原花青素(proanthocyanidins, PACs)又称为缩合单宁[1],是一类广泛存在于植物中的多酚类化合物[2],具有抗氧化、抑菌、抗炎和增强免疫等多种生理活性[3]。据相关研究显示,原花青素不仅能积极促进肠道益生菌如乳酸菌、双歧杆菌的增长,而且还能在一定程度上抑制某些有害菌群的繁殖,调节肠道稳态和维护肠道健康[4]。原花青素虽然由于本身多为大分子聚合物从而表现出消化吸收率较低的特性,但其带来的功效作用仍然不容小觑[5],根据最新合生元定义,原花青素类多酚化合物被认为是新型益生元/合生元的最佳来源选择之一[3,6]。

合生元是益生菌和益生元的混合制剂,能同时发挥益生菌、益生元的作用,因其特有的生物活性在牲畜养殖、食品、保健品等行业具有较广泛的应用前景。研究显示,肠道微生物群中双歧杆菌、肠球菌、拟杆菌属、布劳特氏属、乳酸菌以及真杆菌能通过去糖基化水解结合态多酚为游离多酚,然后再进一步通过微生物代谢所形成的复杂产物,对宿主发挥更有益的作用[7]。其中,双歧杆菌被认为是人与体内肠道微生物相互作用的关键共生体,具有代谢多种不同底物的能力,在调节人体肠道健康过程中发挥至关重要的作用[8]。双歧杆菌具备代谢原花青素的相关酶,尤其是双歧杆菌BB12对多酚化合物具有较高的敏感性[9]。可见,选择肠道健康作用显著的双歧杆菌BB12与原花青素进行组合可能是提升其生物利用率的有效途径。

研究发现与A型荔枝果皮原花青素相比,相同作用浓度下,B型低聚原花青素(lotus seedpod oligomeric procyanidins,LSOPC)不仅对致病性大肠杆菌显示出很高的抑菌活性,且对多种益生菌尤其是双歧杆菌BB12显示出明显的促生长作用;当其与双歧杆菌BB12合用时在抗炎、抗腹泻等方面均显著显示协同合生效果。在改善肠道功能方面,酸奶作为优质的发酵乳制品,口感醇厚,营养价值丰富,广受消费者的喜爱。为提高酸奶的功能性,西方营养家已经开始尝试以富含酚类化合物的蔬菜水果作为培养基进行发酵,而国内却鲜有报道[10]。研究表明,多酚类物质的加入能够增强酸奶的价值功效,改善其口感,且不对发酵菌种活力产生负面影响[11]。因此,本研究以双歧杆菌BB12和LSPC为合生元组合,以持水力、物性、酸度和感官评定等综合指标通过单因素和正交试验进行工艺优化,以期能研制出具有原花青素生物活性的新型多功能合生元膳食补充剂。

1 材料与方法

1.1 实验材料

新鲜莲房,购于湖北省洪湖市菜市场;纯牛奶、木糖醇,市售;发酵菌粉(内含保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌、嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌和干酪乳杆菌),购于北京川秀国际贸易有限公司;双歧杆菌Bb-12®,购于HANSEN公司。

1.2 仪器与设备

DHR2流变仪,美国TA仪器公司;8890-7000D气质联用仪,安捷伦仪器公司;RE111旋转蒸发器,瑞士Buchil abortechnik公司; FiveEasy Plus pH计,梅特勒-托利多仪器有限公司;DH5000BⅡ恒温箱,天津市泰斯特仪器有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 莲房原花青素低聚体的制备

莲房原花青素是存在于莲房中的多酚类化合物,在莲房中的含量高达7.8%(质量分数)。按照实验室前期研究方法进行LSOPC提取。称取100 g小块的新鲜莲房,用1 500 mL 70%(体积分数)的甲醇水溶液在60 ℃下提取1.5 h。将提取液过滤后,用旋转蒸发器在40 ℃下浓缩,以去除甲醇。然后用AB-8大孔树脂包被的柱层析纯化残渣。先用2.5 L蒸馏水洗涤柱子,再用70%甲醇水溶液洗脱。将洗脱液用旋转蒸发法进行浓缩,然后用3倍体积的乙酸乙酯萃取2次。将乙酸乙酯相合并、浓缩后进行冷冻干燥,可回收LSPC 3.67 g[12]。采用盐酸-正丁醇和液质联用仪器方法[13-14],测得LSOPC的纯度可达(98.65±0.53)%,其组分及含量分别为(-)-表儿茶素(12.95%)、(+)-儿茶素(33.07%)、二聚体(30.4%)、三聚体(12.14%)、四聚体(1.83%)[15]。

