植物种子经过压榨、浸提等工艺后得到的原油被称为毛油,其主要成分为三酰基甘油。毛油中所含的杂质主要有磷脂、脂肪酸、糖类、色素等。除去毛油中杂质的过程称为精炼,主要包括脱胶、脱酸、脱色、脱臭等工序[1-4]。油脂脱胶不仅是油脂精炼的第1步,也是油脂精炼过程的关键步骤。油脂精炼对脱胶油的磷脂含量要求严格(≤10 mg/kg),油脂脱胶不达标,不仅会影响后续油脂加工效果,还会影响成品油的贮存稳定性和烹饪风味[5]。传统的脱胶方法有水化脱胶、酸法脱胶等[6-8]。与传统脱胶方法相比,酶法脱胶是一种新型的植物油脂脱胶工艺,具有脱胶完全、用水量和废水排放量少、耗能低、精炼得率高等经济环保优点[9-12]。磷脂酶是酶法脱胶技术中的主要用酶,但现有磷脂酶资源在底物选择性、温度稳定性等方面难以满足工业脱胶工艺的要求,限制了磷脂酶在工业脱胶中的大规模应用。因此,开发适用于油脂酶法脱胶的新型酶源具有十分重要的意义[13]。
研究表明,来自疏棉状嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosus)的脂肪酶LipTL具有水解磷脂的功能[14-16]。本研究通过大肠杆菌(Escherichia coli)构建LipTL的重组工程菌,对LipTL进行异源表达,探究重组酶的酶学性质,并研究该脂肪酶在油脂脱胶中的应用潜能。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 主要菌株与质粒
T.lanuginosus、E. coli菌株[E.coli BL21-CodonPlus(DE3)]、质粒(pET-28a)均由本实验室保存。
1.1.2 主要试剂
4-硝基苯基乙酸酯(4-nitrophenyl acetate, C2)、4-硝基苯基丁酸酯(4-nitrophenyl butyrate, C4)、4-硝基苯基辛酸酯(4-nitrophenyl octanoate, C8)、4-硝基苯基癸酸酯(4-nitrophenyl decanoate, C10)、4-硝基苯基月桂酸酯(4-nitrophenyl laurate, C12)、4-硝基苯肉豆蔻酸酯(4-nitrophenyl myristate, C14)、4-硝基苯棕榈酸酯(4-nitrophenyl palmitate, C16),西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司;对硝基苯酚(p-nitrophenol, PNP)、卡那霉素、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactoside,IPTG),生工生物工程(上海)股份有限公司;大豆油、花生油,金太阳粮油股份有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 脂肪酶LipTL生物信息学分析
通过ClustalW2软件,将脂肪酶LipTL与其同源蛋白一级氨基酸序列进行同源性比对分析;通过SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org)同源建模获得脂肪酶LipTL的三级结构,并利用Pymol(https://pymol.org)显示LipTL的空间结构。
1.2.2 重组质粒的转化
将E. coli BL21-CodonPlus(DE3)感受态细胞置于冰上融化10 min,取1 μL重组质粒加入到50 μL感受态细胞中,混匀后于冰上静置30 min。然后混合物于42 ℃条件下热激45 s后迅速冰浴2 min。加入500 μL新鲜LB培养基混匀后于37 ℃摇床中200 r/min培养55 min。然后,取100 μL培养液涂布于含有50 mg/mL卡那霉素的LB固体培养基上,于37 ℃培养箱培养8 h。
1.2.3 重组蛋白的表达和纯化
挑取平板上的单菌落,接种于30 mL含卡那霉素(终质量浓度为50 μg/mL)的LB液体培养基中,于37 ℃摇床(180 r/min)中振荡培养12 h进行活化。然后按2%(体积分数)的比例将活化菌种转接至300 mL含卡那霉素的LB培养基中,于37 ℃摇床(180 r/min)培养至菌体OD600值达到0.6～0.8,加入IPTG(终浓度为0.8 mmol/L)后于20 ℃摇床(150 r/min)培养8 h。
培养结束后,于4 ℃、8 000 r/min条件下离心20 min收集菌体。将菌体悬浮于缓冲液(50 mmol/L Tris-HCl,pH值为8.0,50 mmol/L NaCl)中,于冰上超声波破碎10 min。将细胞破碎液于4 ℃,12 000 r/min离心20 min后,保留上清液(粗酶液)。然后利用Ni-NTA亲和层析柱对粗酶液进行纯化。粗酶液上样后,分别用含30、60、100、200 mmol/L咪唑的缓冲液(20 mmol/L Tris-HCl,pH值为7.4)进行洗脱,按每1 mL流出液进行分管收集,并保存于4 ℃备用。纯化后的各组分利用SDS-PAGE进行分析。所获得的纯化重组酶用考马斯亮蓝法测定其蛋白质浓度[17-18]。
