红曲酒是我国福建、浙江和江西等地区特有的传统功能型米酒的代表品种之一,具有显著的调节血脂、抗疲劳、维护心血管和抗氧化等药理活性[1],受到消费者的喜爱。它以红曲为糖化剂,糯米为原料,经过糖化、发酵、澄清、陈酿等工艺制得[2]。
传统红曲酒酿造主要是固态发酵,酿造方式比较粗犷,生产受环境因素影响较大,质量难以保持稳定[3]。近年来以红曲菌为糖化菌株、酿酒酵母为产酒精菌种的新型液态酿造技术发展迅速。液态法酿造具有出酒率高、发酵周期短的特点,但其挥发性化合物含量比传统固态发酵法低,何冬萍等[4]的研究显示,以红曲霉菌株替代传统古田红曲酿造红曲酒,其主要挥发性化合物含量降低了28.94%。除酿酒酵母外,产香酵母在酿造过程中会产生酯类等香气成分,对酒体的风味形成有重要影响,其中异常威克汉姆酵母(Wickerhamomyces anomalus)作为一种重要产香酵母,具有产香气成分能力强的特点,被广泛应用于果酒、米酒等的酿造中,刘从竹等[5]用W.anomalus发酵复合果汁,果汁中乙酸乙酯、高级醇含量得到明显提升,CHEN等[6]利用W.anomalus强化了米酒中酯类、醇类的含量,改善了米酒风味。
目前,关于用产香酵母提升红曲酒的品质尚未有具体研究。因此本实验将实验室筛选得到的产酯能力最强的产香酵母W.anomalus NCUF307.1[7],应用于液态法酿造红曲酒,对其理化指标、功效成分及挥发性化合物分析,以期为W.anomalus用于液态法酿造以改善红曲酒品质提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 材料与菌株
糯米,市售;W.anomalus NCUF307.1、紫色红曲菌(Monascus purpureus NCUF-9),均为实验室筛选保藏菌株。
没食子酸、芦丁、抗坏血酸、浓盐酸、氢氧化钠、3,5-二硝基水杨酸等(均为分析纯),西陇化工股份有限公司;DPPH(分析纯)、ABTS(分析纯)、桔霉素(色谱纯)、Monacolin K(色谱纯),上海源叶生物科技有限公司;仲辛醇(色谱纯),阿拉丁生化科技有限公司。
1.1.2 培养基
W.anomalus NCUF307.1种子培养基:YPD培养基。
M.purpureus NCUF-9种子培养基(g/L):葡萄糖50,蛋白胨20,KH2PO4 2,MgSO4·7H2O 0.5,氯化钠1,121 ℃,湿热灭菌20 min。
1.2 仪器与设备
HWS-250型恒温恒湿培养箱,上海森信实验仪器有限公司;FE28型pH计,梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司;SHJ-A6磁力搅拌水浴锅,常州市亿能实验仪器厂;SPME手动进样柄,美国Supelco公司;Agilent7890/7000AGC/MS气相色谱质谱仪,安捷伦科技有限公司;DVB/CAR/PDMS(50/30 μm)萃取头,美国Supelco公司;SP-756P紫外-可见光分光光度计,上海光谱仪器有限公司;Waters E2695高效液相色谱仪、Waters ACQUITY UPLC H-Class PLUS超高效液相色谱仪,沃特世公司。
1.3 实验方法
1.3.1 红曲酒酿造
酿造工艺流程为:
糯米打粉→加水调浆→灭菌→冷却→加种子液→液态发酵→过滤压榨→澄清→灭菌→成品
样品经4 ℃,12 000 r/min离心10 min后,取上清液,测定指标。
分组:用黄酒曲和M.purpureus NCUF-9发酵得到的红曲酒为对照组;加入W.anomalus NCUF307.1强化产香发酵得到的红曲酒为强化组。
1.3.2 还原糖、酒精度、总酸、氨基酸态氮及pH的测定
还原糖、酒精度、总酸、氨基酸态氮含量及pH的测定参照GB/T 13662—2018《黄酒》。
1.3.3 活性成分含量的测定
a)总酚含量的测定参照LIN等[8]的方法稍作修改:稀释酒样0.1 mL与0.05 mL的福林酚试剂混合均匀,室温静置8 min,加入0.15 mL 75 g/L的碳酸钠溶液混匀,黑暗中反应1 h,在760 nm条件下测定吸光度。以没食子酸为标准品,以其当量g/L来表示总酚含量。
