“炭烧”一词来源于美拉德反应,是牛乳中的蛋白质和还原糖经持续的高温处理后发生的羰氨反应,生成种类繁多的小分子挥发性化合物和大分子褐色产物,从而生成具有焦香风味和褐色色泽的新产品[1]。在美拉德反应的早期阶段,蛋白质可逆转地与葡萄糖和其他的碳基化合物的碳基反应,形成一个希夫碱基。然后,当pH值达到中性值时,希夫碱进行分子内重新排列,以获得更稳定的Amadori重排产物—酮胺[2]。美拉德反应后期,经额外的化学转化之后,Amadori重排产物产生了所谓的高级糖基化终端产品(glycosylation terminal products,GLEs)。在近些年,乳制品市场发生着从单一的、低附加值的初加工向系列化、高附加值的深加工转变[3],使得“炭烧酸奶”逐渐成为一种新兴酸奶品种。有研究发现经过美拉德反应处理的山羊奶,发酵后的褐羊奶风味、色泽和质地的改善明显[4];AIDARBEKOVA等[5]对乌克兰的传统发酵烘焙牛奶进行β-乳球蛋白特异性ELISA测试,结果显示乳清和纯β-乳球蛋白过敏性显着降低了95%。以上都是美拉德反应在食品中的相关研究,但关于美拉德反应在固态发酵乳制品中的研究鲜有报道。
干酪又称奶酪、乳酪,是由牛奶经凝乳酶浓缩制成,相较于其他乳制品具有更高的营养成分;不仅是蛋白质和钙的良好来源,在其发酵和成熟过程中生成多种活性物质,对人体具有抗炎、抗氧化、抗增殖、抗菌活性以及免疫调节等益处[6]。有不少关于干酪理化指标的相关研究,如GONÇALVES等[7]对在不同拉伸温度下制造的莫扎里拉干酪蛋白质稳定性的变化研究发现,拉伸温度的变化并不影响干酪成分,但主要促进了冷藏期间的变化。此外在核磁共振成像中观察到,奶酪中酪蛋白和水的流动性降低,脂肪颗粒尺寸增加。BARAC等[8]对不同成熟阶段的白色咸山羊奶酪的可溶性氮进行研究发现,在奶酪成熟的前10 d蛋白质降解速度很快,并在随后的40 d内降解速度缓慢,β-氰基含量缓慢但持续下降。奶酪成熟后,水溶性和非水溶性组分的总抗氧化能力增加。DI等[9]对意大利帕勒莫乳干酪理化特性进行测定,发现随着样品中可溶性氮含量的增加,其硬度呈现上升趋势。这些都是关于普通发酵干酪理化性质的研究,而关于炭烧干酪的研究几乎没有。
本研究以美拉德反应为原理制备炭烧干酪,通过单因素试验和响应面实验设计对炭烧干酪的葡萄糖添加量、美拉德反应温度、美拉德反应时间进行系统研究分析,以确定最佳反应条件。同时测定炭烧干酪基础理化指标(pH值、水分、色度、蛋白质含量、脂肪含量)及微生物指标(菌数总数、乳酸菌),明确发酵时间对炭烧干酪中蛋白质降解量、蛋白酶活力及微生物的变化。为以美拉德反应为原理的固态发酵乳制品新品种的开发提供一定的理论依据。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 原料与试剂
巴氏鲜牛奶(蛋白质质量分数5%,脂肪质量分数6%,碳水化合物质量分数2%),宁夏北方乳业有限责任公司;凝乳酶、柠檬酸,深圳市富晟生物科技有限公司;MRS培养基、平板计数琼脂培养基,北京奥博星生物技术有限责任公司;三氯乙酸,上海宏瑞化工有限公司;浓硫酸,上海裕纳化工有限公司。
1.1.2 仪器与设备
PHS-25酸度计,广州铭睿电子科技有限公司;LT202E电子天平,常熟市天量仪器有限责任公司;YS6060色差仪,盛奥华科技有限责任公司;JC-ST-06脂肪测定仪,北京精诚华泰仪表有限公司;UPT-K1800全自动凯氏定氮仪,北京优谱通用科技有限公司;WJ-3恒温培养箱,上海一恒科学仪器有限公司;XW-80A旋涡混合仪,上海嘉鹏科技有限公司;DILITCEN22离心机,苏州贝锐仪器科技有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 样品的制备
