食醋是我国传统发酵调味品[1],多以天然开放式多菌种固态发酵工艺生产[2]。固态发酵食醋具有色泽优良、香味浓郁、口味醇厚等优点,但同时也存在着生产周期长、劳动强度大、出品率低、生产要素难控制等问题[3]。液态发酵食醋可采用表面静态发酵、深层液态发酵等方式[4],具有生产周期短、劳动强度低、利用率高等特点[5],但由于其菌种单一,也会出现酸感刺激、风味寡淡、口感单调等缺点[6]。

目前液态发酵食醋主要通过引入新的发酵功能微生物、优化发酵工艺参数和选育更优质的醋酸菌去提升食醋的风味品质,其中将筛选得到的功能微生物应用于液态发酵食醋中已成为研究热点。杜琳琳[7]将产香酵母引入液态发酵食醋中,在经过生物强化后食醋非挥发性酸含量显著增加,醇类和酯类挥发性化合物含量更加丰富;赵天行[8]将不同乳酸菌与不同醋酸菌应用于液态发酵黑米醋中,发现瑞士乳杆菌与巴氏醋杆菌共培养发酵出的食醋风味品质最佳;宋雪苗等[9]将Torulaspora delbrueckii 强化至苹果醋发酵中,发现其可增加苹果醋的花果香气,增加代谢产物的复杂性。

分阶段乳酸强化为提升液态发酵食醋品质提供新的思路,可分为前期乳酸强化和后期乳酸强化。前期乳酸强化是在液态发酵食醋的发酵前期加入产酸性能良好的乳酸菌进行前期乳酸强化,液态发酵食醋在进行前期乳酸强化后,可以有效增加乳酸质量浓度,改善风味[6]。后期乳酸强化是在液态发酵食醋的发酵后期加入耐酸性能良好的乳酸菌进行发酵,由于巴氏醋杆菌会在醋酸发酵过程中消耗乳酸,影响食醋乳酸的进一步提升[10],因此在醋酸发酵过程后期加入耐酸性能良好的乳酸菌,既可以消除醋酸菌对提升乳酸含量的阻碍又能通过引入新的微生物增加食醋风味。

食醋的整体风味主要由气味和滋味两部分组成[11],即挥发性成分和不挥发性成分,它们来源于原料、微生物的代谢产物或已有物质之间的化学反应[12]。有机酸是食醋滋味的重要组成部分,食醋中乳酸与乙酸的含量占总有机酸含量的75%以上[13],乳酸等不挥发酸的含量提升可以使醋味更加柔和。利用功能微生物或合成微生物群落进行生物强化[14]是获得高质量产品的有效办法,JIANG等[15]发现植物乳杆菌和酿酒酵母菌株混合发酵可显著提高玫瑰醋的乳酸含量,改善其风味;JIA等[16]发现将Candida parapsilosis 和Candida metapsilosis 强化到雪茄烟叶中可显著降低烟叶生物碱含量,增加风味物质含量。瑞士乳杆菌是固态食醋醋酸发酵阶段的主要物种,在菌落生长和各种风味化合物之间呈正相关[17],是固态发酵食醋乳酸的主要提供者[10];耐酸乳杆菌是固态食醋封醅阶段的优势物种[18],可以耐受较高浓度的乙酸。因此将瑞士乳杆菌与耐酸乳杆菌以生物强化的方式分阶段应用于液态发酵食醋的发酵中,去增加食醋的乳酸和其他风味物质是可行的,但目前有关分阶段复合强化的研究较少。

本研究尝试将瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)与耐酸乳杆菌(Lactobacillus acetotolerans)分阶段添加于液态发酵食醋的发酵过程中,以期达到改善食醋有机酸组成、丰富风味等效果,为优化液态发酵食醋的酿造工艺,改善其风味品质提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

酒醪由江苏恒顺醋业股份有限公司提供,酒精度为8%(体积分数);实验菌种为L.helveticus L-6、L.acetotolerans L-9、巴氏醋杆菌A-1(Acetobacter pasteurianus A-1)。