b)总黄酮含量的测定:参照HAN等[9]的方法进行测定。
c)Monacolin K含量测定:参照ZHANG等[10]的方法稍作修改:
样品处理:1 mL酒样与9 mL 75%(体积分数)乙醇混匀,50 ℃、160 W超声提取30 min后,保温4 h,4 000 r/min离心5 min,过0.22 μm滤膜于238 nm条件下检测。
液相色谱仪检测条件:色谱柱:Symmetry C18(4.6 mm×250 mm);柱温30 ℃;流速0.8 mL/min;洗脱条件:V(乙腈)∶V(水)=55∶45。
d)桔霉素含量测定:参照徐素吟[11]的方法稍作修改:
样品处理:2 mL酒样与等体积有机溶液甲苯-乙酸乙酯-甲酸(体积比7∶3∶1)混匀,12 000 r/min离心10 min,吸取有机相,自然晾干后用80%甲醇复溶,过0.22 μm膜在λex=331 nm、λem=500 nm条件下检测。
超高效液相色谱检测条件:超高效色谱柱:Poroshell 120 SB-C18(4.6 mm×150 mm);柱温40 ℃;流速0.4 mL/min;流动相A:0.1%磷酸水,流动相B:乙腈。
洗脱条件见表1。
表1 PCR桔霉素测定洗脱条件
Table 1 Elution conditions for PCR detection of citrinin
洗脱时间/min流动相比例(φA∶φB)0～190∶101～360∶403～560∶40 5～1010∶9010～1710∶9017～2590∶1025～2690∶10
1.3.4 挥发性香气成分测定
参照汤苏文[12]的方法稍作修改:
a)样品处理:酒样6 mL加2.2 g氯化钠和10 μL 800 mg/L的仲辛醇溶液,45 ℃搅拌提取15 min,插入萃取纤维头顶空吸附45 min,气相色谱仪进样口,250 ℃解析5 min。
b)测定条件:
GC条件:采用HP-5MS(30 m×0.25 mm,0.25 mm)色谱柱,载气为He,流速为1.0 mL/min。进样口250 ℃;柱温升温程序:40 ℃保持5 min,以5 ℃/min升温到120 ℃,再以10 ℃/min升温到240 ℃,保持5 min,后运行温度240 ℃,运行5 min。
MS条件:电子电离源;离子源温度230 ℃;接口温度250 ℃;电子能量70 eV;灯丝发热电流0.25 mA;扫描速率全程33～450 m/z。
c)定性定量分析:运用计算机谱库(NIST/WILEY)对所得结果进行初步检索及资料分析,并结合相关文献进行定性分析。化合物含量按峰面积归一法进行计算。
1.3.5 感官分析
红曲酒的感官评定参照王蒙等[13]的方法稍作修改。品评小组由10名感官评价人员组成,包括4男6女,年龄为24～50岁。红曲酒感官描述词汇为:果香、花香、草木香、刺激性气味、酸味、涩味、苦味、甜味、整体感知,评分选取5点制(1:非常不喜欢;2:稍微不喜欢;3:既不喜欢也不讨厌;4:稍微喜欢;5:非常喜欢)。
1.4 数据处理
每个样品指标平行测定3次,采用Excel 2021、Origin 2022软件进行数据整理和统计分析,最终所得结果以平均值±标准偏差形式呈现。SPSS 26.0软件用于数据的单因素方差分析(P<0.05)。用TBtools 2023绘制挥发性香气化合物层次聚类分析图。
2 结果与分析
2.1 红曲酒理化指标结果分析
由图1可知,在发酵过程中,对照组和强化组还原糖、酒精度的变化趋势相同,W.anomalus NCUF307.1的添加不会影响红曲酒发酵过程的正常进行。由表2可知,发酵结束后,强化组还原糖含量比对照组略低,这是因为W.anomalus NCUF307.1利用了部分还原糖用于生长代谢。强化组红曲酒酒精度比对照组高0.33 %vol,产香酵母在生长过程中会产生少量酒精,LOIRA等[14]用酿酒酵母与产香酵母以1∶10的接种体积比共发酵葡萄酒的研究中也得出了类似的结果。还原糖和酒精度在2组间差异不显著(P>0.05),说明W.anomalus NCUF307.1的添加对红曲酒酿造的发酵效率和酒精产量没有显著影响。