a)普通干酪的制备。参照DEMERS等[10]方法,稍作修改。取1 L巴氏鲜牛奶于食品级容器中,隔水加热至25 ℃左右关小火保持温度加入柠檬酸溶液(1 g无水柠檬酸于5 mL脱氯水搅拌溶解),搅拌3～5 min;再将牛奶温度升到32～35 ℃时关火,加入准备好的凝乳酶溶液(1 g凝乳酶于5 mL脱氯水搅拌溶解)搅拌,顺时针两圈逆时针一圈,然后盖上盖子静止20 min。用漏网过滤出乳清,经压榨接入干酪发酵剂,装入密封袋置于温度为18 ℃,相对湿度为45%的培养箱中,成熟8 d。取样点为0、2、4、6、8 d,以发酵0 d的样品为对照组。
b)炭烧干酪的制备。用凝乳酶提取出牛奶中的酪蛋白,步骤与上述普通干酪相同。排出乳清后,在酪蛋白中加入质量分数10%(下同)的食用葡萄糖搅拌使其充分溶解,密封置于水浴锅中加热一定时间。待产生明显的褐变,停止加热,使其冷却至室温后接入干酪发酵剂,装入密封袋置于温度为18 ℃,相对湿度为45%的培养箱中,成熟8 d。取样点为 0、2、4、6、8 d,以未发生美拉德反应制备的样品为对照组。
1.2.2 基础理化指标的测定
a)水分含量测定:参考GB 5009.3—2016《食品安全国家标准 食品中水分的测定》。
b)脂肪含量测定:参考GB 5009.6—2016《食品安全国家标准 食品中脂肪的测定》。
c)蛋白质含量测定:参考GB 5009.5—2016《食品安全国家标准 食品中蛋白质的测定》。
d)pH值的测定:参考杨万龄等[11]方法,稍作修改。取3 g干酪样品于30 mL去离子水中搅拌均匀,用精密pH计测量。实验平行测定3次。
e)蛋白质水解程度的测定:干酪样品的总氮含量根据标准GB 5009.5—2016《食品安全国家标准 食品中蛋白质的测定》中凯氏定氮法测定。根据MANE等[12]的方法测定pH值为4.6条件下干酪中可溶性氮含量(pH 4.6-SN),根据ÇAKIR等[13]的方法测定12%三氯乙酸(trichloroacetic acid,TCA)条件下干酪中可溶性氮含量(12%TCA-SN)。
1.2.3 色度、蛋白酶活力、乳酸菌总数以及菌落总数的测定
a)色度的检测:采用色差仪直接测定,褐变指数的计算如公式(1)、公式(2)[14]所示:
(1)
(2)
b)蛋白酶活力:参考照SB/T 10317—1999《食品安全国家标准 蛋白酶活力测定法》中福林法测定。
c)乳酸菌总数及菌落总数测定:参照GB 4789.35—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 乳酸菌检验》进行测定。
1.2.4 总游离氨基酸的测定
参考ZHOU等[15]的方法,进行游离氨基酸的测定。
1.2.5 感官评定
参考李彤等[16]的方法,对炭烧干酪进行感官评定。
1.3 数据处理
样品的理化指标以及蛋白质降解度的数据采用Excel进行平均值和标准偏差分析。采用SPSS 26.0软件进行单因素方差分析(P<0.05,差异显著),Design-Expert.V8.0.6.1进行响应面优化,利用Origin 2022软件作图。
2 结果与分析
2.1 炭烧干酪工艺优化的单因素试验
2.1.1 葡萄糖添加量对炭烧干酪感官评分、褐变指数和菌落总数的影响
为探究葡萄糖添加量对炭烧干酪褐变指数、菌落总数以及感官评定的影响,选用葡萄糖添加量分别为4%、6%、8%、10%、12%制作样品,在温度为18 ℃,相对湿度为45%的培养箱中发酵4 d,对发酵样品的色度和菌落总数进行测定,并进行感官评分。结果由图1所示。
图1 不同葡萄糖添加量对炭烧干酪的影响
Fig.1 Effect of different glucose additions on fermented brown cheese
注:不同小写字母表示差异显著(P<0.05)(下图同)。
当葡萄糖添加量在4%～10%,对褐变指数、菌落总数和感官评分的影响总体呈现上升趋势。说明在此期间随着葡萄糖的添加量的增加,炭烧干酪的总体接受度升高;当葡萄糖添加量在10%～12%,葡萄糖添加量对褐变指数、菌落总数、感官评分的影响呈现下降趋势,这可能是由于还原糖添加量太高对细菌生长有抑制作用[17]。