NaCl、NaOH、ZnSO4、麦芽浸粉、3, 5-二硝基水杨酸、亚铁氰化钾(分析纯),国药集团化学试剂公司;2-辛醇(色谱纯),美国Sigma公司;甲醇、乳酸、乙酸、草酸、酒石酸、柠檬酸、丙酮酸、焦谷氨酸、琥珀酸(色谱纯),上海阿拉丁生化科技股份公司。

1.2 仪器与设备

GC 7890B-MSD 5977B 气相色谱-质谱联用仪,美国Agilent公司;50/30 μm DVB/CAR/PDMS Stableflex (gray) 固相微萃取头,美国Supelco公司;Waters e2695 高效液相色谱仪,美国Waters公司;TS-5000Z味觉分析系统,日本INSENT公司;HYL-A全温摇瓶柜,太仓市强乐实验设备厂;生化培养箱,上海精宏实验设备有限公司;Spark 20M酶标仪,瑞士Tecan公司。

1.3 实验方法

1.3.1 菌种活化

A.pasteurianus A-1在LB液体培养基中30 ℃下200 r/min振荡培养24 h;L.acetotolerans L-9在MRS液体培养基中静置培养48 h;L.helveticus L-6在MRS液体培养基中37 ℃下静置培养24 h。

1.3.2 米醋的液态发酵

将酒醪的酒精度稀释至4.5%(体积分数),经检测发酵底物初始还原糖质量浓度为117 g/L,装液量不超过摇瓶容量的45%,实验中所使用摇床的温度为30 ℃,转速为200 r/min,所使用培养箱的温度为37 ℃。

对照组发酵方法(对照组):将活化好的A.pasteurianus A-1以2%的接种量接入200 mL的酒醪置于30 ℃、200 r/min的摇床中进行醋酸发酵4 d,在醋酸发酵完成后置于37 ℃培养箱中静置培养5 d,发酵完成后离心灭菌。

L.helveticus L-6强化发酵(单菌强化组):将活化好的L.helveticus L-6以2%的接种量接入200 mL的酒醪中,置于37 ℃培养箱中静置培养1 d后,以2%的接种量接入A.pasteurianus A-1,置于30 ℃、200 r/min的摇床中进行醋酸发酵3 d,在醋酸发酵完成后置于37 ℃培养箱中静置培养5 d,发酵完成后离心灭菌。

L.helveticus L-6与L.acetotolerans L-9分阶段复合强化发酵(复合强化组):活化好的L.helveticus L-6以2%的接种量接入200 mL的酒醪中,置于37 ℃培养箱中静置培养1 d后,以2%的接种量接入A.pasteurianus A-1,置于30 ℃、200 r/min的摇床中进行醋酸发酵3 d,发酵结束后以2%的接种量接入L.acetotolerans L-9,置于37 ℃培养箱中静置培养5 d,发酵完成后离心灭菌。

1.3.3 总酸的测定

液态发酵食醋的总酸测定参考GB/T 5009.41—2003《食醋卫生标准的分析方法》中的酸碱指示剂滴定法。

1.3.4 有机酸的测定

液态发酵食醋的有机酸测定参考GB/T 18623—2011《国家地理标志产品 镇江香醋(含第1号、2号、3号修改单)》中的HPLC法。

1.3.5 总酸生成速率

总酸生成速率按照公式(1)计算:

总酸生成速率

(1)

式中:P,总酸质量浓度,g/L;t,时间。

1.3.6 乙醇转化率

乙醇转化率按照公式(2)计算:

乙醇转化率

(2)

式中:ρ0,醋酸发酵结束后生成的乙酸质量浓度,g/L;ρ1,食醋发酵过程中初始的乙醇质量浓度,g/L;1.304,乙酸与乙醇的质量比。

1.3.7 还原糖的检测

液态发酵食醋还原糖的测定采用DNS比色法,参考NY/T 2742—2015《水果及制品可溶性糖的测定 3,5-二硝基水杨酸比色法》。

1.3.8 挥发性化合物的检测

依据文献[19]的方法,将测得的质谱图与NIST谱库比对进行定性分析,以2-辛醇作为内标,采用内标峰面积归一化法计算各种成分的相对含量。

1.3.9 电子舌测定方法

将待测液态发酵食醋用超纯水稀释10倍后倒入电子舌专用测定杯,待电子舌仪器通过自检、活化、校准、清洗等步骤后,对每个样品进行5次测定,并取后3次较为稳定的测定数据作为原始数据[20]。

