茶叶不同添加方式对太平猴魁绿茶啤酒风味影响

啤酒是一种具有悠久发展历史并且受消费者青睐的低酒精饮料,它的风味是由酒体中挥发性和非挥发性化合物共同作用形成的结果[1]。而啤酒中的挥发性化合物主要有醇类、酯类、萜烯类和醛类等物质,这类物质主要来源于麦芽、啤酒花以及酵母代谢[2]。除此之外,酿酒师会添加各种辅料去直接影响成品酒的风味特征,如水果、香辛料、茶叶等。

绿茶是我国生产量和消费量最大的茶类,它具有丰富的多酚、咖啡因、有机酸以及多种挥发性化合物[3-4]。目前,绿茶中的挥发性化合物已有大约260种被分离和鉴定出来,它的挥发性化合物种类繁多,主要包括醇类、酯类、醛类、酸类、烯烃类以及酮类等化合物[5-6]。这类挥发性化合物能表现出坚果、花香、果香、爆米花香气和绿色青草香等香气属性。太平猴魁作为中国最著名的绿茶之一,具有丰富的芳樟醇、香叶醇、壬醛、β-紫罗酮和月桂烯等香气成分,并且高品质的太平猴魁含有(Z)-表茉莉酸甲酯,它具有兰花般的香气特征[7-9]。因此,选用太平猴魁作为辅料是增添啤酒风味特征的良好策略。然而,绿茶的有效物质浸出率与冲泡温度有关。S width=11,height=17,dpi=110

NCHEZ-L

PEZ等[10]用不同温度浸泡茶叶,得到在80 ℃冲泡5 min条件下风味化合物中的二甲基硫化物含量最高,为35.5 ppbv。ZHAO等[11]对罗布麻茶(apocynum venetum)采用不同温度进行冲泡,在热冲泡条件下检测到33种香气化合物、在室温冲泡和冷冲泡条件下检测到22种和12种香气化合物。这表明不同的茶冲泡温度对绿茶风味成分的浸出具有显著的影响。在啤酒酿造过程中,麦汁糖化、发酵时的温度会影响到绿茶风味物质的有效浸出,进而影响茶啤酒的风味。胡重庆[12]在啤酒主酵前添加9 ℃浸提的绿茶茶汤,发现啤酒的风味稳定系数提高了将近5倍。陈硕[13]在麦汁煮沸结束后添加80 ℃热水提取的绿茶萃取液,对发酵得到的成品啤酒进行GC-MS分析,发现橙花叔醇(2.80%)和苯甲酸乙酯(2.63%)等风味物质仅存在于绿茶啤酒中。因此,在绿茶啤酒酿造时,绿茶的添加方式对啤酒的风味具有非常重要的影响。

目前,随着精酿啤酒行业的兴起,茶叶开始被引入到啤酒的发酵中以丰富啤酒品种的多样性。而茶叶的不同添加方式使得茶啤酒的风味具有较大的差异,不恰当的添加方式可能导致啤酒出现口感苦涩、茶香寡淡等问题。因此,为了提高绿茶在啤酒中的风味特征,本文将太平猴魁作为研究对象,将茶叶以热萃(麦汁煮沸结束投料)、混合(麦汁煮沸结束和后酵开始时分步投料)和冷萃(后酵开始时投料)的方式加入到啤酒的发酵中,通过GC-MS技术,对不同组茶啤酒挥发性成分及其含量进行分析,并结合香味活性值(odor activity values, OAV)筛选以及偏最小二乘-判别分析(partial least squares-discriminant analysis, PLS-DA)出不同工艺下茶啤酒香气的差异。本研究通过确定绿茶不同添加方式对啤酒的风味差异,以优化啤酒中不同类别风味组分,这将对不同风味绿茶啤酒发酵工艺提供有效的数据支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

太平猴魁,安徽天徽茶叶有限公司;大麦麦芽为麦特卡夫麦芽,江苏省农垦麦芽有限公司;卡斯卡特酒花、马格鲁门酒花,美国雅基玛联合酒花有限公司;啤酒酵母S189,威海德科生物科技有限公司;NaCl,国药集团化学试剂有限公司;2-辛醇,美国Sigma公司;C7～C30正构烷烃混合物(99%),国药控股化学试剂北京有限公司。

1.2 仪器与设备

GC-MS,美国赛默飞世尔科技公司;YQ-PJ-6B型自动糖化仪,轻工业部西安轻机所光电公司;恒温恒湿培养箱,上海一恒科学仪器有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 啤酒样品制备