图1 对照组与强化组红曲酒发酵过程中还原糖、酒精度变化
Fig.1 Changes in reducing sugar and alcohol in the fermentation process of Hongqu rice wine in the control and strengthening groups
表2 发酵结束后2组红曲酒的理化指标比较
Table 2 Comparison of the physicochemical indicators of two groups of Hongqu rice wine after fermentation
组别还原糖含量/(g/L)酒精度/(%vol)总酸含量/(以乳酸计g/L)pH值氨基酸态氮含量/(g/L)对照组1.69±0.03a15.17±0.21a4.03±0.20a3.64±0.24a0.42±0.08a强化组1.66±0.02a15.50±0.10a3.74±0.20a3.68±0.18b0.43±0.03a
注：同一列字母不同表示具有显著性差异(P<0.05)(下同)。
总酸和pH值是评价酒类感官质量的2个关键指标,显著影响其结构和平衡的感知。强化组总酸比对照组低7.20%,发酵后期,酒中部分酸与发酵过程中产生的醇类发生反应,使pH值升高[15]。这与LIU等[16]的研究中产香酵母混合发酵黄桃果酒后总酸含量降低的结果一致。W.anomalus NCUF307.1混合发酵有利于降低酒体中的总酸,使红曲酒口感得到更好地平衡。
氨基酸态氮是指食品中以氨基酸形式存在的氮含量。它是评估食品蛋白质质量和消化吸收性的重要指标。红曲酒是黄酒的一种,在GB/T 13662—2018《黄酒》中有明确的级别规定,2组红曲酒中氨基酸态氮含量都在0.35 g/L以上,达到黄酒优级标准。W.anomalus NCUF307.1的添加对红曲酒中氨基酸态氮含量无显著影响。
2.2 红曲酒生物活性成分结果分析
Monacolin K是红曲酒降血脂的主要功效物质,其能通过竞争性抑制(HMG-CoA)还原酶活力,阻断胆固醇的生物合成,从而有效降低体内总胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇水平[17]。对照组和强化组红曲酒中Monacolin K含量分别为55.65、56.27 mg/L,其含量无显著性差异(P>0.05)。桔霉素是红曲菌产生的一种肾毒素,会造成肾小管细胞坏死、肾脏肿大,且有致癌性、致畸性等毒副作用。我国对液态样品中的桔霉素限量标准为50 μg/L,对照组和强化组红曲酒中桔霉素含量分别为0.27、0.26 mg/L,2组红曲酒中桔霉素含量均符合标准且含量无显著差别(P>0.05)。Monacolin K、桔霉素都由红曲菌产生,以上结果表明W.anomalus NCUF307.1的添加不会影响红曲酒中Monacolin K、桔霉素含量。
酚类物质会影响酒体的口感及香气等品质,研究表明[18-20],产香酵母能产生一系列的酶如β-葡萄糖苷酶、酚羟化酶、苯丙氨酸羟化酶等,这些酶能促进米酒中结合酚类化合物的释放和合成,以及参与代谢途径生成代谢产物(如苯丙氨酸、儿茶酚胺等)从而影响酚类的含量。例如,β-葡萄糖苷酶可以通过分解米酒中的糖苷形态的酚类前体来释放更多的自由酚类化合物。β-葡萄糖苷酶也可将糖苷类黄酮转化为较高活性的苷元形式,这种转化利于提高基质的黄酮类物质含量。如表3所示,本文添加W.anomalus NCUF307.1后,强化组总酚含量比对照组显著增加(P<0.05),提高了14.05%;强化组总黄酮含量比对照组增加了7.98%,但变化不显著。以上结果表明W.anomalus NCUF307.1的添加能够增加酒类中总酚类、总黄酮类物质的含量,提升红曲酒的抗氧化性能。
表3 发酵结束后2组红曲酒生物活性成分比较
Table 3 Comparison of bioactive components in two groups of Hongqu rice wine after fermentation