1.3.10 液态发酵食醋的感官评价

在干净舒适且无异味的环境下,由10名经过食醋感官培训的专业人员组成感官评价小组,按照表1的评价标准(100分制)对所得的3种液态发酵食醋样品进行感官评价,以平均得分为最终结果。

1.3.11 数据处理与分析

使用Excel 2019对数据进行统计,使用SPSS 26对数据进行单因素方差分析(one-way ANOVA)。采用SIMCA 14.1对挥发性化合物进行偏最小二乘判别分析(partial least squares-discrimination analysis,PLS-DA)。

2 结果与分析

2.1 复合强化液态发酵食醋的理化指标变化过程及有机酸组成

2.1.1 食醋发酵过程的理化指标变化

如图1所示,对照组发酵终点总酸为4.21 g/100 mL;单菌强化组发酵终点总酸为4.08 g/100 mL;复合强化组发酵终点总酸为5.15 g/100 mL。

对照组总酸生成速率的变化趋势是在发酵前3 d总酸生成速率不断增加,于第3天达到最大,随后逐渐降低,当第5天进入静置发酵时总酸生成速率几乎为0,略有波动可能与取样误差有关。单菌强化组与复合强化组总酸生成速率的变化趋势在发酵的前4天相一致,当加入醋酸菌后总酸生成速率有所下降,这可能与环境中较高浓度乳酸抑制醋酸菌的生长有关,总酸生成速率在第3天时达到最大,且总酸最大生成速率高于对照组,这说明瑞士乳杆菌能够促进巴氏醋杆菌的产酸速率,这与刘静[21]的结果相一致。但当第5天进入静置发酵时单菌强化组总酸生成速率几乎为0,复合强化组中由于L.acetotolerans L-9的高耐酸性,总酸生成速率逐渐增加,于第8天时达到最大,随后逐渐下降。对照组与单菌强化组生产强度无明显差异,但复合强化组在发酵后期引入L.acetotolerans L-9进行生物强化,由于L.acetotolerans L-9可以在高乙酸环境下生长,复合强化组在静置发酵阶段生产强度较高。综上由于L.acetotolerans L-9的高耐酸性,使得复合强化组的生产强度高于对照组与单菌强化组。

在液态发酵食醋发酵过程中乙酸主要由醋酸菌产生,乙醇会诱导醋酸菌产生乙醇脱氢酶,随后乙醇脱氢酶将乙醇氧化为乙醛,乙醛最终通过乙醛脱氢酶氧化为乙酸。3组液态发酵食醋乙醇转化率在69.42%～71.71%,三者无明显差异。

对照组、单菌强化组和复合强化组的还原糖在发酵终点时分别为64.66、44.95、3.41 g/L,在经过乳酸菌强化后,液态发酵食醋的还原糖消耗速率和还原糖消耗量均得到提升,其中复合强化组对底物的利用能力最强。

2.1.2 复合强化对液态发酵食醋有机酸的影响

食醋有机酸组成对液态发酵食醋风味品质有着重要影响[22]。如表2所示,对照组的乙酸含量占总有机酸含量的95.3%,乳酸含量占总有机酸含量的0.2%。单菌强化组的乙酸含量占总有机酸的93.0%,乳酸含量占总有机酸的1.2%。复合强化组的乙酸含量占总有机酸的69.0%,乳酸含量占总有机酸的27.0%。经过L.helveticus L-6、L.acetotolerans L-9分阶段复合强化后,食醋乳酸含量从0.42 g/L提升至12.8 g/L,较单菌强化组提升了30倍。另外,与对照组相比,复合强化组食醋的丙酮酸含量从0.01 g/L提升至0.07 g/L,而具有涩味的草酸[22]含量有所降低。焦谷氨酸在对照组中没有检出,而在单菌强化组和复合强化组均有检出。焦谷氨酸可由谷氨酸和谷氨酰胺在酰基环化酶的作用下生成[23],而黄婷[18]采用宏基因组与宏转录组测序发现巴氏醋杆菌可以利用乙醇、糖等底物合成谷氨酸,因此推测醋酸菌可能缺少合成酰基环化酶的基因从而不能合成焦谷氨酸,而两种乳酸菌具有该能力。综上,在液态发酵食醋的发酵过程中加入乳酸菌进行强化可以影响食醋中有机酸组成,乳酸、丙酮酸等不挥发酸含量的显著提升,对缓冲食醋中醋酸所具有的刺激酸感具有作用[24]。