准确称取100 g大麦麦芽粉,以1∶3.5料水比(g/mL)注入糖化仪并进行糖化,过滤洗糟得麦汁,将麦汁煮沸60 min,投入0.8 g/L的酒花,过滤并控制定型麦汁浓度在10 °Brix。在冷却后的麦汁中接入浓度为1×107 CFU/mL的Lager酵母(S189),待日失重<0.2 g时发酵结束,置于4 ℃冰箱后酵7 d,过滤得成品啤酒。对照组:不添加太平猴魁;热萃组:在麦汁煮沸结束加入6 g/L的太平猴魁;混合组:在麦汁煮沸结束加入3 g/L,后酵开始时添加3 g/L的太平猴魁;冷萃组:在后酵开始时添加6 g/L的太平猴魁。太平猴魁绿茶样品均在紫外条件下照射1 h灭菌处理。

工艺流程图如图1所示:

1.3.2 啤酒GC-MS分析

啤酒挥发性香气成分通过采用顶空固相微萃取-气相色谱/质谱法(headspace solid-phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry, HS-SPME-GC-MS)分析[14]。量取8 mL啤酒样品和2.0 g NaCl固体放入20 mL顶空瓶中,加入200 μg/L的2-辛醇作为内标。使用50 μm/30 μm CAR/DVB/PDMS 的固相微萃取(solid-phase microextraction,SPME)纤维萃取头提取风味化合物。样品在55 ℃下孵育15 min,萃取吸附30 min。萃取结束后,将萃取头迅速插入GC入口,在250 ℃下解吸0.5 min。使用GC-MS来鉴定样品的挥发性物质。毛细管柱为TG-WAXA柱(60 m×0.25 mm×0.25 μm)。GC温度程序设置如下:初始温度为40 ℃,首先以3 ℃/min的速度增加到180 ℃,然后以20 ℃/min的速度增加到230 ℃并保持15 min。检测器的温度为250 ℃,载气为氦气(99.999%),流速为1.2 mL/min。质量选择探测器的离子源温度为260 ℃,电子电离能为70 eV。通过监测m/z在20～450范围内的总离子电流来记录色谱图。将实验质谱与NIST 14.0数据库进行比较并通过正构烷烃(C7～C30)对化合物进行定性,采用内标法进行相对定量计算。

1.3.3 啤酒基本理化性质测定

将啤酒样品过滤,超声波5 min除气备用,啤酒酒精度、真正浓度、发酵度、pH和总酸等基本指标参照GB/T 4928—2008《啤酒分析方法》、GB 5009.3—2016《食品安全国家标准》中的相关方法测定。

1.4 数据处理

实验谱图均采用Origin软件绘图,采用SIMCA 4.1对多变量进行PLS-DA。文章中提供的数据是“平均值±标准差”,所有的测试至少进行3个平行,实验数据通过SPSS进行统计分析。研究中的t测试用于回归分析,P<0.05的概率具有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 太平猴魁绿茶啤酒风味分析

2.1.1 不同添加方式对太平猴魁绿茶啤酒风味影响

通过GC-MS对不同啤酒的挥发性成分进行定性和定量分析,得到不同啤酒的风味数据表。由图2所示,对照组啤酒共检测出44种风味物质,含量为9 716.67 μg/L,热萃组啤酒共检测出66种风味物质,含量为10 637.06 μg/L,混合组共检测出71种风味物质,含量为9 660.89 μg/L,冷萃组共检测出70种风味物质,含量为10 706.08 μg/L。实验发现,不同组啤酒的风味物质种类和含量均具有明显差异,3款不同投料方式的茶啤酒的风味物质种类及其含量明显高于对照组啤酒。在总风味物质含量上,添加茶叶的热萃组和冷萃组风味物质含量明显高于对照组,混合组啤酒风味物质相对含量与对照组并无明显差异,但风味物质种类更加丰富。这表明太平猴魁对啤酒的风味具有显著的影响。

将啤酒中所有的挥发性化合物按照结构类型分类,如图3所示。挥发性化合物可被分为7类,对照组啤酒仅在醛类物质(29%)相对含量较高;热萃组啤酒在酯类、酸类和烯萜类相对含量最高,分别为33%、29%、39%;混合组啤酒在各类别上没有显著特点,但在酮类物质上相对较高(26%);冷萃组啤酒与热萃组不同的是,它的醇类、酮类和其他类风味成分相对突出,占比为31%、37%、32%。热萃和冷萃对啤酒的酯和醇的含量具有明显的影响,原因可能是绿茶中的脂肪酸在高温萃取下水解或氧化生成酯类物质[15]。而在冷萃条件下,通过提高了酶的活性并加速的脂肪酸的氧化形成了醇类物质[16]。使得茶啤酒不同工艺下醇类和酯类物质含量具有较为明显的差异(P<0.05)。

