/包浸出物0.95±0.06g/包二氢杨梅素96.08±9.48mg/包葛根素4.43±1.24mg/包
2.2 HBBT对小鼠体重的影响
经过4周的HBBT干预,T-HG组小鼠较CG组毛发更光亮,行动依旧迅速且敏捷,整体精神状态良好,表现出较高的活力。相比之下,MG组小鼠则显得精神不振,体型肥胖,动作迟缓且活动量减少。如图1所示,与CG组相比,MG组小鼠体重显著增高(P<0.01),而PG组和不同剂量的青稞复配茶组小鼠较MG组小鼠体重有所降低,说明青稞复配茶有减肥功效。其中,T-HG小鼠体重相较于T-LG和T-MG降低程度最大且与PG组相差较小,由此可见高剂量青稞复配茶改善肥胖效果与药物盐酸二甲双胍相近。
图1 饲养期间各组小鼠体重变化
Fig.1 Changes in body weight of mice in each group during feeding period
2.3 HBBT对小鼠FBG的影响
如图2-a所示,饲喂小鼠高脂饲料9周后,各组小鼠FBG较CG组都显著升高(P<0.05),说明造小鼠高血糖模型成功。给予小鼠HBBT干预4周,CG组的FBG基本保持不变,而MG组的FBG持续增长,PG组FBG较MG组显著下降(P<0.01)。HBBT各组的变化与PG组一致,较MG组都显著下降(P<0.01)。表明HBBT对高血糖小鼠的血糖有一定的改善作用。这或许是因为HBBT中存在多酚、黄酮等活性成分,通过提升胰岛素的敏感度、减轻胰岛素抵抗以及加速血糖转化为糖原的过程,进而有效降低了FBG水平,与之前的研究一致[13-14]。
a-高脂饲料干预9周后;b-HBBT干预4周后
图2 HBBT对小鼠FBG的影响
Fig.2 Effect of HBBT on FBG levels in mice
注:*表示存在显著性差异(P<0.05),**表示(P<0.01),***表示(P<0.001),****表示(P<0.000 1)(下同)。
2.4 HBBT对小鼠糖耐量的影响
按照1.3.3.2节方法进行小鼠糖耐量实验,给予葡萄糖灌胃后各时间点小鼠FBG如图3-a所示,呈现先升高后降低的趋势。葡萄糖耐受性通常以AUC来衡量。AUC的数值大小反映了机体利用和清除葡萄糖的能力,AUC值越高,表明机体对葡萄糖的耐受性越差;反之,AUC值越低,表明机体对葡萄糖的耐受性越好[15]。如图3-b所示,MG组小鼠AUC较CG组显著增加(P<0.01),表明9周的高脂饮食干预降低了小鼠对葡萄糖的耐受能力。与MG组相比,PG组和HBBT各剂量组的AUC值均显著降低(P<0.01),表明给予小鼠HBBT干预增强了高血糖小鼠对葡萄糖的耐受能力。因此,HBBT能够增强小鼠的葡萄糖耐受能力。
a-FBG;b-AUC
图3 HBBT对小鼠葡萄糖耐受量的影响
Fig.3 Effect of HBBT on glucose tolerance in mice
2.5 HBBT对小鼠血清酶活力影响
由图4-a～图4-d可知,MG组与CG组相比,血清TC、TG和LDL-C水平显著升高(P<0.01),而HDL-C水平则显著降低(P<0.01),说明高脂饮食会导致小鼠血脂代谢紊乱。而T-HG较MG组小鼠血清TC、TG和LDL-C水平显著降低(P<0.01),而HDL-C水平则显著升高(P<0.01),表明高剂量的HBBT能够调节小鼠血脂代谢,减轻高脂饮食诱导的小鼠血脂水平紊乱。
a-TC;b-TG;c-HDL-C;d-LDL-C;e-TNF-α;f-IL-6;g-IL-1β;h-胰岛素;i-抵抗素;j-ADP
图4 HBBT对小鼠血清酶活力的影响
Fig.4 Effect of HBBT on serum enzyme activity in mice
注:图中ns表示不存在显著性差异(下同)。
a-TC;b-TG;c-SOD;d-MDA;e-CAT;f-GSH-Px;g-PEPCK
图5 HBBT对小鼠肝脏酶活力的影响
Fig.5 Effect of HBBT on liver enzyme activity in mice
a-CG;b-MG;c-PG;d-T-LG;e-T-MG;f-T-HG
图6 HBBT对高血糖小鼠肝脏组织病理学研究(HE染色,200×)