2.2 复合强化对液态发酵食醋挥发性化合物的影响

如图2所示,对照组、单菌强化组和复合强化组分别检测出30、43、49种挥发性化合物,说明乳酸强化可以增加液态发酵食醋的挥发性风味种类,以复合强化最明显。酸类化合物是液态发酵食醋样品中占比最高的挥发性化合物,其次是酯类和醇类化合物。

单菌与双菌乳酸强化对液态发酵食醋挥发性化合物的改变不相同,经过前期L.helveticus L-6强化后,醋中醇类化合物占比明显下降,酸类、酮类、酚类和其他类化合物占比提升;经过L.helveticus L-6及L.acetotolerans L-9复合强化后,醋中酸类、酯类、酮类、酚类挥发性化合物的占比得到了提高,醇类挥发性化合物的占比明显下降。

根据挥发性化合物含量热图可知,在3种液态发酵食醋中含量均较高的物质主要有苯乙醇、2,3-丁二醇、苯甲醛、乙酸、异戊酸、乙酸乙酯、3-羟基-2-丁酮。上述化合物能够赋予食醋花果香、酸香等风味特征。

PLS-DA模型分析可以用于确定挥发性化合物对样品间差异的影响[25]。采用PLS-DA模型对对照组、单菌强化组和复合强化组的挥发性化合物进行分析,模型的R2X、R2Y和Q2均高于0.5,表明模型稳定,拟合度和预测能力较高(表3)。根据PLS-DA分析筛选出VIP >1.0且P<0.05的挥发性化合物共27种,包括醇类化合物1种、醛类化合物1种,酸类化合物10种、酯类化合物9种、酮类化合物3种、酚类化合物1种及其他类化合物2种(表4)。

在对照组中没有检出而在单菌强化组检测到的化合物有21种,在对照组中没有检出而在单菌强化组与复合强化组均检测到的挥发性化合物有3种,包括:苯乙酸、3,5-二叔丁基苯酚和乙酸乙烯酯。苯丙氨酸在苯丙氨酸转氨酶的催化下能够生成苯丙酮酸进而生成苯乙酸,有研究发现巴氏醋杆菌可以在固态发酵过程中提供合成苯丙氨酸所需的关键酶,对苯丙氨酸的合成具有较大贡献[18],由此推测醋酸菌可能缺少苯丙氨酸转氨酶的合成途径,无法将苯丙氨酸转化为苯乙酸;3,5-二叔丁基苯酚是一种具有抗生物膜和抗真菌活性的挥发性有机化合物,它的生成可能与瑞士乳杆菌可以分泌一种抑制细菌生物膜生成的胞外多糖有关[26];醋酸菌将酒醪中的乙醇转化为乙酸后,通过酯化反应生成乙酸类酯,但对照组中并未有乙酸乙烯酯产生,推测在经过乳酸菌强化后,瑞士乳杆菌与巴氏醋杆菌发生代谢功能交互,促进了酯类等物质的生成[27]。

复合强化组较单菌强化组含量显著增加的重要差异挥发性化合物有丁酸、正癸酸、顺-5-十二碳烯酸、反-2-癸烯酸、壬酸、月桂酸、苯乙酸、苯甲酸、乳酸乙酯、乙酸乙酯、乙酸丁酯、苯乙基丙酯、琥珀酸单乙酯、环十二烷。乙酸乙酯[28]、乙酸丁酯、苯乙基丙酯、香叶基丙酮具有愉快的花果香气,苯乙酸具有甜蜂蜜味,壬酸具有脂肪和椰子香气,月桂酸具有花生香气,乳酸乙酯具有朗姆酒、水果和奶油香气。在这些重要差异化合物中,乳酸乙酯和乙酸乙酯的含量增加最为显著,酯类化合物通常由醇与酸发生酯化反所生成[29]。在发酵前期由于巴氏醋杆菌会消耗乳酸,可能导致乳酸乙酯难以合成,而发酵后期仅L.acetotolerans L-9可以在高乙酸、低氧环境下生长,所生成的乳酸难以被消耗,因此推测L.acetotolerans L-9所生成的乳酸与残留乙醇通过酶的催化发生酯化反应,生成大量乳酸乙酯;乙酸乙酯显著增加可能与乙酸和乙醇发生酯化反应有关。

