黑鱼(Channa argus)又称乌鳢、乌鱼等,属于淡水鱼类,体型长而圆,骨刺少,含肉率高,且肉质鲜嫩;黑鱼中的优质蛋白、多不饱和脂肪酸含量高,必需氨基酸含量丰富,并具有调养补血的功效,享有“鱼中珍品”之称,深受消费者青睐[1]。黑鱼的传统食用方法为炖肉熬汤,受传统加工工艺的制约和限制,黑鱼资源利用率较低,故黑鱼资源的精深加工具有良好的研究前景。安丽等[2]对黑鱼和金黄色黑鱼肌肉的营养成分进行了分析与评价;毛书灿等[3]探究了超声辅助腌制的方法对微波黑鱼鱼片风味的影响;郑佳楠等[4]通过营养成分、色泽、滋味物质等指标的测定,结合感官评价,探究了不同热加工方式对黑鱼鱼汤营养成分及食用品质的影响。
热加工是一种常用的加工方法,一方面通过加热达到灭菌的效果,另一方面可以赋予鱼类良好的色泽、口感和风味。热加工方法及条件差异对鱼类成品的品质与风味有不同程度的影响。鱼类的热加工方法主要有蒸制、煮制、煎炸、烘烤等传统加工方法以及微波、真空低温烹调等新型加工方法;加热条件主要有温度、时间、导热介质等[5-6]。在所有的热加工方法中,蒸制是一种方便且成本低的加工方法,不仅能较好地保持鱼类的形态,还可以有效地保留鱼肉的营养成分,并且蒸制过程中油、盐的添加均较少,符合现代人们对健康饮食的追求。蒸制的温度、时间等条件会直接影响鱼肉的品质与风味,赵洪雷等[7]研究表明,随着蒸制时间的延长,海鲈鱼肉的质量损失率显著上升,鱼肉中游离氨基酸总量先增大后降低,在蒸制10 min达到最高值,海鲈鱼块在蒸制8～10 min的品质及风味较好;郑皎皎等[8]研究发现,随蒸制时间的延长,鲤鱼肌肉组织的失水率和pH值均呈上升趋势,加热过程中肌肉组织微观结构变化明显,纤维间隙逐渐增大直至纤维断裂。
本实验采用顶空-气相色谱-离子迁移谱(headspace-gas chromatography-ion mobility spectrometry, HS-GC-IMS)技术结合电子鼻对腌制黑鱼背肉在蒸制过程中的挥发性成分进行分析,探讨了腌制黑鱼背肉在蒸制过程中的挥发性气味变化,并将黑鱼背肉的熟化程度及风味变化与具体的挥发性成分进行了相关性分析,为确定黑鱼适宜的蒸制时间提供参考,对黑鱼的后续加工及黑鱼制品的开发提供了技术指导和支持。
1 材料与方法
1.1 实验原料
新鲜健康的黑鱼,每尾鱼质量为(1 200±200) g,长(20±5) cm,加碘食用盐,购于上海市浦东新区南汇新城镇宜浩欧景市集。
1.2 仪器与设备
FSH-2A可调高速均质机,江苏省常州苏瑞仪器有限公司;Flavor Spec®气相色谱-离子迁移谱联用仪,德国G.A.S公司;FOX-4000气味指纹分析仪(电子鼻),法国AlphaM.O.S公司。
1.3 实验方法
1.3.1 蒸制方法
鲜活黑鱼购买后重击头部致死,清洗干净,去除鱼皮、鱼头、鱼内脏,取背部鱼肉,切成3 cm×3 cm×2 cm的鱼块,用料液比1∶3、质量分数5%的盐水、4 ℃条件下腌制2 h,之后用蒸锅进行蒸制,水沸腾后开始计时,蒸制时间分别为3、6、9、12、15、18、21 min,分别得到蒸制黑鱼样品(Z-3、Z-6、Z-9、Z-12、Z-18、Z-21),装于自封袋中室温冷却15 min后检测,以未经处理的黑鱼背肉为对照组(RAW)。
1.3.2 样品的GC-IMS分析
参考方心如等[9]的方法,略作修改。
自动进样条件:准确称取2.0 g样品置于20 mL专用的顶空进样瓶中,设置孵育温度为60 ℃,孵化转速为500 r/min,孵育时间为15 min,采用顶空自动进样的方式,进样量为500 μL,进样针温度65 ℃,不分流模式进样。