单因素分析表明,不同葡萄糖添加量对炭烧干酪感官评分、褐变指数和菌落总数影响显著。随着发酵的进行,微生物通过炭烧干酪原料里的物质进行生长代谢,产生了一些挥发性或者非挥发性物质。综上,选择葡萄糖添加量8%、10%、12%进行进一步的实验优化以及响应面试验设计。
2.1.2 加热温度对炭烧干酪感官评分、褐变指数和菌落总数的影响
为探究美拉德反应的加热温度对炭烧干酪褐变指数、菌落总数以及感官评定的影响,选用加热温度分别为80、85、90、95、100 ℃制作样品,在相对温度为18 ℃,相对湿度为45%的培养箱中发酵4 d,对发酵样品的色差和菌落总数进行测定,并进行感官评分。结果由图2所示。
图2 加热温度对炭烧干酪的影响
Fig.2 Effect of heating temperature on fermented brown cheese
由图2可知,当加热温度在80～95 ℃时,感官评分呈现上升趋势;而温度在95～100 ℃时,得分下降。褐变指数随着加热温度的升高呈现上升趋势,这与GIOVANELLI等[18]的研究一致。而菌落总数则一直呈下降趋势,这可能是由于更高的温度使乳中的蛋白质变性,减少了细菌生长所需要的营养物质,导致了细菌总数的减少。
单因素分析表明,不同的加热温度对炭烧干酪感官评分、褐变指数和菌落总数影响显著。综上,选择加热温度为90、95、100 ℃进行进一步的实验优化以及响应面设计。
2.1.3 加热时间对炭烧干酪感官评分、褐变指数和菌落总数的影响
如图3所示,当加热时间为1.5～3.5 h时,感官评分呈现先上升后下降的趋势,在加热3.0 h时感官评分最高。褐变指数随着加热时间的增长呈上升趋势,说明加热时间越长,美拉德反应越明显。而菌落总数一直处于下降的趋势,这可能是因为随着加热时间的增加,干酪中蛋白质和水分的保留率下降,不利于细菌的生存[19]。
图3 加热时间对炭烧干酪的影响
Fig.3 Effect of heating time on fermented brown cheese
单因素分析表明,不同的加热时间对炭烧干酪感官评分、褐变指数和菌落总数影响显著。综上,选择加热时间为2.5、3.0、3.5 h进行进一步的实验优化以及响应面设计。
2.2 炭烧干酪工艺优化的响应面试验
在单因素试验的基础上,利用Design-Expert.V8.0.6.1软件进行响应面Box-Behnken Design试验设计。选取葡萄糖添加量(A)、加热时间(B)和加热时间(C)这3个因素为自变量,进行3因素3水平的响应面试验,根据试验设计得到的感官评分见表1。
表1 响应面试验设计与结果
Table 1 Response surface test design and results
试验号RUN添加量加热温度加热时间感官评价/分1121095378.67±2.082151290376.33±1.533108100374.21±0.934412100374.33±0.815178952.575.33±1.5261112952.577.33±4.51798953.576.33±3.8981412953.580.33±3.539510952.579.33±2.611013101002.573.05±1.4311310903.578.14±0.31127101003.577.32±1.5313161095384.28±5.571461095384.67±7.091511095385.54±4.041681095382.67±6.201721095384.67±4.11
对表的结果进行多元线性拟合,得到感官评分对葡萄糖添加量(A)、加热温度(B)和加热时间(C)的拟合方程式为Y=84.20+0.5A-1.75B+0.83C+0.67AB+0.5AC+1.33BC-3.93A2-4.43B2-2.93C2。
由表2可知,炭烧干酪感官评分变化回归模型变量的关系显著(P<0.01),而失拟项差异不显著,表明模型建立成功。根据表1的F值可得出,这3种因素对感官评价的影响次序分别是加热温度>加热时间>葡萄糖添加量。
表2 回归方程方差分析表