1.3.2 酸奶的制备

在纯牛奶中溶解木糖醇和菌粉,添加原花青素和双歧杆菌后充分搅拌,分装于酸奶发酵瓶中密封后置于恒温箱于45 ℃发酵培养,发酵完成后在4 ℃冰箱中后熟。

1.3.3 酸奶单因素试验设计

通过预实验,确定酸奶工艺菌粉添加量为1.0 g/L。以酸奶感官评定分数、持水力为指标,对不同添加量的原花青素(0.03%、0.06%、0.09%、0.12%,质量分数)、双歧杆菌(0.25%、0.35%、0.45%)和木糖醇(6%、8%、10%、12%,质量分数),以及不同发酵时间(6、8、10、12 h)设计单因素试验进行酸奶工艺优化。

1.3.4 酸奶正交试验优化

在单因素试验的基础上,以感官得分为评价指标,选择原花青素、木糖醇和双歧杆菌添加量进行3因素3水平的正交试验设计,确定最佳工艺参数,正交设计表见表1。

1.3.5 贮藏期酸奶品质变化分析

制备合生元酸奶与单一组分酸奶,以空白组酸奶为对照,在4 ℃条件下贮藏7 d,分别于第1、3、7天取样,测定酸奶的pH和流变特性,分析上述指标在贮藏期内的动态变化[16]。

1.3.6 酸奶的pH测定

将发酵后熟完成的酸奶样品充分搅拌均匀,在室温下使用校准后的pH计进行测定。

1.3.7 酸奶的持水力测定

准确称定空离心管的质量记为m0,取适量酸奶置于离心管中精准称定质量记为m1,在室温下以4 200 r/min下离心15 min[17],静置10 min后弃上清液再次精准称定质量记为m2。按式(1)公式进行计算:

持水力

(1)

式中:m0,离心管质量,g;m1,酸奶与离心管总质量,g;m2,离心后酸奶和离心管总质量,g。

1.3.8 酸奶的流变特性测定

流变特性的测定方法参考文献报道方法,并进行部分参数调整[18]。使用DHR2流变仪对酸奶进行流变学分析,采用PP40平行板夹具(直径40 mm,不锈钢材质)进行测定。酸奶样品在25 ℃的条件下以5%的应变进行频率扫描测试(0.1～10 Hz),记录储能模量(G′)和损耗模量(G″)的结果。

1.3.9 酸奶的挥发性风味物质测定

采用配备顶空固相微萃取的GC-MS分析酸奶的挥发性物质。将酸奶样品搅拌均匀后准确称取5.000 0 g置于20 mL顶空样品瓶中,然后将老化的萃取头放入瓶中提取挥发性化合物[19]。

GC条件:采用Agilent HP-5MS UI弹性石英毛细管柱(30 m×250 μm×0.25 μm),载气He流速为1.0 mL/min。起始柱温50 ℃,保持5 min后以5 ℃/min升温至115 ℃,再以8 ℃/min升温至270 ℃,保持2 min,进样口温度为260 ℃。

MS条件:采用电子电离源,离子源温度230 ℃,电子能量70 eV,扫描范围35～500 m/z。

定性定量分析:挥发性物质通过NIST谱库进行匹配,并根据保留指数进行定性分析,鉴定出相似度>80%的化合物;根据峰面积归一化法进行定量分析,计算挥发性成分的相对含量[20]。

1.3.10 酸奶感官评分

参照GB 19302—2010《食品安全国家标准 发酵乳》,优选10位经提前训练的审评人对酸奶的组织状态、口感气温、颜色进行综合评价,满分100分。感官评分标准见表2。

1.4 数据处理

所有实验均重复3次,使用SPSS(statistical package for social sciences)进行数据统计方差及显著性分析(P<0.05),使用Excel 2016进行数据处理并制图。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 原花青素添加量的确定