GC条件:采用强极性色谱柱MXT-WAX(30 m×0.53 mm,1 μm),柱温60 ℃,载气为N2(≥99.999%),运行时间30 min,初始流速为2.0 mL/min,保持2 min;8 min内升至10 mL/min;10 min内升至100 mL/min并保持10 min。离子迁移谱检测温度为45 ℃,漂移气为N2。
1.3.3 电子鼻分析
参考YANG等[10]的方法并稍作修改,准确称取5 g切碎的鱼肉,加入20 mL质量分数18% NaCl溶液,匀浆后称2 g于10 mL电子鼻自动进样瓶中。
电子鼻条件:载气为干燥洁净的空气,流速为150 mL/min;样品温度60 ℃,孵育时间6 min。顶空产生参数:产生时间为500 s,搅动速率500 r/min。顶空注射参数:注射体积2 400 μL;注射速率2 400 μL/s。每组样品重复测定5次。
1.3.4 样品的感官评定
将处理好的样品置于一次性餐盒中,分别从滋味、气味、外观及口感4个方面进行感官评定。感官评定小组由20名(男性女性各10名)、20～30岁的食品专业人员组成。综合考虑后设计感官评定表见表1。
表1 蒸制过程中腌制黑鱼的感官评定标准
Table 1 Sensory evaluation criteria for pickled snakehead fish during steaming
感官评定指标(权重)评分标准分值/分滋味(30分)滋味鲜美,有鲜香味21～30滋味一般,略有腥味10～20滋味不可接受,腥味重0～9气味(30分)鱼块固有香气浓郁(如愉悦的熟鱼香气…)21～30鱼块固有香气淡,有一定不愉快气味(如油脂味,过熟味…)10～20无固有香气,有明显不愉快气味(如鱼腥味,泥土味…)0～9外观(20分)色泽均匀,肉富有光泽且呈白色,鱼块完整14～20色泽较均匀,肉有光泽但稍黄,鱼块较完整,有些许断裂7～13色泽不均匀,肉无光泽且泛黄,鱼块散碎0～6口感(20分)口感细腻,肉质柔嫩,软硬适中14～20口感较好,肉质较好,稍软或稍硬7～13口感差,肉质太硬或太软0～6
1.4 数据处理
利用SPSS 26软件进行数据方差分析,采用Duncan多重比较法进行显著性分析(P<0.05),数据结果以平均值±标准差表示。利用软件OriginPro 2021对分析结果进行绘图。利用GC-IMS仪器自带的Laboratory Analytical Viewer(LAV)分析软件,GC-IMS Library Search软件内置的NIST数据库和IMS数据库对挥发性成分进行定性分析。在https://hiplot.com.cn/网站上绘制聚类热图。
2 结果与分析
2.1 腌制黑鱼蒸制过程中挥发性成分的GC-IMS图谱分析
挥发性成分的二维谱图如图1所示。图1中1.0处红色竖线表示反应离子峰(reaction ion peak, RIP),每个位于RIP两侧的点都代表样品中的一种挥发性化合物,本研究在漂移时间0.9～1.6 ms和保留时间200～1 000 s内信号较多,说明该区域内有效的挥发性化合物较多。在二维谱图中,颜色表示每种物质的信号强度,红色表示高强度,蓝色表示低强度。由图1所示,选取黑鱼背肉生样的二维谱图作为参比,其余7个为样品(Z-3、Z-6、Z-9、Z-12、Z-15、Z-18和Z-21)扣除参比的谱图,扣除的背景为白色,红色表示挥发性成分含量高于参比,蓝色则表示挥发性成分含量低于参比,可以看出,Z-3、Z-6、Z-9、Z-12、Z-15、Z-18和Z-21的样品谱图中出现越来越多的红色斑点,这说明大部分挥发性成分的含量随蒸制时间延长而增加,这可能由于热加工会导致脂质氧化、氨基酸降解以及美拉德反应的发生[11]。