1.2.4 脂肪酶LipTL酶活性检测
利用酶标仪测定LipTL活性。反应体系为:1 mmol/L对硝基苯酚酯底物、纯化酶液、50 mmol/L甘氨酸-氢氧化钠缓冲液 (pH值为9.0),于55 ℃条件下反应5 min,加入体积分数95%乙醇终止反应后,测定OD405值。脂肪酶酶活力单位(U)为:1 min催化生成1 μmol对硝基苯酚所需的酶量[1]。
1.2.5 脂肪酶LipTL酶学性质研究
1.2.5.1 底物特异性测定
分别配制1 mmol/L不同碳链长度的对硝基苯酚酯作为反应底物。反应体系见1.2.4节。反应体系在55 ℃条件下预处理3 min,然后加入纯化的LipTL,反应5 min。反应结束后,迅速冰浴并测定OD405值。根据LipTL对不同碳链长度的对硝基苯酚酯催化活性确定其底物特异性。
1.2.5.2 最适pH测定
以1 mmol/L 4-硝基苯棕榈酸酯为底物,用不同pH的缓冲液配制反应体系,反应体系见1.2.4节。测定LipTL在最适温度(55 ℃)条件下,酶活性随pH值的变化曲线。所用缓冲液有:磷酸盐缓冲液(50 mmol/L,pH值为6.0、6.5、7.0、7.5、8.0)、Tris-HCl缓冲液(50 mmol/L, pH值为8.5)、甘氨酸-氢氧化钠缓冲液(50 mmol/L, pH值为9.0、9.5、10.0、10.5)[1]。
1.2.5.3 最适温度和温度稳定性测定
以1 mmol/L 4-硝基苯棕榈酸酯为底物,甘氨酸-氢氧化钠 (50 mmol/L,pH值为9.0) 为缓冲体系,将反应体系分别置于30、35、40、45、50、55、60、65、70、75 ℃水浴锅中预热10 min,加入重组LipTL反应5 min后终止反应,测定OD405值。
将重组LipTL分别于45、55、65 ℃水浴锅中,然后每隔30 min在最适温度和最适pH条件下测定重组LipTL热处理后的残余活力。将最适反应温度下的相对酶活力大小定义为100%。
1.2.5.4 LipTL反应动力学参数测定
在最适温度和最适pH条件下,测定不同底物浓度下LipTL的酶活力大小,然后利用Linewear-Burk双倒数作图法,计算LipTL的动力学常数Km和Kcat。对硝基苯酚酯底物溶液浓度分别为0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.8、1、2、3、4、5 mmol/L。
1.2.5.5 金属离子对酶活性的影响
配制浓度为10 mmol/L的不同金属盐(MnCl2、ZnCl2、MgCl2、CaCl2、CoCl2、FeSO4、CuSO4、NiSO4)溶液。在反应体系中分别加入不同的金属离子溶液,在最适温度(55 ℃)和最适pH(9.0)条件下,测定LipTL的酶活性。将未添加金属离子条件下的酶活力大小定义为100%,计算LipTL在金属离子存在条件下的相对酶活力。
1.2.5.6 有机溶剂对酶活性的影响
为了测定有机溶剂对脂肪酶LipTL的影响,脂肪酶预先在不含底物的反应体系中,用终浓度为5%、20%和40%(体积分数)的有机溶剂于4 ℃下孵育 2 h,然后加入最适底物,在最适温度和最适pH条件下,测定脂肪酶的残余活力。本实验中添加的有机物见表1。
表1 有机溶剂对LipTL活性的影响
Table 1 Effect of organic solvents on LipTL
有机溶剂Log P相对酶活力5%(体积分数)20%(体积分数)40%(体积分数)对照100±0.75100±1.34100±1.98正己烷 3.595.47±2.0382.78±2.1471.75±0.79二甲基亚砜-1.35108.25±1.65113.48±2.09109.34±2.35乙腈-0.3398.53±0.9845.23±0.795.87±1.45甲醇-0.7696.25±1.4583.56±2.3513.73±1.24乙醇-0.24103.18±1.6387.64±2.098.96±2.34丙三醇-1.7693.65±0.9789.38±2.0789.45±1.48甲苯2.7395.47±1.4669.35±1.7873.48±0.79
1.2.6 LipTL的脱胶性能测定