以木糖醇添加量为8%(质量分数),菌粉添加量为1.0 g/L,发酵时间为10 h,原花青素添加量分别为0.03%、0.06%、0.09%和0.12%(质量分数)进行发酵试验,考察原花青素添加量对酸奶品质的影响,结果如表3所示。添加原花青素后的酸奶持水力各组之间无显著性差异,表明所添加的原花青素对酸奶结构不会造成影响。同样地,当原花青素添加量较低(≤ 0.09%)时,对酸奶感官品质没有显著影响,仅当添加量增加至0.12%时,感官评分显著低于其他3组,说明原花青素含量过高,其本身的涩味掩盖了酸奶的口感[21],导致酸奶感官评价得分较低。而原花青素添加量为0.03%时,其感官评价得分相对最高,因此选择原花青素添加量为0.03%,并以此进行正交试验。

2.1.2 双歧杆菌添加量的确定

考虑到单独观察双歧杆菌与原花青素的相互作用,未添加普通菌粉,以木糖醇添加量为8%,发酵时间为10 h,原花青素添加量为0.03%,双歧杆菌添加量分别为0.25%、0.35%、0.45%条件进行发酵试验,考察双歧杆菌添加量对酸奶品质的影响,结果如表4所示。

加入双歧杆菌对酸奶酸度有明显提升,3组pH值呈现显著性差异,持水力无明显差异。双歧杆菌添加量为0.35%和0.45%时的酸奶pH值较0.25%有明显降低,考虑所加入菌种较多从而产酸导致的,酸奶pH值较低对口感影响较大。双歧杆菌在发酵过程中通过己糖磷酸途径(hexose monophosphate pathway,HMP)产生乳酸,酸奶的酸味与乳酸的含量呈正相关[22]。其中,双歧杆菌添加量为0.35%时感官评分最高,与其他2组有显著差异。综合来讲,双歧杆菌添加量为0.35%时酸度适宜,质地均匀,奶味足,风味较好,因此选择双歧杆菌添加量为0.35%。

2.1.3 木糖醇添加量的确定

以原花青素添加量为0.03%(质量分数),双歧杆菌添加量为0.35%,菌粉添加量为1.0 g/L,发酵时间为10 h,木糖醇添加量分别为6%、8%、10%和12%(质量分数)进行发酵试验,考察木糖醇添加量对酸奶品质的影响。

如表5所示,酸奶持水力随木糖醇添加量的增加而上升,木糖醇添加量为12%时酸奶持水力显著大于前2组(6%、8%),可能是木糖醇的添加使酸奶中固形物的含量增加,有利于酸奶中蛋白质凝胶结构的稳定。pH随着木糖醇添加量的增加呈先上升后下降趋势,其中当木糖醇添加量为10%时,酸奶pH与其他3组存在显著性差异。当木糖醇添加量较小时无法为发酵菌种提供足够的碳源,不能满足其发酵的需求从而导致产酸量不够,而当木糖醇的添加量达到一定程度时发酵菌种产生大量有机酸[17],酸奶pH值又下降,使酸奶整体口感下降。综合来讲,在木糖醇添加量为10%时,酸奶的持水力较高,酸甜度适宜,口感好,感官评分最高,因此选择10%作为木糖醇添加量。

2.1.4 发酵时间的确定

以木糖醇添加量为8%,菌粉添加量为1.0 g/L,原花青素添加量为0.03%,双歧杆菌添加量为0.35%,发酵时间分别为6、8、10、12 h进行发酵试验,考察发酵时间对酸奶品质的影响,结果如图1所示。发酵时间过短会导致菌种没有充分发挥作用,发酵时间过长则会导致产酸过多,酸奶酸化,双歧杆菌产酸与木糖醇和原花青素在口感上彼此中和,形成最佳配比。当发酵时间为12 h时,酸奶感官评分最高,口感最好,因此发酵时间选择12 h。

2.2 原花青素双歧杆菌合生元酸奶正交试验结果

在单因素试验的基础上,以原花青素添加量、双歧杆菌添加量、木糖醇添加量为因素进行正交试验,以酸奶的感官评分为指标[23],结果如表6所示。3个因素对酸奶感官评分的影响顺序为:木糖醇添加量(C)>原花青素添加量(A)>双歧杆菌添加量(B),通过极差分析得到合生元酸奶的最佳工艺为A3B3C3。