图1 蒸制过程中腌制黑鱼的二维谱图
Fig.1 2D-topographic plots of pickled snakehead fish during steaming
2.2 蒸制过程中腌制黑鱼挥发性成分分析
为了进一步分析比较腌制黑鱼背肉在蒸制过程中挥发性化合物的变化,利用GC×IMS Library Search软件内置的NIST数据库和IMS数据库进行二维定性分析。在电离区,单个化合物因浓度增大可能会产生的一个以上的信号(单体,二聚体甚至三聚体),因此本研究中出现一部分挥发性物质的二聚体[12-13]。电子版增强出版附表1(https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.038425)列出了GC-IMS数据库所定性出的挥发性组分,腌制黑鱼背肉蒸制过程中可明确定性的挥发性化合物有43种,鉴定出的挥发性化合物的碳链普遍集中在C3～C10之间,其中醛类(13)、醇类(14)、酮类(6)、酯类(5)、其他类(5)。
为了更清楚地显示每种挥发性化合物对样品整体风味的贡献,将每个样品中所有挥发性化合物的总浓度看成是100%,对每种挥发性化合物占总浓度的比例进行评估并绘制百分比堆积图如图2所示。由图中可知,在黑鱼生肉中,醛类、醇类、酮类物质是主要的风味物质,其中酮类物质含量最高,占总挥发性物质的31.59%,但大多酮类化合物阈值都偏高,对鱼肉风味的贡献不大。在蒸制过程中,醛类物质呈现先上升后下降的趋势,在12 min时达到最大含量(33.92%);醇类物质的相对含量从整个蒸制过程看是降低了,但在12 min后含量略微有所回升;在整个蒸制过程中,酮类物质逐步下降,酯类物质不断上升,这是由于蒸制温度升高,脂质氧化程度增大,使得游离脂肪酸增多,促进相关游离脂肪酸和醇的酯化[14]。从整体看,无论是生肉还是蒸制肉,醛类物质与醇类物质的总量均占总挥发性物质的56%以上,可见醛类物质与醇类物质对黑鱼风味起着重要作用,尤其是醛类物质阈值低,对黑鱼的挥发性风味贡献显著[15]。而黑鱼蒸制后酯类物质的增多,则赋予了蒸制黑鱼特有的熟肉风味,其他风味物质如呋喃、吡嗪赋予了蒸制黑鱼热加工独特的风味[16]。
图2 蒸制过程中腌制黑鱼挥发性组分分类占比
Fig.2 Classification proportion of volatile components in pickled snakehead fish during steaming
此外,通过Gallery Plot绘制的指纹图谱,揭示了腌制黑鱼背肉在蒸制过程中的挥发性成分的动态变化(图3)。点的颜色及面积表示物质含量的大小,点的颜色越深、面积越大反映离子流的信号越强,物质浓度越高,反之越低[17]。经过蒸制处理后的样品中挥发性成分的含量明显高于生样对照组。随着蒸制时间延长,黑鱼样品中大部分醛类、醇类、酮类和酯类等挥发性成分的种类和含量呈上升趋势,与方心如等[9]对于蒸制处理后的草鱼挥发性成分的研究结果一致。
图3 不同蒸制时间腌制黑鱼挥发性化合物的Gallery Plot图
Fig.3 Gallery Plot analysis of volatile compounds in pickled snakehead fish at different steaming time
2.2.1 醛类化合物
醛类化合物在蒸制黑鱼的挥发性风味物质中占主导地位,醛类物质主要来源于不饱和脂肪酸的氧化裂解或氨基酸的斯特勒克降解反应,由于他们显示出较低的气味阈值和独特的气味特征,故对黑鱼风味的形成具有重要贡献[18]。