取100 g大豆毛油于250 mL密封的锥形瓶中,水浴加热至70 ℃,加入0.1 mL 450 g/L柠檬酸溶液,在10 000 r/min条件下均质 1 min。然后在70 ℃、200 r/min条件下孵育20 min。加入NaOH溶液(0.1 mmol/L) 调节pH值至5.0,200 r/min振荡5 min 后,加入2 mL去离子水和1 mL纯化后的脂肪酶LipTL (286.96 U/mg),于5 000 r/min条件下均质1 min进行乳化。酶脱胶过程在55 ℃、200 r/min条件下进行。对照组不添加酶液,其他反应条件相同。反应结束后,进行磷含量和脂肪酸含量的测定。磷含量的测定根据GB/T 5537—2008《粮油检测 磷脂含量的测定》中的钼蓝比色法进行测定。脂肪酸的含量根据AOCS Ca 5a-40(美国油脂化学家协会AOCS, 1997)方法进行测定[1]。
1.3 数据分析
所有试验均重复3次,试验数据采用Exce1 2016进行整理,均以“平均值±标准差”表示,并利用Origin 2019软件进行图表绘制。
2 结果与分析
2.1 脂肪酶LipTL的多序列比对
通过ClustalW2软件,将脂肪酶LipTL与其同源蛋白的氨基酸序列进行比对分析。如图1所示,脂肪酶LipTL与脂肪酶5AP9(结构已被解析)的序列一致性高,表明LipTL与5AP9在空间结构上具有高度的相似性,且脂肪酶5AP9的晶体结构为脂肪酶的开放构型,因此选择5AP9进行同源建模。根据脂肪酶5AP9的晶体结构(图2)可知,81～96位的序列组成了LipTL的“盖子”结构,Ser146、Asp201和His258形成的催化三联体构成了LipTL的催化中心。Ser146位于β6折叠片之后、α5螺旋之前,形成的β转角-α螺旋结构称之为亲核肘,Asp201位于β8折叠片后,His258位于最后一个β折叠片后,其催化三联体结构与丝氨酸蛋白酶家族类似,即脂肪酶LipTL属一类丝氨酸水解酶。
表2 脂肪酶LipTL对不同p-NPP底物的动力学参数
Table 2 Kinetic parameters of LipTL towards different
p-NPP substrates
底物Km/(mmol/L)kcat/(s-1)kcat/Km/[L/(s·mol)]pNP-C21.824±0.0500.103±0.01556.469pNP-C41.617±0.0260.078±0.01948.237pNP-C81.386±0.0930.118±0.02085.137pNP-C100.983±0.1620.023±0.05623.398pNP-C120.615±0.1530.102±0.014165.854pNP-C140.826±0.0720.086±0.013104.116pNP-C160.472±0.0180.052±0.001110.169
图1 脂肪酶LipTL与同源蛋白的氨基酸序列比对
Fig.1 Amino acid sequence alignment of LipTL with homologous proteins
注:红色表示在该位置有相同的氨基酸。
图2 LipTL的模拟结构图
Fig.2 The model diagram of LipTL
注:红色棒状模型为LipTL的催化三联体(S146-D201-H258)。
2.2 重组LipTL的表达与纯化
将重组质粒转入E.coli BL21 CodonPlus(DE3),构建表达菌株BL21/LipTL。重组菌株经诱导表达后,对诱导细胞进行破碎处理,分别取破碎液和粗酶液(破碎液离心后的上清液)进行SDS-PAGE分析。由图3可知,LipTL可在大肠杆菌BL21菌株中表达,且可溶性表达成分较高,分子质量约为30 kDa。Ni-NTA柱对重组LipTL的纯化结果如图3所示。可见,利用200 mmol/L的咪唑缓冲液能收集得到较纯的重组LipTL蛋白。
M-蛋白Marker;1-全蛋白;2-粗蛋白;3～8-镍柱亲和
层析纯化的重组LipTL
图3 纯化重组LipTL的SDS-PAGE分析
Fig.3 SDS-PAGE analysis of the purified recombinant LipTL
2.3 重组LipTL的最适温度、温度稳定性和最适pH
温度对LipTL酶活性的影响如图4-a所示。当温度在30 ～55 ℃,随着温度的升高活化分子数增加,LipTL的酶活逐渐上升;当温度为55 ℃时,酶活性达到最大值;当温度高于65 ℃时,酶活性下降较快。上述结果表明,LipTL的最适温度为55 ℃,温度对LipTL的影响较大,可能是温度过高导致酶的结构发生改变,导致酶逐渐变性,酶活降低[18]。
a-最适温度;b-最适pH;c-热稳定性
图4 温度和pH对酶活性的影响
Fig.4 Effect of temperature and pH on enzyme activity