Table 2 Analysis of variance (ANOVA) table for regression equations
差异来源平方和自由度均方F值P值显著性模型246.91927.4316.350.000 7A-添加量2.0012.001.190.311 1B-加热温度24.50124.5014.600.006 5C-加热时间5.5615.563.310.111 6AB1.7811.781.060.337 5AC1.0011.000.59600.465 4BC7.1117.114.240.078 5A265.14165.1438.830.000 4B282.76182.7649.320.000 2C236.23136.2321.590.002 4残差11.7471.68失拟项8.2832.763.180.146 3不显著误差3.4740.866 7总和258.6516
各种因素交叉作用对感官评分的影响如图4所示。当美拉德反应加热时间为3.0 h时,葡萄糖添加量和加热温度对炭烧干酪的感官评价交互作用如图4-a所示。当葡萄糖添加量不变时,随着加热温度的增加,产品的感官评价得分先增高后降低;最佳加热温度为95 ℃。加热温度不变时,随着葡萄糖添加量的增加,干酪的感官评分先增高后降低。葡萄糖添加量为10%时,感官评价达到最大值。
a-葡萄糖添加量和加热温度的交互作用;b-葡萄糖添加量和加热时间的交互作用;c-加热温度和加热时间的交互作用
图4 各因素交叉作用对感官评分的影响
Fig.4 Effect of cross-talk of factors on sensory scores
当美拉德反应加热温度为95 ℃时,葡萄糖添加量和加热时间对炭烧干酪的感官评价交互作用如图4-b所示。当葡萄糖添加量不变时,随着加热时间的增加,产品的感官评价得分先增高后降低;最佳加热时间为3.0 h。当加热时间不变时,随着葡萄糖添加量的增加,干酪的感官评分先增高后降低。当葡萄糖添加量为10%时,感官评价达到最大值。
当葡萄糖添加量为10%时,加热温度和加热时间对炭烧干酪的感官评价交互作用如图4-c所示,当加热温度不变时,随着加热时间的增加,产品的感官评价得分先增高后降低;最佳加热时间为3.0 h。当加热时间不变时,随着加热温度的增加,干酪的感官评分先增高后降低,当加热温度为95 ℃,感官评价达到最大值。
由响应面实验设计最佳结果得出,炭烧干酪的最佳工艺条件为葡萄糖添加量9.062%、加热温度98.926 ℃和加热时间3.122 h。根据单因素试验及响应面实验结果,结合实验操作的实际情况,选择葡萄糖添加量为10%、加热温度95 ℃和加热时间3.0 h,进行3次实验,结果取平均值,感官评价最高,说明该模型具有可行性。
2.3 美拉德反应对干酪发酵过程中相关品质的影响
2.3.1 炭烧干酪发酵过程中基础理化的分析
根据上述响应面工艺优化的结果选取葡萄糖添加量(10 %)、加热温度(95 ℃)和加热时间(3.0 h)的加工工艺制备炭烧干酪,密封置于18 ℃恒温培养箱中进行发酵(0、2、4、6、8 d),并对不同发酵时间的产品进行接下来的品质测定。以发酵0 d的炭烧干酪为空白对照,如表3所示。
表3 炭烧干酪发酵过程中相关理化指标的测定
Table 3 Determination of physicochemical indexes related to the fermentation process of brown cheese