部分重要差异化合物在单菌强化组中含量更高,而在进行复合强化后的液态发酵食醋中含量较低,包括:异丁醇、2,4-二甲基苯甲醛、邻苯二甲酸二异丁酯、己酸乙酯、乙酸异丁酯、乙酸乙烯酯、2-羟基-3-戊酮、3,5-二叔丁基苯酚、香兰素,其中2-羟基-3-戊酮、己酸乙酯、异丁醇具有水果味,2,4-二甲基苯甲醛具有苦杏仁味,乙酸乙烯酯具有甜的醚味,香兰素具有奶香味,乙酸异丁酯具有生梨和覆盆子的香气。

综上,L.helveticus L-6及L.acetotolerans L-9分阶段复合强化可以赋予液态发酵食醋更多的花果香气、甜香及奶香特征。

2.3 液态发酵食醋的感官评价结果

采用电子舌技术对3种液态发酵食醋进行了滋味的测定,结果如图3-a所示。对照组的食醋酸味最为刺激,苦味最弱及苦味回味最弱;用乳酸菌进行强化后,食醋的鲜味、甜味均有所提升,酸味均有所减弱。L.helveticus L-6、L.acetotolerans L-9分阶段进行乳酸强化可以提升鲜味和甜味,其酸味明显弱于其他两组,这与其乳酸的相对含量高有关。

如图3-b所示,所有液态发酵食醋的色泽和体态得分均在20分以上,外观金黄通透;各组香气和滋味得分有明显差异,对照组得分最低。进行复合强化的液态发酵食醋得分最高,花果香、奶香等气味更为醇厚且不刺鼻,口感更为柔和协调,这与复合强化组可以积累更多的乳酸,产生更多的乳酸乙酯、乙酸乙酯等具有奶香、花果香的物质有关。

结合电子舌与感官评价的结果发现,在液态发酵食醋的发酵过程利用L.helveticus L-6、L.acetotolerans L-9进行分阶段复合强化可以有效改善食醋的风味品质。

3 结果与讨论

本研究在液态发酵食醋的发酵过程中分阶段加入瑞士乳杆菌与耐酸乳杆菌,通过生物强化的方式提升液态发酵食醋品质。结果表明,乳酸菌复合强化后食醋总酸为5.15 g/100 mL,残留还原糖含量为3.41 g/L。食醋有机酸组成发生了明显改变,乳酸、丙酮酸等不挥发酸含量明显提高,其中乳酸含量从0.10 g/L增加到12.8 g/L,相对含量提升了25.8%。通过PLS-DA分析筛选出27种具有重要差异的挥发性化合物发现,乳酸菌复合强化组中具有花果香、奶香和甜香的挥发性化合物增多。此外,电子舌分析及感官评价结果表明两种乳酸菌复合强化可以改善食醋风味,柔和酸感,提升甜味和鲜味。本研究证实了液态发酵食醋的发酵过程中进行L.helveticus L-6与L.acetotolerans L-9复合强化,有助于优化食醋有机酸组成及提升风味品质,为食醋酿造工艺优化和产品创新提供参考。

瑞士乳杆菌与耐酸乳杆菌均属于传统发酵食品中的优势微生物,可以为发酵食品贡献独特风味。有研究表明食醋的风味物质主要在醋酸发酵阶段产生,瑞士乳杆菌作为醋酸发酵阶段的优势物种与许多风味物质呈正相关性,但是其耐酸性能较差,会随着酸度的增加种群丰度逐渐减少[18]。耐酸乳杆菌能通过增强碳水化合物代谢和能量代谢、合成长链脂肪酸、提高 H+-ATPase 活性等方式来抵御酸胁迫[30]。因此,将这两种乳酸菌共同应用于液态发酵食醋中既可以产生更多的风味物质,又可以积累更多的不挥发酸。但是,目前不同微生物共培养后产生的化合物的代谢途径尚不明确,未来可以通过基因组学、代谢组学进行更深层次的分析,以期加深对多菌种协同发酵代谢机制的理解,更好地应用于实际生产中。

参考文献

[1] 许正宏, 陆震鸣, 史劲松.食醋酿造原理与技术[M].北京:科学出版社, 2019.
XU Z H, LU Z M, SHI J S.Vinegar Brewing Principles and Techniques[M].Beijing:Science Press, 2019.