酯类是酒精发酵饮料中的主要风味活性代谢物,它在啤酒中的气味阈值很低,挥发性较强,很大程度上决定了啤酒最终的香气程度[17]。由表1可知,在对照组啤酒、热萃组啤酒、混合组和冷萃组中分别检测出16、23、25和25种酯类物质,含量分别为2 899.69、3 600.78、2 477.09和2 013.30 μg/L。3组茶啤酒检测到的酯类物质种类数量明显高于对照组啤酒。热萃组啤酒的酯类物质含量最高,其次分别是对照组啤酒、混合组和冷萃组。由此可知,茶叶能赋予啤酒丰富的酯类物质,但这与茶叶的投料方式相关。在啤酒众多的酯类物质中存在具有特殊香气的成分,其中乙酸乙酯(果香)、乙酸异戊酯(水果、香蕉香气)、月桂酸乙酯(花香、果香)、己酸乙酯和辛酸乙酯(酸苹果)以及乙酸苯乙酯(花香、玫瑰、蜂蜜)等酯类物质是啤酒中最重要的风味活性酯[18]。这几种酯类物质在对照组啤酒和茶啤酒中相对含量较高,给啤酒带来酯香和酒香风味。甲酸庚酯、水杨酸甲酯、9-十六碳烯酸乙酯和硬脂酸乙酯仅存在于茶啤酒中,这几种物质来源于茶叶或是茶叶中某些成分被酵母代谢产生。其中,水杨酸甲酯能赋予啤酒清新的香气属性。与以上产生花香和果香属性风味物质不同的是,癸酸乙酯是啤酒中酵母不良风味的主要来源,它存在于酵母的胞内,通过酵母自溶释放到啤酒中[19]。茶叶加入对啤酒中的癸酸乙酯含量具有显著的影响。由实验数据得出,热萃组啤酒癸酸乙酯含量最高(1 489.18 μg/L)其次是对照组啤酒(869.65 μg/L)、混合组啤酒(809.60 μg/L)和冷萃组啤酒(526.22 μg/L),冷萃组啤酒癸酸乙酯含量最低,表明绿茶冷萃能减少啤酒中的不良风味。癸酸乙酯是由酵母代谢产生乙酸乙酯与啤酒中的长链脂肪酸反应形成的,不存在于太平猴魁中[9,20]。这意味着热萃组中的某些成分可能会影响酵母的代谢,加速了酵母的裂解,使得酵母胞内的癸酸乙酯被释放到酒体中。

醇类物质作为酵母代谢的副产物,对啤酒的风味起着至关重要的作用[21]。在对照组啤酒中检测出11种醇类物质,总含量为5 277.37 μg/L,热萃组啤酒检测出17种,含量为5 382.43 μg/L,混合组啤酒检测出18种,含量为5 929.66 μg/L,冷萃组啤酒检测出19种,含量为7 373.84 μg/L。丙醇、异丁醇、异戊醇和苯乙醇作为啤酒中最重要的几类感官活性高级醇,它们在不同组啤酒中都具有相对较高的含量,其中,异戊醇是所有啤酒中含量最高的高级醇,它能赋予啤酒浓厚的酒香。苯乙醇和正丙醇也具有相对较高的含量,它们赋予啤酒玫瑰香气和酒精气味[22-23]。芳樟醇具有愉悦的花香,它在4组啤酒中都能被定量测定出,冷萃组含量最高达到48.72 μg/L,其次分别为混合组啤酒(27.71 μg/L)、热萃组啤酒(24.43 μg/L)和对照组啤酒(16.30 μg/L)。可以得出,茶叶加入啤酒中可以明显提高啤酒中芳樟醇的含量,并且冷萃法能最有效将其提取到啤酒中。除此之外,冷萃组检测出的醇类物质种类和含量都明显高于对照组啤酒,其中异丁醇(101.44 μg/L)、异戊醇(1 183.26 μg/L)和苯乙醇(793.01 μg/L)在冷萃组啤酒中含量明显高于其他组啤酒。与对照组啤酒相比,冷萃组啤酒还具有它不存在的醇类物质,如蘑菇醇、顺-3-壬烯醇、橙花醇、松油醇、香茅醇等,它们由茶叶直接或间接带入到啤酒酒体中,这使得啤酒具有更丰富的风味属性。