组别总酚含量/(mg/L)总黄酮含量/(mg/L)Monacolin K含量/(mg/L)桔霉素含量/(μg/L)对照组265.50±6.1a85.45±1.1a55.65±0.11a0.27±0.015a强化组302.80±1.6b92.27±5.2a56.27±0.16a0.26±0.038a
2.3 红曲酒挥发性香气成分结果分析
采用SPME-GC/MS对2组红曲酒的挥发性风味物质进行分析,其含量如图2所示。酯类物质在2组红曲酒中占比最高,占挥发性风味物质总含量的35.02%、61.75%。其次是醛酮类物质,含量分别为11.80 mg/L、8.92 mg/L。强化组挥发性风味物质总含量达到48.58 mg/L,比对照组高出9.82%。强化组的酯类、醇类含量显著高于对照组(P<0.05),酯类物质的含量从14.64 mg/L增加到29.30 mg/L,醇类物质的含量从2.82 mg/L增加到5.34 mg/L,含量差异显著的物质主要有油酸乙酯、丁酸乙酯、癸酸乙酯、正丁醇、正辛醇、香茅醇等。W.anomalus NCUF307.1会影响红曲酒中挥发性风味物质组成及含量,进而影响红曲酒的风味品质。
图2 对照组与强化组红曲酒挥发性风味物质含量
Fig.2 Volatile aromatic compound levels in control and strengthening groups of Hongqu rice wine
注:不同字母代表具有显著差异(P<0.05)。
由表4可知,对照组共检测出40种挥发性风味物质,强化组共检测出42种挥发性风味物质。
表4 发酵结束后2组红曲酒中挥发性风味物质含量比较
Table 4 Comparison of volatile aromatic compounds in two groups of Hongqu rice wine after fermentation
编号化合物名称挥发性风味物质含量/(mg/L)对照组强化组酯类1油酸乙酯 ND 2.26±0.062甲酸庚酯 1.17±0.07b 1.80±0.17a3丁酸乙酯 0.59±0.17b 1.60±0.02a4辛酸乙酯 0.21±0.01a 0.21±0.06a5乙酸乙酯 0.02±0.001b 0.05±0.002a6乙酸异丁酯 0.96±0.04b 1.26±0.28a7乙酸异戊酯 0.07±0.01a 0.10±0.01a8乙酸苯乙酯 0.02±0.002b 0.04±0.003a9亚油酸乙酯 1.31±0.12b 1.64±0.05a10安息香酸乙酯 1.54±0.03a 1.65±0.25a11月桂酸乙酯 0.42±0.02b 1.07±0.12a12棕榈酸乙酯 ND 0.25±0.0113棕榈酸甲酯 ND 2.75±0.0414苯乙酸乙酯 ND 3.40±0.2915癸酸乙酯 1.71±0.04a 0.16±0.01b16十四酸乙酯 1.69±0.17a 1.02±0.07b17甲酸辛酯 ND 1.94±0.0718乳酸乙酯 2.08±0.08a 2.40±0.16a19乙酸戊酯 0.43±0.03a 0.49±0.03a20丁二酸二乙酯 1.13±0.12a 1.14±0.07a21壬二酸二乙酯 ND 3.23±0.1922甲酸丁酯 0.43±0.11 ND23甲酸己酯 0.26±0.06 ND24甲酸异丁酯 0.56±0.06 ND合计 14.64±0.64b 29.30±1.15a酚类252-甲氧基-4-乙烯苯酚 0.03±0.003a 0.01±0.000 2b262,4-二叔丁基酚 0.56±0.11a 0.36±0.01a272,6-二叔丁基对苯二酚 4.16±0.19 ND合计 4.80±0.10a 0.36±0.01b醇类28正己醇 0.44±0.01b 0.83±0.09a29正丁醇 ND 0.90±0.0130苯乙醇0.002±0.000 02b0.003±0.000 3a31异戊醇0.002±0.000 8a0.003±0.000 1a32异丁醇 0.01±0.001b 