[2] LU Z M, WANG Z M, ZHANG X J, et al.Microbial ecology of cereal vinegar fermentation:Insights for driving the ecosystem function[J].Current Opinion in Biotechnology, 2018, 49:88-93.

[3] 孙宏韬, 李伟, 朱曼丽, 等.食醋的固态发酵工艺及其反应器进展[J].中国调味品, 2018, 43(12):89-93;98.
SUN H T, LI W, ZHU M L, et al.Research on solid fermentation process and reactor progress of vinegar[J].China Condiment, 2018, 43(12):89-93;98.

[4] GULLO M, VERZELLONI E, CANONICO M.Aerobic submerged fermentation by acetic acid bacteria for vinegar production:Process and biotechnological aspects[J].Process Biochemistry, 2014, 49(10):1571-1579.

[5] 原德树.液态深层发酵柿子醋及其澄清工艺研究[J].中国酿造,2010, 29(7):99-102.
YUAN D S.Submerged fermentation and clarification of persimmon vinegar[J].China Brewing, 2010, 29(7):99-102

[6] 邓永建, 陆震鸣, 张晓娟, 等.不同乳酸菌对液态发酵米醋总酸及风味物质的影响[J].食品科学, 2020, 41(22):97-102.
DENG Y J, LU Z M, ZHANG X J, et al.Effects of different lactic acid bacteria on the total acid content and flavor compounds of rice vinegar produced by liquid-state fermentation[J].Food Science, 2020, 41(22):97-102.

[7] 杜琳琳. 液态发酵醋品质提升的多菌种发酵工艺研究[D].济南:齐鲁工业大学,2023.
DU L L.Research on multi-strain fermentation process for improving the quality of liquid state fermentation vinegar[D].Jinan:Qilu University of Technology, 2023.

[8] 赵天行. 产苯乳酸乳酸菌的生物学特性分析及其在食醋生产中的应用[D].武汉:华中农业大学,2022.
ZHAO T X.Biological characteristics of phenyllactic acid-producing lactic acid bacteria and its application in vinegar production[D].Wuhan:Huazhong Agricultural University, 2022.

[9] 宋雪苗, 马世源, 李子健, 等.苹果内生菌Torulaspora delbrueckii强化对苹果醋风味物质合成的影响[J].食品科学, 2023, 44(20):330-342.
SONG X M, MA S Y, LI Z J, et al.Effect of co-fermentation with the apple endophyte Torulaspora delbrueckii on the synthesis of the flavor substances of apple vinegar[J].Food Science, 2023, 44(20):330-342.

[10] CHAI L J, SHEN M N, SUN J, et al.Deciphering the d-/l-lactate-producing microbiota and manipulating their accumulation during solid-state fermentation of cereal vinegar[J].Food Microbiology, 2020, 92:103559.

[11] 郑宇, 程程, 刘静, 等.中国传统固态发酵食醋主要特征风味物质组成分析[J].中国食品学报, 2020, 20(8):237-247.
ZHENG Y, CHENG C, LIU J, et al.Analysis of main characteristic flavor components in Chinese traditional solid-state fermented vinegars[J].Journal of Chinese Institute of Food Science and Technology, 2020, 20(8):237-247.

[12] 石芬芬, 李文梦, 王庭欣.食醋发酵过程中风味物质的研究[J].中国调味品, 2017, 42(2):159-162.
SHI F F, LI W M, WANG T X.Research on the flavor substances in vinegar fermentation process[J].China Condiment, 2017, 42(2):159-162.