由图4-c可知,LipTL在最适反应温度55 ℃处理120 min,仍能保持90%以上的酶活性;当在65 ℃条件下处理60 min后,残余活力仍在50%以上,这些数据表明,LipTL具有较强的温度稳定性。在油脂脱胶过程中,油脂与胶质分离所需的温度较高,因此,温度稳定性较强的酶在脱胶过程中的应用潜力更大。
通常,缓冲液的pH会通过影响底物的解离、酶分子活性部位上有关基团的解离从而影响酶活性。pH对LipTL的影响如图4-b。当pH值在6.0～7.5时,随着pH的升高,酶活逐渐上升,但较为缓慢;当pH值在7.5～9.0时,酶活力迅速增加,且在pH 9.0时达到最大,当pH值在 9.0～10.5时,酶活力降低,说明脂肪酶LipTL的最适pH值为9.0。此外,在pH 8.0～10.0时,LipTL酶活力保持在70%以上,具有较宽泛的pH适用范围。
2.4 金属离子对LipTL活性的影响
如图5所示,Ca2+、Mg2+、Mn2+对酶活具有明显的激活作用,LipTL酶活力分别提高了31.62%、20.61%、11.22%;Zn2+、Fe2+、Cu2+、Co2+和Ni2+对酶活具有明显抑制作用,相对酶活力分别降至原来的62.01%、80.62%、25.32%、32.63%、70.82%。文献报道重金属离子作为亲电试剂可能与脂肪酶中的氨基酸残基发生电荷相互作用,改变其构象,从而影响脂肪酶的活性[19-20]。上述结果说明该酶活性会受到金属离子的影响,Ca2+、Mg2+、Mn2+可以作为酶的激活剂。
图5 金属离子对酶活性的影响
Fig.5 Effect of metal ions on enzyme activity
2.5 有机溶剂对LipTL活性的影响
研究纯化的脂肪酶LipTL对某些不同类型的溶剂(极性和非极性)的耐受性,如表1所示,当有机溶剂的体积分数为5%时,LipTL的相对酶活力均高于90%;当有机溶剂体积分数为20%时,除乙腈外,LipTL在其他溶剂中的活性均>69%。在有机溶剂体积分数为40%时,LipTL在甲醇、乙腈和乙醇中孵育2 h后的残余活性仅为13.73%、5.87%和8.96%。然而,当LipTL在体积分数40%的正己烷、二甲基亚砜、丙三醇和甲苯中表现出较高的耐受性,保留了初始活性的71%～109%。
2.6 脂肪酶LipTL的底物特异性及动力学参数
脂肪酶特殊的底物特异性很大程度上决定了其在工业化中应用的领域。如图6所示,脂肪酶 LipTL 偏好于中长链 (C12～C16) 的底物,最适底物为对硝基苯基棕榈酸酯(pNP-C16)。由表2可知,LipTL对中长链对硝基苯基酯(C12-C16)的催化效率指数(kcat/Km)较高,其中,对对硝基苯基月桂酸酯(pNP-C12)的催化效率指数最高,为165.854[L/(s·mol)]。LipTL对中长链底物具有较高的亲和力,能够特异性地水解生成大量的中链脂肪酸。由于中链脂肪酸独特的生理生化功能,常应用于医药、保健食用油及养殖业等领域,因而LipTL在中链脂肪酸的工业化生产中具有潜在应用价值。
图6 脂肪酶LipTL的底物特异性
Fig.6 Substrate specificity of LipTL
2.7 脂肪酶LipTL的脱胶效果
将LipTL酶加入到经柠檬酸、NaOH及去离子水处理后的油样中,脱胶反应6 h后,大豆油和花生油的残磷量分别降至5.2、4.9 mg/kg,大豆油和花生油的残磷量均降至10 mg/kg以下,满足工业脱胶油对磷脂含量的要求(图7)。对脱胶油进行脂肪酸FFAs含量测定,结果如图所示,经LipTL酶脱胶处理过的大豆油和花生油,FFAs含量约增加0.05%～0.08%。报道称,酶法脱胶过程中,残磷量降至100 mg/kg时,FFAs含量将增加约0.2%,本实验发现FFAs含量的增加与磷含量的下降(约25.6～43.8 mg/kg)相对应,说明FFAs含量的增加是磷脂被酶水解的结果[21]。以上结果表明,脂肪酶LipTL是一种于适用植物油脱胶的工具酶。
a-脱胶油残磷量;b-大豆脱胶油脂肪酸含量;c-花生脱胶油脂肪酸含量
图7 脂肪酶LipTL脱胶效果
Fig.7 Degumming effect of LipTL
3 结论
本文利用E. coli构建了T. lanuginosus脂肪酶LipTL的重组工程菌,实现了LipTL在E. coli的可溶表达,获得了重组酶LipTL。SDS-PAGE揭示其分子质量约为30.0 kDa。酶学性质研究表明,LipTL的最适温度为55 ℃、最适pH为9.0,且在最适温度下处理2 h,仍能维持90%以上活性。在脱胶应用中,LipTL能在6 h内将大豆油、花生油的残磷量分别降至为5.2 mg/kg和4.9 mg/kg。本研究证实LipTL可用于植物油脱胶,不仅为酶法脱胶提供了新的酶源,也为LipTL的后续分子改造研究提供理论基础。
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