0.02±0.007a33正辛醇 0.98±0.04b 1.99±0.11a34香茅醇 1.09±0.06a 1.51±0.05a合计 2.82±0.49b 5.34±0.12a酸类35辛酸 0.24±0.03a 0.30±0.02a36棕榈酸 0.33±0.03a 0.39±0.03a37乙酸 0.13±0.06a 0.05±0.01b38己酸 0.44±0.01a 0.24±0.01b39异丁酸 ND 0.7±0.27合计 1.19±0.04b 1.72±0.12a醛酮类40苯乙醛 3.03±0.12a 2.36±0.48a41壬醛 2.43±0.17a 1.46±0.08b42苯甲醛 0.65±0.25 ND434-羟基-2-丁酮 2.18±0.16a 2.70±0.24a44香叶基丙酮 3.36±0.22a 2.16±0.17b合计 11.80±0.36a 8.92±0.16b其他451,1-二乙氧基-3-甲基丁烷 1.08±0.06b 1.81±0.17a462-甲基萘 4.46±0.35 ND47萘 0.88±0.01 ND483,4-二甲氧基苯乙烯 2.47±0.31 1.14±0.19合计 9.03±0.71a 2.95±0.06b总量44.29±2.30b48.58±1.48a
注：“ND”表示未检出。
由图3可知,对照组中酯类物质(葵酸乙酯、十四酸乙酯)、甲酸类酯(甲酸丁酯、甲酸己酯、甲酸异丁酯)含量高于强化组,其余酯类含量低于强化组。酚类物质、酸类物质在对照组具有更高的含量,而强化组则在酯类和醇类物质含量上有明显提升,表明W.anomalus NCUF307.1的添加主要改善红曲酒中酯类、醇类物质的含量,丰富酯类物质种类,使红曲酒香气更具复杂性。
图3 对照组与强化组红曲酒的挥发性风味物质层次聚类分析
Fig.3 Hierarchical cluster analysis of volatile aromatic compounds in control and strengthening groups of Hongqu rice wine
注:对照-n,强化-n代表平行组别。
酯类物质是酒体香气的主要贡献者[21]。强化比对照组酯类物质的种类更多,总含量高出100.06%。在2组红曲酒中,酯类物质主要分为乙酸酯类、甲酸酯类、乙酯类。乙酸酯类主要有乙酸乙酯、乙酸异丁酯、乙酸异戊酯、乙酸苯乙酯、乙酸戊酯,这些物质主要表现为花香和果香,提供香蕉、苹果和玫瑰的香气,强化组乙酸酯类物质比对照组提高了29.33%。甲酸酯类共检测出5种物质,其中甲酸丁酯、甲酸己酯、甲酸庚酯表现出类似橙子、菠萝、香草、奶油等香气。乙酯类物质主要有丁酸乙酯、辛酸乙酯、葵酸乙酯、乳酸乙酯等,这些物质主要为酒体提供为果香、奶油香。强化组红曲酒中辛酸乙酯、乙酸异戊酯、苯乙酸乙酯、安息香酸乙酯的气味活性值(odour active value,OAV)均大于1且表现出比对照组更高的水平,是强化红曲酒整体香气的潜在贡献者。产香酵母的增加有助于增加酯类物质的种类和含量,进而提升酒类产品的香气复杂度和深度并改善口感[22]。
酚类物质在提供和调节酒类产品香气特性方面具有复杂的作用,包括影响酒的苦味和涩味。2-甲氧基-4-乙烯苯酚是一种有香气活性的乙烯基芳香族化合物,但其与不受欢迎且具有毒性的苯乙烯类物质同时生成[23]。对照组具有比强化组更高的2-甲氧基-4-乙烯苯酚含量,但也具有更高的3,4-二甲氧基苯乙烯含量,这会对红曲酒产生不良的影响。
醇类物质表现出柔和的香气特征尤其是高级醇类。苯乙醇以玫瑰和花香闻名,异戊醇主要提供香蕉香气且阈值较低,这2种高级醇的含量在强化组得到明显的提升(P<0.05)。强化组正辛醇含量比对照组提升了103.06%,其OAV为16.58,具有柑橘、橙皮、玫瑰香气,增加了混菌发酵组红曲酒香气的复杂性。
酸类物质主要为脂肪酸,当脂肪酸总质量浓度高于20 mg/L时,会对果酒的香气产生负面影响,并带有脂肪和腐臭味[24],2组红曲酒中脂肪酸总质量浓度均未超过2 mg/L,远远不足以对红曲酒的风味造成负面影响。