由表7方差分析可知,原花青素添加量、双歧杆菌添加量在试验中对感官评分无显著性差异(P>0.05),木糖醇添加量则对感官评分有显著性差异(P<0.05)。故以正交试验结果为主要依据得出实际最佳配方为A3B3C3,即原花青素添加量0.035%,双歧杆菌接种量0.4%,木糖醇添加量10%。

2.3 酸奶挥发性风味物质分析

由表8可知,对4种酸奶的挥发性风味物质主要包括酮类、酸类、酯类、芳香类、其他类。空白酸奶共检测出7种挥发性风味物质:酮类4种、酸类1种、芳香类1种、其他类1种。原花青素酸奶共检测到9种风味物质:酮类4种、酸类3种、芳香类1种、其他类1种。合生元酸奶与双歧杆菌酸奶均检测出12种挥发性风味物质,其中酮类5种、酸类4种、酯类1种、芳香类1种、其他类1种。合生元酸奶和3个对照组酸奶相比,风味物质种类无明显差异,但各类风味物质的阈值有差异,因而有一定的风味差距。

合生元酸奶中酮类和酸类为主要挥发性风味成分,酮类(19.55%)相对含量最高,其次是酸类(15.27%)和酯类(1.76%),全部风味物质相对含量最高的酮类和酸类分别是3-羟基丁酮(12.09%)、己酸(7.41%)。

酸类物质在酸奶的风味物质中有着重要的作用[24],合生元酸奶与空白酸奶相比,多了乙酸、丁酸和辛酸,口感更好,风味更香。合生元酸奶的酮类物质也相对空白酸奶多,风味物质更多样。合生元酸奶中乙酸和丁酸的相对含量较双歧杆菌酸奶少,辛酸较多,口感更柔和。

2.4 贮藏期酸奶的品质的变化

对单一组和复合组酸奶进行了7 d的贮存期观察与品质检测,进行pH测定和流变特性分析,表9显示了贮藏期各组酸奶pH、储能模量、损耗模量以及黏度的变化。

从表9中可以看出,各组酸奶的pH总体呈降低趋势。由于双歧杆菌和原花青素的共同发酵作用,在贮藏第1天合生元酸奶的pH与其他3组存在显著性差异。在0～7 d期间酸奶pH呈下降趋势,这是由于菌株利用酸奶中剩余乳糖继续产酸。

贮藏期第1天,合生元酸奶的G′(储能模量或弹性模量)和G″(损耗模量或黏性模量)大于除双歧杆菌酸奶的其他2组酸奶,在第3天和第7天时合生元酸奶的G′和G″保持较高水平且显著高于其他3组。另外,只添加原花青素(或双歧杆菌)的酸奶的G′和G″分别高于空白酸奶的G′和G″。

在贮藏期第1天和第3天时,相同剪切速率下,单独添加原花青素或双歧杆菌的酸奶和合生元酸奶的黏度均大于空白酸奶,且有一定的显著性。在贮藏3 d和7 d时,合生元酸奶的黏度显著高于其他3组,并且维持在较高水平,具有较好的稳定性。第7天时除了合生元的黏度维持稳定,其他3组的黏度变化幅度大,尤其是双歧杆菌,可能是由于微生物繁殖产生代谢物质的影响,这在吴欣怡等[17]对乳铁蛋白在贮存期品质变化的研究中也有体现。

3 结论与讨论

本研究经单因素及正交优化试验确定了原花青素-双歧杆菌合生元酸奶制作的最佳工艺条件:0.035%(质量分数)原花青素,0.4%双歧杆菌,10%(质量分数)木糖醇,发酵时间12 h。通过对其品质分析发现原花青素-双歧杆菌合生元通过影响酸奶的酸度、持水性和流变特性,有效地改善了酸奶的各项理化指标,提高了酸奶的口感、品质。

在风味物质分析中发现合生元酸奶检测出12种挥发性风味物质,明显高于空白组的7种。合生元酸奶和空白酸奶主要的酮类物质均为3-羟基丁酮。合生元酸奶中酮类物质占比(19.55%)显著低于空白酸奶中酮类物质占比(37.13%)。但前者酸类物质占比(15.27%)显著高于空白酸奶(2.28%),且合生元酸奶酸类物质更丰富,有除了空白酸奶含有的己酸外还有乙酸、丁酸、辛酸,促进了原花青素-双歧杆菌合生元酸奶特有的风味。何齐等[25]对赛里木传统酸奶挥发性风味物质的研究中也有检测出酮类物质(12.17%)较市售酸奶少、酸类物质(48.49%)较市售酸奶多的现象,这可能与酸奶的风味特性较强有关。