[13] 王韦岗, 曹伟, 朱新生.食醋中有机酸含量的测定及差异性分析[J].食品与发酵科技, 2013, 49(2):81-84;97.
WANG W G, CAO W, ZHU X S.Determination of organic acids in vinegar and difference analysis[J].Food and Fermentation Technology, 2013, 49(2):81-84;97.

[14] AI M, QIU X, HUANG J, et al.Characterizing the microbial diversity and major metabolites of Sichuan bran vinegar augmented by Monascus purpureus[J].International Journal of Food Microbiology, 2019, 292:83-90.

[15] JIANG Y J, GUO J N, LI Y D, et al.Optimisation of lactic acid fermentation for improved vinegar flavour during rosy vinegar brewing[J].Journal of the Science of Food and Agriculture, 2010, 90(8):1334-1339.

[16] JIA Y, LIU Y F, HU W R, et al.Development of Candida autochthonous starter for cigar fermentation via dissecting the microbiome[J].Frontiers in Microbiology, 2023, 14:1138877.

[17] HUANG T, LU Z M, PENG M Y, et al.Constructing a defined starter for multispecies vinegar fermentation via evaluation of the vitality and dominance of functional microbes in an autochthonous starter[J].Applied and Environmental Microbiology, 2022, 88(3):e0217521.

[18] 黄婷. 镇江香醋酿造微生物功能解析及酿醋人工菌群构建[D].无锡:江南大学,2023.
HUANG T.Functional analysis of microbial community of Zhenjiang aromatic vinegar and construction of a defined starter for acitic acid production[D].Wuxi:Jiangnan University, 2023.

[19] CHAI L J, QIU T, LU Z M, et al.Modulating microbiota metabolism via bioaugmentation with Lactobacillus casei and Acetobacter pasteurianus to enhance acetoin accumulation during cereal vinegar fermentation[J].Food Research International, 2020, 138:109737.

[20] 张璟琳, 黄明泉, 孙宝国, 等.电子舌技术在食醋口感评价中的应用[J].食品与发酵工业, 2013, 39(11):220-226.
ZHANG J L, HUANG M Q, SUN B G, et al.Application of electronic tongue technique in taste evaluation of vinegars[J].Food and Fermentation Industries, 2013, 39(11):220-226.

[21] 刘静.食醋发酵条件下乳酸菌对醋酸菌生长代谢的影响[D].天津:天津科技大学,2020.
LIU J.Effects of lactic acid bacteria on the growth and metabolism of acetic acid bacteria in vinegar fermentation conditions[D].Tianjin:Tianjin University of Science and Technology, 2020.

[22] 吴亚楠, 李林洁, 刘小菁, 等.传统食醋主要有机酸组成综述及其风味特征分析[J].中国调味品, 2021, 46(1):161-165.
WU Y N, LI L J, LIU X J, et al.Review of the composition of organic acids in traditional vinegar and analysis of their flavor characteristics[J].China Condiment, 2021, 46(1):161-165.

[23] MUCCHETTI G, LOCCI F, GATTI M, et al.Pyroglutamic acid in cheese:Presence, origin, and correlation with ripening time of Grana Padano cheese[J].Journal of Dairy Science, 2000, 83(4):659-665.

[24] WANG Z B, LI T T, LIU F Y, et al.Effects of ultrasonic treatment on the maturation of Zhenjiang vinegar[J].Ultrasonics Sonochemistry, 2017, 39:272-280.

[25] SUN X X, YU Y M, SALEH A S M, et al.Characterization of aroma profiles of Chinese four most famous traditional red-cooked chickens using GC-MS, GC-IMS, and E-nose[J].Food Research International, 2023, 173:113335.

[26] 岳莹雪, 李柏良, 宋月, 等.瑞士乳杆菌特性及应用研究进展[J].食品与发酵工业, 2019, 45(5):253-258.
YUE Y X, LI B L, SONG Y, et al.Research progress on characteristics and application of Lactobacillus helveticus[J].Food and Fermentation Industries, 2019, 45(5):253-258.