由图3结合附表1可知,随着蒸制时间的延长,鱼肉中丙醛、丁醛、异丁醛、己醛、异戊醛、糠醛、2,4-癸二烯醛、(E)-2-戊烯醛、(E)-2-辛烯醛、(E)-2-庚烯醛的相对含量不同程度地增加。丁醛、异丁醛、(E)-2-戊烯醛的含量在12 min后趋于稳定,推测鱼肉在12 min时基本熟化,故这3种醛类含量不再增加。(E)-2-己烯醛(果香、脂肪香)的相对含量在整个蒸制过程中略有降低,3-甲基-2-丁烯醛的含量在生肉中最高,随着蒸制时间的延长不断降低,可能是黑鱼生肉的气味化合物,类似的2-稀醛还被鉴定为鳟鱼[19]等的主要气味化合物。有研究表明,己醛主要是来自于亚油酸的氧化,亚油酸在自动氧化作用下产生了亚油酸的13-氢过氧化物,13-氢过氧化物断裂生成己醛[20],己醛在适宜浓度下呈现青草味、鱼腥味,常与C8、C9的挥发性羰基化合物混合一起共同对鱼肉的香味做贡献[21]。戊醛是鱼类植物香、脂肪香的来源之一,与ω-3脂肪酸的氧化有关[22]。异戊醛来源于氨基酸的斯特勒克反应,具有巧克力香味[23]。烯醛类可能是由多不饱和脂肪酸如亚麻酸、亚油酸和花生四烯酸氧化形成的氢过氧化物裂解形成[18],有报道称,(E)-2-辛烯醛、(E)-2-庚烯醛、(E)-2-己烯醛等单烯醛化合物阈值较低,呈现出果香、青香和明显的脂肪香气[21],对鱼肉风味均有重要贡献;2,4-癸二烯醛(脂肪味)来自ω-多不饱和脂肪酸自动氧化而生成的羰基化合物[24],赵亮等[25]采用SDE-GC-MS检测发现2,4-癸二稀醛是南湾鳙鱼的主要挥发性物质之一;糠醛主要是热处理后美拉德反应的产物,呈现烧烤味和焦糖味[26]。这些醛类的气味阈值较低,对蒸制后黑鱼风味的形成贡献较大。
2.2.2 醇类化合物
醇类物质一般由脂肪经氧化分解生成或由羰基化合物还原得到,具有独特的芳香、水果香等令人愉悦的风味。大部分饱和醇及短链醇的气味阈值较高,对鱼肉气味贡献较小;不饱和醇阈值相对较低,对鱼肉整体气味贡献相对较大[27]。
随着蒸制时间的延长,丙醇、丁醇、辛醇、3-戊醇、2-己醇、1-辛烯-3-醇、(Z)-2-戊烯醇、2-甲基丁醇、2-丁氧基乙醇等醇类的相对含量不断增加。丁醇、2-甲基丁醇在蒸制12 min后趋于稳定;辛醇在15 min时达到最大值,辛醇具有柑橘、玫瑰的气味,可作为蒸制15 min的特征风味物质;而乙醇、3-甲基戊醇、3-甲基-3-丁烯醇、(Z)-3-己烯醇的相对含量随着蒸制时间的延长而不断降低。戊醇(果香味)在生肉中含量较多,蒸制过程中含量极低,故其是黑鱼生肉潜在的特征风味物质。有研究认为,1-辛烯-3-醇具有典型的蘑菇味和清香,与花生四烯酸、亚油酸的氧化有关[28],1-辛烯-3-醇广泛存在于淡水鱼和海水鱼的挥发性气味中。(Z)-2-戊烯醇则有青香、橡皮的气味[29]。
2.2.3 酮类化合物
酮类物质一般是由多不饱和脂肪酸受热氧化、氨基酸降解或美拉德反应产生,多呈现桉叶味、脂肪味和焦燃味,一般阈值较高,对鱼肉整体的风味贡献较小[30-31];但有研究报道,酮类对消减腥味有一定的贡献,故酮类物质可能对鱼肉风味起到一定的修饰作用[32]。
在本研究中,黑鱼在100 ℃的高温蒸制下,2-丁酮、2-己酮、2-辛酮、2-壬酮的含量逐渐增加,其中2-丁酮的相对含量在12 min时达到最大值,可视其为12 min的特征风味物质;而4-甲基-3-戊烯-2-酮的相对含量却逐渐降低;相较于生肉,在蒸制过程中2,3-丁二酮的相对含量变化不大,有报道称2,3-丁二酮被认为是美拉德反应初级阶段的产物,呈现奶香味、焦糖味[23]。有研究表明,2-丁酮可通过脂肪氧化和美拉德反应产生,呈现为奶油味和蘑菇味,可能与鱼肉的脂肪味和肉味更为相关[6,17]。