醛类物质多表现出青草香味和坚果香气。对照组苯甲醛、壬醛含量高于强化组,这2种物质表现出杏仁花香和青草香,可能作为对照组红曲酒的香气主要贡献者。
萘、2-甲基萘具有刺鼻、烟熏、类似焦油的气味,这2种物质只在对照组检出,会对酒体风味产生不良的影响。
采用主成分分析(principal component analysis,PCA)和偏最小二乘判别分析(partial least squares discriminant analysis, PLS-DA)法对红曲酒的挥发性风味物质进行数据多元统计分析。挥发性风味物质的PCA得分图中(图4-A),横纵坐标PC1、PC2为主元得分,即把三维的点投影到二维的位置使映射后的第一个坐标上的方差最大,第一个坐标也就是第一个主成分PC1,以此类推。PC1和PC2的方差贡献率分别为90.70%和6.30%,解释了总方差的96.90%,说明前2个主要成分可以反映红曲酒风味的整体信息,2组红曲酒在PC1被分为两类,说明对照组与强化组红曲酒的关键挥发性风味物质特性存在差异。图4-B展示了PLS-DA的得分图,横纵坐标分别代表第一主成分和第二主成分,展示了原始数据集中各组样本在主成分空间中的分布情况,是一种衡量含量与样本类别之间的关系的模型。PC1和PC2的方差贡献率为95.70%。2组样品的点在得分图中被PC1分离,每组样品的数据均能独立聚集,没有重叠,这一结果与PCA结果相同。由图4-C可知,共有15种挥发性风味物质VIP>1,其中,强化组的特征化合物主要有苯乙酸乙酯、乳酸乙酯、壬二酸乙酯,这些物质赋予了强化组红曲酒更好的果香味与花香味。对照组的特征化合物主要有甲酸酯类、苯甲醛、萘、2-甲基萘等,这些物质使对照组红曲酒有水果香气,但也带来不好的烟熏、焦油气味。
a-PCA得分图;b-PLS-DA的得分图;c-PLS-DA鉴定的重要挥发性化合物
图4 对照组与强化组红曲酒的挥发性特征的多元统计分析
Fig.4 Multivariate statistical analysis of the volatile characteristics of control and strengthening groups of Hongqu rice wine
注:C-对照组;S-强化组。
2.4 红曲酒感官结果分析
以果香、花香、草木香、刺激性气味、酸味、涩味、苦味、甜味、整体感知这9个描述词来表征红曲酒的感官特性。由图5可知,红曲酒的花香、刺激性气味、酸味在2组之间存在统计学上的显著差异(P<0.05)。与对照组相比,强化组红曲酒有显著的花香,这是因为更多的乙酯类物质提供的,W.anomalus NCUF307.1的添加降低了强化组总酸含量,使口感更加柔和,并在整体感知方面得分更高。
图5 红曲酒感官雷达图
Fig.5 Sensory radar chart of Hongqu rice wine注“*”表示差异显著。
3 结论
利用W.anomalus NCUF307.1改善液态法酿造红曲酒的品质,较为全面地考量了其对理化指标、功效成分、挥发性风味物质的影响。结果表明,W.anomalus NCUF307.1的添加降低了红曲酒中的总酸含量,使红曲酒口感柔和,其余理化指标无显著变化,发酵过程可以顺利进行;红曲酒中降血脂成分Monacolin K的含量为56.27 mg/L,总酚、总黄酮含量比对照组分别升高了14.05%、7.98%;红曲酒中香气成分得到改善,酯类、醇类物质的含量升高,主要有乙酸乙酯、丁酸乙酯、乙酸异丁酯、苯乙醇、异戊醇、正辛醇等,其中酯类物质种类也有所增加,萘、2-甲基萘化合物未检出,减少了红曲酒中的不良风味。PCA和PLS-DA结果表明,对照组与强化组红曲酒的关键挥发性风味物质特性存在差异,强化组的特征化合物主要有苯乙酸乙酯、乳酸乙酯、壬二酸乙酯。对照组的特征化合物主要有甲酸酯类、苯甲醛、萘、2-甲基萘等;强化组红曲酒花香味更明显,无刺激性风味,酸度降低,口感更加柔和。以上研究为W.anomalus用于改善红曲酒的品质提供了一定理论基础。
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