[27] 孙红, 柴丽娟, 陆震鸣, 等.镇江香醋核心酿造微生物醋酸杆菌和乳酸杆菌共培养对生长代谢的影响[J].微生物学报, 2021, 61(7):2065-2076.
SUN H, CHAI L J, LU Z M, et al.Effect of co-culture of Acetobacter and Lactobacillus strains on growth and metabolism of the key functional microbes during Zhenjiang aromatic vinegar fermentation[J].Acta Microbiologica Sinica, 2021, 61(7):2065-2076.

[28] SUMBY K M, GRBIN P R, JIRANEK V.Microbial modulation of aromatic esters in wine:Current knowledge and future prospects[J].Food Chemistry, 2010, 121(1):1-16.

[29] CHEN Y, LI P, LIAO L Y, et al.Characteristic fingerprints and volatile flavor compound variations in Liuyang Douchi during fermentation via HS-GC-IMS and HS-SPME-GC-MS[J].Food Chemistry, 2021, 361:130055.

[30] 赵皓静.耐酸乳杆菌产酸特性及酸胁迫应答机制[D].贵阳:贵州大学,2022.
ZHAO H J.Acid production characteristics of Lactobacillus acidophilus and its response mechanism to acid stress[D].Guiyang:Guizhou University, 2022.

Effect of bioaugmentation of Lactobacillus helveticus and Lactobacillus acetotolerans on the flavor of liquid fermented vinegar

HUANG Haolun1, LU Zhenming1,2, CHAI Lijuan1,2, ZHANG Xiaojuan1,2, XU Hongyu1,2, LI Xin3, SHI Jinsong4, XU Zhenghong1,2*

1(The Key Laboratory of Industrial Biotechnology of Ministry of Education, School of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China)2(National Engineering Research Center of Cereal Fermentation and Food Biomanufacturing, Jiangnan University, Wuxi 214122, China)3(Jiangsu Hengshun Vinegar-industry Co.Ltd., Zhenjiang 212143, China) 4(School of Life Sciences and Health Engineering, Jiangnan University, Wuxi 214122, China)

Abstract In this study, Lactobacillus helveticus and Lactobacillus acetotolerans were sequentially inoculated during the fermentation process of liquid fermented vinegar to enhance product quality.The content of organic acids and volatile compounds in liquid fermented vinegar was analyzed and sensory evaluation was carried out, using techniques such as HPLC, headspace-solid phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry and electronic tongue.The results indicated that bioaugmentation using L.helveticus L-6 and L.acetotolerans L-9 could significantly improve the flavor quality of liquid fermented vinegar.The total acidity of liquid fermented vinegar reached 5.15 g/100 mL.The residual amount of reducing sugar was 3.41 g/L.The contents of lactic acid and pyruvate significantly increased, with the highest increase in lactic acid content reaching 12.8 g/L.Inoculation of two Lactobacillus species could significantly increase the content of volatile compounds such as ethyl acetate, ethyl lactate, and phenylacetic acid, which have floral, fruity, milky, and sweet aroma.Sensory evaluation indicated that the liquid fermented vinegar co-fermented by L.helveticus L-6 and L.acetotolerans L-9 exhibited sweetness and freshness while significantly reducing acidity, resulting in a significant improvement in flavor quality.This study confirmed that the application of L.helveticus L-6 and L.acetotolerans L-9 in vinegar fermentation could enhance the content of non-volatile acid and flavor of the vinegar, improving organic acids composition of vinegar, providing a reference for fermentation process optimization and flavor quality improvement of liquid fermented vinegar.

Key words lactic acid bacteria;liquid fermented vinegar;bioaugmentation;organic acids;flavor

DOI：10.13995/j.cnki.11-1802/ts.038613

引用格式：黄浩伦,陆震鸣,柴丽娟,等.瑞士乳杆菌与耐酸乳杆菌复合强化对液态发酵食醋风味的影响[J].食品与发酵工业,2025,51(1):143-150.HUANG Haolun, LU Zhenming, CHAI Lijuan, et al.Effect of bioaugmentation of Lactobacillus helveticus and Lactobacillus acetotolerans on the flavor of liquid fermented vinegar[J].Food and Fermentation Industries,2025,51(1):143-150.

第一作者：硕士研究生(许正宏教授为通信作者,Email:zhenghxu@scu.edu.cn)

基金项目：国家自然科学基金项目(32372314)

收稿日期：2024-01-17,改回日期：2024-03-20