2.2.4 酯类化合物
酯类化合物通常是脂质代谢产生的羧酸和醇的酯化产物,酯类阈值较低,对鱼类的肉味特性有很大贡献[33]。
在整个蒸制过程中,鱼肉中的酯类化合物(乙酸乙酯、乙酸己酯、戊酸乙酯、己酸乙酯、丁烯酸乙酯)均呈现不断上升的趋势,其中乙酸己酯、丁烯酸乙酯在黑鱼生肉的挥发性气味中基本不存在,二者在蒸制过程中才出现并且含量不断增加。蒸制使鱼肉熟化的同时,也使鱼肉中的果香气味减弱而油脂气味有所增强。酯类化合物对鱼肉整体香气的贡献受其链长的影响,由短链脂肪酸形成的酯具有水果香气,而由长链脂肪酸形成的酯具有脂肪香气[34],如有报道称,乙酸乙酯给人一种令人愉快的空灵的、水果般的香气[35]。
2.2.5 其他挥发性化合物
随着蒸制时间的延长,α-蒎烯、2,5-二甲基呋喃的相对含量不断上升;2,5-二甲基吡嗪、四氢呋喃呈先上升后下降的趋势,二者的相对含量均在12 min达到最大值,可作为12 min的特征风味物质;2-甲基丁酸在生肉中的含量较高,蒸制过后含量极低,是黑鱼生肉潜在的风味物质。GUO等[34]发现吡嗪类化合物具有烤肉味,一般由美拉德反应产生。呋喃类主要由美拉德反应和斯特勒克降解反应产生,具有焦糖味、甜味和烘焙风味[35]。这些杂环类化合物阈值较低,对黑鱼的整体风味有很大影响。
2.3 电子鼻结果分析
FOX-4000电子鼻包含18个传感器,不同的传感器对挥发性气味的检测范围也不同。图4为传感器对蒸制黑鱼气味感应后的响应值所作出的雷达图,电子鼻要求传感器对待测样品的最大响应值大于0.5,本次实验的所有样品均达到了检测要求。
图4 腌制黑鱼在不同蒸制时间的电子鼻雷达图
Fig.4 E-nose radar image of pickled snakehead fish at different steaming time
通过雷达图可以直观地看出电子鼻对腌制黑鱼蒸制过程中气味响应的差异。蒸制样品在T40/2、P30/2、P30/1、PA/2、T70/2、P40/1、P10/2和T30/1这8个传感器中的信号响应值较高,这8个传感器检测的气体范围主要是醛类、醇类、碳氧化合物、烃类、氨类、极性有机化合物等,而在其他传感器中的信号响应值很低,由此说明蒸制黑鱼样品中含有丰富的醛类、醇类、碳氧化合物、烃类、极性有机化合物等挥发性物质。并且蒸制时间不同,检测出的响应值亦有差异,说明腌制黑鱼在蒸制过程中挥发性成分的相对含量有很大变化,特别是生肉与蒸制肉之间的挥发性成分含量变化显著,在雷达图中,蒸制黑鱼样品的气味强度依次递减排列为:Z-12>Z-15>Z-18>Z-21>Z-9>Z-6>Z-3>RAW。
聚类热图是在聚合大量实验数据的基础上,将数据进行聚类分析,以一种渐变色带的形式直观地将结果展现出来。本实验以电子鼻18个传感器的检测响应值为行,8组样品为列,行、列的距离度量均为欧式距离,从而得到聚类热图(图5)。图中色带由蓝到红,响应值则由低变高,颜色越蓝,响应值越低,颜色越红,响应值越高。由热图可知,8组样品聚为两大类:生肉样品与蒸制样品,对于生肉组,电子鼻传感器的响应值最低,可见黑鱼生肉的挥发性气味比较弱。相较于生肉,蒸制黑鱼在PA/2、P30/2、P40/1、P40/2、T70/2、P10/2、T40/2、T30/1、P30/1这9个传感器的响应值有显著提高,说明在蒸制过程中,黑鱼肉质由生变熟的同时发生了复杂的化学反应(脂肪氧化、蛋白质降解、美拉德反应、斯特勒克降解等),从而促进挥发性风味的形成;蒸制黑鱼在其他传感器的响应值与黑鱼生肉相似。