理化指标D0D2D4D6D8pH值5.46±0.090 7a5.37±0.106 9ab5.49±0.160 4a5.21±0.073 7b4.82±0.080 8c水分含量/%45.81±0.085 4a39.73±0.106 0b34.77±0.072 1c32.29±0.122 2d31.43±0.073 7e脂肪含量/%3.49±0.066 5a3.06±0.068 1c2.92±0.064 2b2.81±0.061 9d2.72±0.082 9d蛋白质含量/%13.44±0.070 2a12.69±0.117 9b12.50±0.215 5b11.77±0.148 4c11.02±0.162 6d总氮/%1.36±0.104 1a1.82±0.100 1c2.06±0.094 5a2.17±0.106 9b2.99±0.175 2apH4.6-SN/%0.83±0.098 1a0.92±0.184 0a2.93±0.023 3b3.15±0.135 0b4.42±0.142 5c12%TCA-SN/%2.02±0.037 4e2.44±0.128 6d2.86±0.048 5c3.76±0.118 4b4.56±0.062 1a游离氨基酸/(μg/mL)0.52±0.045 2d0.87±0.031 9c1.33±0.087 3ab2.16±0.170 0b2.94±0.059 0a
注:不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。
由表3可知,pH值总体呈下降的趋势,只有在发酵2～4 d呈现略微上升趋势;其在整个发酵阶段有较大差异,从5.46下降到4.82,这可能是由于干酪在成熟过程中在微生物及酶的作用下糖酵解产生乳糖,乳糖进一步分解形成乳酸,从而降低pH值[20]。在发酵初期,水分含量下降速率相较于中后期快。这是由于在干酪发酵初期,美拉德反应导致炭烧干酪的成熟温度较高,水分含量下降速率较快。随着成熟温度降低,水分蒸发作用受到阻碍,干酪的水分含量在成熟的中后期减少量变缓,最终其水分含量约稳定到31.43%。此外,水分减少是发酵过程中产生了酸以及微生物的繁殖作用,从而导致干酪脱水收缩[21]。这与GARC
A等[22]的研究结果相一致。
随着成熟时间的推移,脂肪和蛋白质含量发生显著变化,分别从3.49%和13.44%下降到2.72%和11.02%。蛋白质的降低是由于在干酪成熟过程中,其被降解为更小的肽段,使得干酪形成独特的风味和质地,干酪中的部分氮会随着干酪乳清析出[23];此外,加热会使蛋白质发生变性。干酪成熟过程中脂肪含量呈现不同程度的降低,主要是由于原料乳中的脂肪在微生物以及脂肪酶的作用下被分解,形成游离的脂肪酸、酯类、酮类等挥发性风味物质[24]。
通过对不同发酵时间下样品总氮含量的测定,观察炭烧干酪在发酵过程中蛋白质的降解情况。由表可知,随着成熟时间的增加,总氮含量总体呈现上升的趋势,从1.36%上升至2.99%,且其降解速率在发酵后期高于发酵初期,这是由于炭烧干酪中蛋白质发生降解,蛋白酶活力上升所致。蛋白质发生降解是因为存在于奶酪基质的残余酶水解了酪蛋白,对奶酪基质结构造成了破坏[25]。pH 4.6-SN含量是指奶酪在pH值为4.6时,自由大分子肽、小分子肽及自由氨基酸的总量[26],它反映了奶酪的水解广度,并可以根据等电点沉淀原理确定干酪中多肽的含量。而12%TCA-SN作为评价干酪水解深度的指标,可以反映奶酪中2～20个氨基酸残基、短肽等,这些主要是由发酵剂中形成的微生物肽酶作用的结果[27]。由表3可知,pH 4.6-SN含量随着发酵时间的进行呈上升趋势,发酵初期趋势平缓,随着乳酸菌数量的上升,在发酵后期上升速率较快。12%TCA-SN含量差异明显,从0 d的2.02%,上升至第8天的近4.56%左右。这是由于随着发酵的进行,细菌胞体发生凋亡解体,使得细胞里面的肽酶释放,肽酶能将蛋白酶分解形成的大分子肽及多肽分解为小分子肽[28]。并且肽酶的释放还能减少凝乳酶对干酪的苦味,形成风味物质。本研究结果表明,经过乳酸菌的发酵,炭烧干酪中的蛋白质会快速分解,生成大量的多肽和氨基酸,从而改善干酪的风味。
2.3.2 炭烧干酪发酵过程中相关品质的测定
为了能够清楚的看到美拉德反应对干酪发酵过程中各项指标的影响,本研究将未发生美拉德反应制成的普通干酪与发生美拉德反应制成的炭烧干酪一致发酵4 d,对其进行各项理化指标的测定。测定结果如表4所示。
表4 普通干酪和炭烧干酪发酵过程中相关理化指标的对比