酮类和醛类物质也是啤酒风味中较为关键的两类。在茶啤酒中,冷萃组酮类物质含量最高,为12.15 μg/L,其次是混合组(8.56 μg/L)和热萃组(7.16 μg/L),对照组啤酒含量最低,为4.56 μg/L。3组茶啤酒中的酮类含量明显高于对照组啤酒,并且还富含其他对照组啤酒不具有的风味成分,如丙酮和β-紫罗兰酮。其中β-紫罗兰酮具有紫罗兰香气,这使得啤酒具有更浓郁的花香属性。啤酒常见的几类醛类物质,如乙醛、正辛醛、壬醛、正癸醛、和α-己基肉桂醛,同样也存在于茶啤酒中,但是异戊醛(杏仁香气)和β-环柠檬醛(薄荷香气)仅存在于茶啤酒中,由茶叶带入酒体。

酸类物质是啤酒主要呈味物质之一,酸的种类和含量将会直接影响啤酒的品质和风味。一般啤酒中的酸类物质含量不宜过高,超过一定范围会导致啤酒酒体偏酸,不被广大消费者们所接受。在此项研究中,对照组啤酒、热萃组啤酒、混合组啤酒和冷萃组啤酒中的挥发性酸含量分别为1 475.18、1 588.33、1 199.48、1 253.79 μg/L。热萃组酸类物质含量最高,而冷萃组相对较低。这可能是茶叶在煮沸的条件下,其中的酸类物质被高温萃取并带到了啤酒中,使酒体酸类物质含量提高。在酸类物质中,冰醋酸、辛酸和正癸酸是啤酒中主要的挥发性酸。其中,冰醋酸主要来源于麦芽、发酵前期乙醇和乙醛的氧化,而冷萃组啤酒的茶叶是在发酵后期添加,对啤酒前期发酵并不存在影响[24]。因此,冷萃组啤酒与对照组啤酒的冰醋酸含量相比并没有明显的差异。热萃组中酸类物质含量相对较高,表明在热萃条件下,能将茶叶中的酸类物质带入啤酒中,如2-甲基己酸、6-甲基庚酸和月桂酸等物质。

2.1.2 太平猴魁绿茶啤酒关键挥发性成分分析

气味活性值(odorant activity value,OAV)是化合物含量与其阈值之比,通常认为OAV值越大的风味成分对样品的风味贡献越大。0.1≤OAV≤1的组分对样品风味具有修饰作用,OAV≥1为关键风味组分,OAV≥10为重要香气物质[25-26]。为了进一步分析绿茶投料方式对啤酒风味的影响,我们通过查阅文献中现有物质的香气阈值,计算出各样品中具有香气属性化合物的OAV值,并根据不同组啤酒风味数据表筛选了20种OAV≥0.1且具有香气属性的组分作为研究对象。如表2所示,4组啤酒中的辛酸乙酯OAV>100,它具有酸苹果的香气。10≤OAV≤100的组分有正己酸乙酯和芳樟醇。其中芳樟醇具有花香和清香的属性,在3组茶啤酒中芳樟醇OAV值明显高于对照组啤酒,并且,太平猴魁在冷萃工艺下能更显著提高啤酒中芳樟醇的含量。不同啤酒组中1≤OAV≤10的组分有乙酸异戊酯、癸酸乙酯、十四酸乙酯、十六酸乙酯、辛酸、正辛醛、壬醛、正癸醛、二甲基硫和月桂醇,其中乙酸异戊酯、十四酸乙酯、十六酸乙酯、正辛醛、壬醛、正癸醛和月桂醇对啤酒的清香、果香和花香均具有一定的贡献,癸酸乙酯和二甲基硫会给啤酒带来酵母味和油脂等不良风味。在不同茶啤酒中,热萃组能提高啤酒中的癸酸乙酯含量,而冷萃组的癸酸乙酯和二甲基硫含量明显低于对照组,减少了啤酒本身的不良风味。0.1≤OAV≤1的组分主要有乙酸苯乙酯、月桂酸乙酯、β-紫罗兰酮、异戊醛、β-环柠檬醛、蘑菇醇和香茅醇,其中β-紫罗兰酮、异戊醛、β-环柠檬醛、蘑菇醇和香茅醇这5种物质只存在于3组茶啤酒中,在冷萃组中OAV值相对较高。这说明,β-紫罗兰酮、异戊醛、β-环柠檬醛、蘑菇醇和香茅醇5种物质由茶叶带入,并且在冷萃工艺下,太平猴魁的香气成分能更多的保留在酒体中。