在所有的蒸制样品中,又可聚为三类:Z-12、Z-15为一类,Z-9、Z-18、Z-21为一类,Z-3、Z-6为一类,Z-12、Z-15组的所有电子鼻传感器响应值均最高,由此可知,腌制黑鱼在蒸制12～15 min时的挥发性气味最大,并且由热图渐变色带可以看出,Z-12在T70/2、P10/2、T40/2的响应值略高于Z-15。此外,由聚类热图还可以看出,Z-9、Z-18、Z-21组在T70/2、P10/2、T40/2、T30/1、P30/1这5个传感器的响应值显著高于Z-3、Z-6组。
图5 不同蒸制时间的腌制黑鱼挥发性气味的聚类热图
Fig.5 Cluster heatmap of volatile odors in pickled snakehead fish at different steaming time
2.4 腌制黑鱼在蒸制过程中的感官评分分析
图6显示了蒸制过程中腌制黑鱼感官评分的变化趋势。从总得分可以看出,在蒸制0～12 min时,黑鱼的感官评价结果变化显著(P<0.05),得分上升较快,12 min后得分略微下降;在挥发性气味方面,黑鱼在蒸制过程中的感官评分呈现先上升后下降的趋势,在蒸制12 min时评分最高;在滋味方面,蒸制前期黑鱼的感官评分显著上升(P<0.05),在12 min时达到最高,12 min后评分缓慢下降;在外观方面,腌制黑鱼在蒸制过程中的评分结果无显著性差异(P>0.05);在口感方面,腌制黑鱼在蒸制15 min时最佳,但12 min的口感得分与15 min的口感得分无显著性差异(P>0.05)。综上得出,腌制黑鱼在蒸制12 min时的感官评分结果较好,结合GC-IMS与电子鼻的分析结果可以得出,腌制黑鱼在蒸制12 min时整体风味最佳,这一研究结果与LI等[36]对热加工鲟鱼的研究结论一致。
图6 蒸制过程中腌制黑鱼的感官评分图
Fig.6 Sensory scores of pickled snakehead fish meat during steaming
注:不同小写字母代表差异显著,P<0.05。
3 结论
通过HS-GC-IMS结合电子鼻及感官评定对腌制黑鱼背肉在蒸制过程中挥发性风味的变化进行了分析。结果表明,在蒸制黑鱼样品中共鉴定出43种挥发性成分,醛类、醇类化合物的含量最高,占主导地位,其中醛类物质阈值低,是蒸制黑鱼的主要呈味物质,并于蒸制12 min时在所有挥发性风味物质中占比最高,达到33.92%;其次是酮类和酯类。蒸制处理会促进脂肪氧化裂解,使得游离脂肪酸增多,进而促进相关游离脂肪酸和醇类的酯化,使得酯类的相对含量在整个蒸制过程不断升高;亦会促进美拉德反应等,从而使得呋喃、吡嗪等杂环类化合物的含量升高,为蒸制黑鱼贡献熟肉独有的风味。电子鼻的聚类热图分析结果表明,蒸制黑鱼样品可聚为三类:Z-12、Z-15为一类,Z-9、Z-18、Z-21为一类,Z-3、Z-6为一类,Z-12、Z-15组的所有电子鼻传感器响应值均最高,并且Z-12在T70/2、P10/2、T40/2这3个传感器的响应值略高于Z-15。此外,腌制黑鱼在蒸制12 min时的感官评定结果最好。GC-IMS结合电子鼻以及感官评定得出,蒸制12 min时腌制黑鱼背肉的整体风味最佳,丁醛、异丁醛、(E)-2-戊烯醛、丁醇、2-甲基丁醇、2-丁酮、2,5-二甲基吡嗪、四氢呋喃在蒸制12 min时相对含量最高,是腌制黑鱼在蒸制12 min的特征风味物质。然而,由于风味的形成过程十分复杂,这些风味物质在黑鱼蒸制过程中的具体变化机制还需要进一步探讨。
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