Table 4 Comparison of physicochemical indices related to the fermentation process of ordinary and brown cheese
样品pH值酸度/%水分含量/%脂肪含量/%蛋白质含量/%普通干酪5.32±0.0742.53±0.1243.66±0.093.33±0.1319.82±0.19炭烧干酪5.49±0.1655.91±0.1439.77±0.072.92±0.0512.50±0.22
由表4可知,普通干酪和炭烧干酪在发酵过程中的各项理化指标变化明显。干酪的水分含量的变化是由于其成熟过程是一个不断向外排乳清的过程。并且随着成熟期的延长,蛋白质在各个发酵期发生不同程度的水解,从而使得酪蛋白网络结构逐渐减弱,存在于网络结构内部的水分会以渗出物的形式释放出来[29]。从表4可以看出,普通干酪的水分含量及蛋白质含量比炭烧干酪的更高,这可能是因为美拉德反应导致蛋白质变性减少了原料乳中的蛋白质含量。同样,炭烧干酪中的脂肪含量略低于普通干酪,这可能是由于酪蛋白在加热过程中,脂肪球膜蛋白发生变性,失去脂肪球膜的脂肪不稳定,凝结在一起。增大测量的误差,从而可能导致炭烧干酪样品中的脂肪含量降低。但与蛋白质含量对比发现,脂肪含量降低的不明显,这可能是由于高热处理使得牛奶产生类似豆腐的多孔矩阵[30],渗透性下降,可能阻碍了脂肪以乳清的形式释放出来,从而提高了脂肪的保留率。
2.3.3 炭烧干酪发酵过程中酶活力及乳酸菌数的变化
蛋白酶和脂肪酶能够将蛋白质分解成氨基酸和脂肪酸,随着发酵时间的延长,能使干酪在不同时期产生不同的风味物质。通过添加适当的蛋白酶或脂肪酶,可以获得具有更高感官,更好质地和可接受性高的干酪[31]。而乳酸菌可以促进胃肠道消化、延缓衰老、降低胆固醇含量,具有良好的保健功效,在干酪的品质和风味上有着决定性的作用。在食品安全国家标准中明确规定,活菌类益生菌保健食品在其保质期内活菌数不能低于5 lg CFU/mL。
如图5所示,在炭烧干酪成熟前期(0～6 d)蛋白酶活力随着成熟时间的延长而增加,酶活力在6 d达到最高值,随后在成熟6～8 d酶活力显著下降(P<0.05)。可能是炭烧干酪在发酵后期菌种活力下降,且部分发生自溶及衰亡[32],从而导致蛋白酶活力下降,可见微生物在蛋白质降解过程中发挥着重要的作用。总体而言,蛋白酶活力在发酵0～4 d上升缓慢,这是由于前期美拉德反应温度较高,不适于微生物的生长。
图5 不同发酵时间炭烧干酪蛋白酶活力及菌数的变化情况
Fig.5 Changes in protease activity and bacterial count of fermented brown cheese at different fermentation times
随着成熟时间的增加,干酪中的菌落总数和乳酸菌数呈现先上升后下降的趋势,并且在第4天分别达到最大值2.23×108 CFU/g和1.41×108 CFU/g。这是由于发酵在0～4 d时适合微生物增长的各类营养物质充足,菌的数量快速增长;4 d以后营养物质消耗完,细菌开始凋亡,因此数量逐渐下降。
3 结论
本实验研究了炭烧干酪在0～8 d成熟过程中理化指标、酶活力、菌数以及蛋白质降解度的动态变化,研究发现,随着发酵的进行,微生物作用导致干酪的pH值和水分下降,pH 4.6-SN和12% TCA-SN上升;蛋白酶活力在0～4 d上升迟缓是由于美拉德反应导致发酵初期的温度太高,并在发酵6 d达到最大值,在发酵后期酶活力下降是由于酸性环境的抑制作用导致菌种衰退、自溶。美拉德反应使得原料乳中的蛋白质变性导致酪蛋白的网络结构减弱,导致蛋白质和水分含量显著降低;相对而言脂肪含量减少量较小,可能是由于高热处理使得脂肪球膜变性从而降低了渗透力,提高了脂肪的保留率。
本研究可为以美拉德反应为原理的干酪加工和新产品开发提供理论参考,但试验中感官评价存在个体差异;其风味物质及内在的代谢机理有待进一步研究。
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