为了更直观的分析出不同组中的挥发性化合物之间的差异,对20种具有香气贡献的挥发性化合物进行聚类热图分析。如图4所示,正癸醛、壬醛、正辛醛、二甲基硫、辛酸乙酯、正己酸乙酯和乙酸异戊酯属于啤酒中的特征风味成分。热萃组啤酒中癸酸乙酯、月桂酸乙酯和十四酸乙酯含量较高,可以提高啤酒的花香属性,但是会加重啤酒的酵母味。混合组风味物质并没有显著的特色,但冷萃组能显著提高乙酸苯乙酯、芳樟醇、香茅醇、β-紫罗兰酮、β-环柠檬醛、蘑菇醇和月桂醇等风味成分含量,它们赋予啤酒更加丰富的清香和花香属性。

2.1.3 太平猴魁绿茶啤酒特征风味物质PLS-DA

PLS-DA可根据给定的样品风味数据进行判别分析,常被用于分析各组间的风味总体差异,筛选组间的差异风味组分。为了确定风味组分的变量如何影响不同组啤酒样品之间的差异,对茶啤酒中的20中特征风味物质进行PLS-DA。结果如图5所示,拟合优度参数(R2X)、模拟解释能力(R2Y)和预测能力(Q2)分别为0.951、0.980和0.936,表明模型具有良好的预测性和稳健性。由PLS-DA图可知,不同组的啤酒样品分别处于椭圆的不同区域,每组样品内的重复样品较为密集,表明绿茶不同投料方式对啤酒风味组分具有明显的差异,并且样品组内的重复性好。通过200次响应的排列实验验证模型是否符合拟合,得到如图6所示,Q2回归线与纵轴的相交点小于0,并且验证模拟的截距分别为R2(0.37)和Q2(-0.451),说明模型不存在过拟合,模型验证有效,认为该结果可用于不同组啤酒的风味差异分析。

根据PLS-DA模型,绘制了20种物质的变量贡献值图(VIP值)。如图7所示,通过计算VIP值评估各变量对每组啤酒样品分类和识别的影响和解释力,VIP值越大表明变量在分组中的贡献越大。由图可知,VIP>1的物质共有9种,分别为月桂酸乙酯(VIP:1.371)、乙酸苯乙酯(VIP:1.292)、癸酸乙酯(VIP:1.241)、二甲基硫(VIP:1.137)、月桂醇(VIP:1.118)、正癸醛(VIP:1.108)、壬醛(VIP:1.093)、辛酸(VIP:1.067)和十四酸乙酯(VIP:1.058),可用于区分4组不同啤酒的香气化合物标记物。其中,正癸醛、壬醛在对照组啤酒中含量最高,具有青草香和柑橘香气;在绿茶的热萃条件下,啤酒中的月桂酸乙酯含量能明显提高,给啤酒带来丰富的果香风味;乙酸苯乙酯、月桂醇能更多的保留在冷萃组啤酒中,提高啤酒的花香属性。

2.2 不同添加方式对太平猴魁绿茶啤酒理化指标的影响

通过对4组啤酒的基本理化指标进行测定,探讨茶叶的不同投料方式对啤酒理化指标的影响。结果如表3所示,茶叶的投入不影响啤酒的正常发酵,但是对酒体中的总酸含量着一定的影响。热萃组的总酸含量高于冷萃组和对照组啤酒,这可能是由于茶叶中的酸类物质被高温萃取并进入了啤酒酒体。

3 结论

本文通过将太平猴魁加入到啤酒的发酵中,研究太平猴魁绿茶对啤酒风味组分的贡献,并采用不同茶叶添加方式来考察绿茶对啤酒关键风味组分的影响。研究发现,太平猴魁绿茶啤酒存在20种OAV≥0.1的风味组分,其中β-紫罗兰酮、异戊醛、β-环柠檬醛、蘑菇醇和香茅醇5种香气成分来源于太平猴魁。根据不同组啤酒风味数据分析,发现在冷萃条件下能更多的保留太平猴魁本身的风味组分。并且,在绿茶冷萃条件下能提高了啤酒本身存在的风味物质含量,如芳樟醇、异丁醇、异戊醇和苯乙醇等组分。通过对不同组啤酒中的风味物质进行PLS-DA判别,得到9种VIP>1的物质,分别为月桂酸乙酯、乙酸苯乙酯、癸酸乙酯、二甲基硫、月桂醇、正癸醛、壬醛、辛酸和十四酸乙酯,这类香气化合物可作为区分太平猴魁绿茶啤酒在不同酿造工艺下的风味差异标记物,这对以不同风味类型为导向的绿茶啤酒工艺具有参考意义。

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