稳态流变测试中G’反映样品弹性大小,G”反映样品黏性大小。从频率扫描数据可以看出,在同组酸奶中,G’始终高于G”,说明酸奶样品具有一定的刚性(弹性行为),呈现出软流体凝胶的特征,符合酸奶的性质。G’值越高,表明酸奶有更像固体的行为,凝胶效果也越好[26],越不容易在外力作用下产生形变,从而具有更好的稳定性。酸奶的表观黏度是由酪蛋白胶束之间的键的强度和数量以及它们的结构和空间分布来调节的[27]。高黏度代表低流动性、低碰撞率,有利于抵抗不稳定性[28]。

在低温贮藏过程中,各组酸奶的酸度会发生持续而缓慢的变化,且均呈下降趋势。刘文星等[29]对黄浆水酸奶的贮藏研究中也发现相同的变化规律。在低温贮藏的第7天,对于G′和G″以及黏度:合生元酸奶>单一组>空白组,说明添加额外的益生元、益生菌有助于酸奶稳定性的提高,且两者之间的作用使酸奶稳定性更好,可能因为益生元和益生菌均可增强酸奶的三维网络凝胶结构[4],共同加入强化了酸奶内部结构,使分子间的作用力增强。

原花青素和双歧杆菌对肠道有益作用显著,是合生元酸奶领域有前景的研究。目前,关于原花青素双歧杆菌复合酸奶的研究较少,本研究初步确定了原花青素与双歧杆菌复合酸奶的最佳制作工艺,分析了该合生元酸奶的品质,为进一步的工业化生产研究提供了技术参考和思路。

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Research on preparation and quality analysis of procyanidin-Bifidobacterium synbiotic yoghurt

SU Yangyan, LI Runhan, LIU Siyi, LI Yan, TANG Cuie*

(College of Food Science and Technology, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China)

ABSTRACT Synbiotics have been widely studied and applied as food additives due to their unique biological activities.Hence, the combination of Bifidobacterium BB12 and proanthocyanidins was used to fortify the functionality of yoghurt.The effects of adding proanthocyanidins, bifidobacteria, xylitol, and fermentation time on the sensory characteristics and physical and chemical indexes of yogurt were investigated.Volatile compounds in yoghurt were determined by headspace solid-phase microextraction coupled to gas chromatography-mass spectrometry, and the rheological characteristics of yoghurt during storage were characterized by a rheometer.Results showed that the yoghurt had a uniform and delicate texture after optimization.The formulation of yoghurt was optimized as 0.035% proanthocyanidins, 0.4% Bifidobacterium, and 10% xylitol.The fermentation conditions of yoghurt were at 45 ℃ for 12 h.The addition of Bifidobacterium BB12 and proanthocyanidins altered the flavor compounds, especially the increasing ketone (19.55%) and acid (15.27%) contents.At these conditions, the results of mass spectrometry show that there are significant differences in the thresholds of various flavor substances in compound yogurt compared with single-component yogurt, among which ketones were the highest, followed by acids.Yoghurt containing Bifidobacterium BB12 and proanthocyanidins showed a more stable structure, higher viscosity, and longer quality retention time than the blank yoghurt after low-temperature storage.This study can provide a basic data reference for the specific application and development of plant polyphenol synbiotics.

Key words proanthocyanidins;Bifidobacterium;yogurt;synbiotics;fomulation optimization

DOI：10.13995/j.cnki.11-1802/ts.040049

引用格式：苏杨延,李润含,刘思怡,等.原花青素双歧杆菌合生元酸奶的研制及品质分析[J].食品与发酵工业,2025,51(10):103-109.SU Yangyan, LI Runhan, LIU Siyi, et al.Research on preparation and quality analysis of procyanidin-Bifidobacterium synbiotic yoghurt[J].Food and Fermentation Industries,2025,51(10):103-109.

第一作者：本科生(唐翠娥实验师为通信作者,E-mail:minttytang@mail.hzau.edu.cn)

基金项目：国家自然科学基金面上项目(32372325)

收稿日期：2024-05-30,改回日期:2024-06-18