Fig.6 Pathological study of HBBT on liver tissue of hyperglycemic mice
由图4-e～图4-g可知,MG组与CG组相比,血清TNF-α、IL-6和IL-1β水平显著升高(P<0.01),而HBBT各剂量组较MG组小鼠血清TNF-α、IL-6和IL-1β水平显著降低(P<0.01),说明HBBT能够降低高血糖小鼠血清炎症因子水平。胰岛素水平的变化可以反映机体对血糖调节的生理状态[16]。
如图4-h,T-MG和T-HG能够显著增加MG组胰岛素水平(P<0.01),说明HBBT能够通过提高胰岛素分泌来调节机体血糖水平。抵抗素与胰岛素抵抗密切相关,其可能通过减弱肝脏、骨骼肌及脂肪组织对胰岛素的反应性,阻断胰岛素信号传导路径,进而影响糖和脂质的正常代谢,导致血糖平衡失调[17]。如图4-i所示,HBBT各剂量组抵抗素水平显著低于MG组(P<0.01),进而调节机体血糖代谢。ADP对能量代谢和胰岛素敏感性具有显著影响,能够促进脂肪酸氧化,调节脂肪分解与利用,增加机体对葡萄糖的摄取和利用,抑制肝脏葡萄糖生成,减少胰岛素抵抗,提高胰岛素敏感性,从而在血糖水平调节中发挥重要作用[18]。如图4-j所示,T-HG能够显著升高MG组(P<0.01)ADP水平,调节机体糖脂代谢。
2.6 HBBT对小鼠肝脏酶活力影响
由图5-a、图5-b知,MG组与CG组相比,肝组织TC和TG水平显著升高(P<0.01),而T-HG较MG组小鼠肝组织TC和TG水平显著降低(P<0.01),说明高剂量的HBBT能够调节小鼠肝组织血脂代谢。由图5-c～图5-f可知,MG组与CG组相比,肝组织SOD、CAT和GSH-PX水平显著降低(P<0.01),MDA水平显著升高(P<0.01),而T-HG较MG组小鼠肝组织SOD、CAT和GSH-PX水平显著升高(P<0.01),MDA水平显著降低(P<0.01),说明高剂量的HBBT能够提高小鼠肝组织抗氧化能力,减轻肝组织氧化损伤。PEPCK是肝脏和肾脏中糖异生的限速酶,也是三羧酸循环通量的关键调节器[19]。如图5-g所示,MG组PEPCK水平较CG组显著升高(P<0.01),反映了肝脏对糖异生需求的增加,而HBBT各剂量组显著降低了MG组PEPCK水平(P<0.01),表明HBBT能够通过调节肝脏糖异生途径调节机体血糖水平。
2.7 HBBT对小鼠肝脏组织病理学分析
由图6可知,CG组小鼠肝脏结构完好且边界分明,无空洞出现,肝细胞规则排列,未观察到细胞变性或坏死,细胞核周围间隙均一,无炎症细胞异常增殖。相比之下,MG组小鼠肝细胞内出现大量空泡样结构,组织结构混乱,肝细胞肿胀并呈现空泡样变性,胞质变得透明且疏松。在PG组中,肝脏细胞排列相对规整,虽有空泡存在,但未见炎症细胞增生。T-LG组肝脏细胞排列欠整齐,空泡样结构及炎症细胞增生相较于MG组有所减轻,但依然较为显著。T-MG组肝脏细胞排列较为规整,空泡样结构显著减少,炎症细胞增生现象不明显。而T-HG组肝脏细胞排列整齐,未见明显空泡样结构,仅存在轻微的脂肪变性和水肿现象,较MG组大幅改善。这表明HBBT各组均能改善糖尿病小鼠肝细胞受损情况,T-HG改善效果最佳。
3 结论与讨论
本实验选用青稞作为主要原料,并以枸杞、葛根、藤茶、杭白菊和甜菊叶为辅,共同配制出HBBT,探究其对高血糖小鼠的降糖作用。研究发现,HBBT能够降低高脂饲料诱导的高血糖小鼠体重升高趋势、显著降低高血糖小鼠FBG并提高其糖耐量;通过调节血脂成分,具体表现为降低TC、TG以及LDL-C的浓度,同时提升HDL-C的含量,缓解血脂代谢紊乱;并且具备减轻肝脏氧化应激反应以及维护肝细胞完整性等多重功效;通过降低小鼠血清TNF-α、IL-6和IL-1β的水平来减少小鼠炎症;通过显著升高胰岛素和ADP水平,显著降低抵抗素和PEPCK水平调节机体糖脂代谢,维持血糖稳定;通过显著提高SOD、CAT和GSH-Px水平,显著降低MDA水平,减少高血糖小鼠机体氧化损伤程度;HE染色结果显示,HBBT能够减轻肝组织的变性情况,明显减少肝组织空泡状结构,改善糖尿病肝损伤。
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