桂花(Osmanthus fragrans)是木犀科(Oleaceae)木犀属(Osmanthus)常绿乔木或灌木,又名岩桂,经冬不凋、花小芳香,是我国十大传统名花之一[1-2]。桂花品种繁多,不同品种花香、花色各异,其花朵馥郁芳香、幽雅留长。在酿酒、制茶、饮料等工业生产中,桂花是一种常用的天然调香剂,作为调香、增香具有广泛的应用。桂花除应用于观赏外,还可食用[3-5],花瓣具有丰富的营养物质。研究者发现吸入桂花对于慢性应激大鼠有改善激素水平和胆固醇作用[6];桂花提取精油可用于焦虑患者的辅助治疗[7];多项研究表明桂花中的多酚及黄酮类抗氧化物质具有抗炎、抗肿瘤、治疗炎症、心血管疾病及类风湿关节炎、抑制黑原素产生等作用[8-11];多糖类物质具有抗病毒、抗氧化、抗凝、降低血糖等作用[12-13]。
桂花香气的构成物质复杂,主要包含5个不同的化合物类别,其中以醇类化合物、酮类化合物和萜烯类化合物为主[14],挥发性香气组分作为桂花中最重要的物质之一,直接影响桂花的风味表现,而风味品质和品种密切关联[15]。有研究者考察了不同干燥工艺的桂花浸膏和净油的挥发性成分和香气特征[16];袁金梅等[17]明确了3种不同桂花品种的25种非挥发性香气物质及28种糖苷态香气物质,阐明了桂花的非挥发态香气物质在不同品种间存在较大差异,其中富含的单萜及其衍生物、酯类物质和芳香族化合物可通过不同提取方法释放从而提升花卉产品的香味品质;孙宝军等[18]分析了上海金桂、银桂、丹桂及四季桂的桂花芳香物质39种物质,但缺少对不同品种桂花风味物质差异的深入分析。桂花千百年来在人工不断选育和繁殖的影响下,品种众多,目前桂花品种分类主要依据花期、花色、花型、花香,然而,研究者发现通过这一分类的亲缘关系鉴定有一定的偏差,说明单从花部某些特殊性状分类已无法满足桂花品种鉴定与分类;其次,不同品种桂花风味风格差异,在产品开发中需要明确香气特征,鉴于以上原因,本实验选取四川成都地区9个桂花品种进行风味成分检测及分析,明确不同品种桂花风味物质差异和特征性风味物质,以期探索从风味物质对四川桂花品种进行区分,并为桂花风味品控、质量鉴定以及产业加工提供重要依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
桂花样品采集于四川成都市温江,共9个品种,分别是金桂品种群[Osmanthus fragrans (Luteus Group)]3个:波叶金桂‘Boye Jinggui’、柳叶金桂‘Liuye Jin’、速生金桂‘Susheng Jin’;银桂品种群[Osmanthus fragrans(Albus Group)]2个:中华龙桂‘Zhonghua Longgui’、阔叶早银桂‘Kuoye Zaoyin Gui’;丹桂品种群[Osmanthus fragrans(Aurantiacus Group)]3个:堰虹桂(堰红桂)‘Yan Hong’、硃砂桂(朱砂桂)‘Zhushagui’、汉桂‘Hangui’以及四季桂品种群[Osmanthus fragrans(Semperflorens Group)]1个:日香桂‘Rixiang Gui’。采集后去除杂质在-4 ℃冷链进行运输至实验室,然后用聚乙烯封口袋密封,保存于-80 ℃冰箱中备用。
分析纯化学品,成都西陇科学股份有限公司;正己烷,色谱纯,上海Sigama-Aldrich公司;丙酸苏合香酯,色谱纯,上海阿拉丁生化科技股份有限公司;正构烷烃(C7～C40),色谱纯,英国o2 si smart solutions公司;超纯水,实验室自制。
1.2 仪器与设备
ME20A电子分析天平,瑞士Mettler-Toledo公司;GCMS-QP2020气相色谱-质谱联用仪,日本岛津公司;固相微萃取(solid phase microextraction,SPME)装置、DVB/CAR/PDMS固相微萃取头,美国Supelco公司;501A型超级恒温器,上海实验仪器厂有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 GC-MS测定
DVB/CAR/PDMS固相微萃取头按操作说明在气相色谱进样口老化,老化温度为250 ℃,老化时间1 h。称取冷冻保存桂花1 g,加入到20 mL样品瓶中,加入8 mL超纯水,3.5 g氯化钠和200 μL丙酸苏合香酯为内标,最终质量浓度为1 g/L。然后用聚丙烯瓶盖和聚四氟乙烯/硅胶隔垫密封,将密封好的样品瓶置于恒温水浴中,70 ℃下平衡30 min,插入固相微萃取萃取头,将DVB/CAR/PDMS萃取纤维置于样品瓶顶空气相中,萃取60 min。萃取完成后,将萃取头插入GC-MS系统中进行热解析,解析5 min进行进样分析。正构烷烃混标用于保留指数(retention index, RI)计算。
色谱柱Rti-5SilMS(30 m×0.25 mm×0.25 μm),进样口温度250 ℃,载气氦气(99.999%),柱流量1.50 mL/min,线速度44.4 cm/s,不分流。程序升温:初始温度50 ℃下保持2 min,以4 ℃/min升温到160 ℃,再以8 ℃/min升温到210 ℃,保持5 min。溶剂延迟4 min,进样量1 μL。
质谱条件:EI离子源:电离电压70 eV;离子源温度250 ℃;接口温度250 ℃;全扫描模式,扫描质量范围m/z 35～500。
基于质谱(mass spectrum,MS)和RI定性鉴定化合物,保留指数是根据改进的Kovats法计算得到的,表征物质在固定相上的保留行为。未知化合物保留指数根据未知化合物和正构烷烃的保留时间来计算得到。对数据总离子图峰进行质谱计算机NIST14数据库检索、人工解析图谱及文献匹配后结进行对比确认。通过配制正构烷烃混标溶液,在相同分析条件下进行正构烷烃混标检测得到正构烷烃保留时间,结合保留指数进行筛选。以丙酸苏合香酯(1 mg/mL)为内标[16],采用内标法[19]计算相应物质浓度。
1.3.2 相对气味活度值(relative odor activity value,ROAV)分析
ROAV可用于评估单体化合物对风味的贡献,通过计算相关文献提供的挥发性成分在水中的香气嗅闻阈值计算得到(相对气味活度值=挥发性物质浓度/香气嗅闻阈值)。
1.4 数据处理
实验重复3次,结果以“平均值±标准差(standard deviation, SD)”表示。采用联川生物平台对数据进行处理并绘制图形以及主成分分析(principal components analysis, PCA)。采用IBM SPSS Statistics 22.0软件进行方差分析,P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果与分析
2.1 不同品种鲜桂花挥发性成分分析
经过考察波叶金桂(BYJG)、柳叶金桂(LYJ)、速生金桂(SSJ)、中华龙桂(ZHLG)、阔叶早银桂(KYZYG)、堰虹桂(YH)、硃砂桂(ZSG)、汉桂(HG)、日香桂(RXG) 9种桂花中的挥发性香气成分,共鉴定出61个香气化合物[附表1(https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.040368)],将这61个化合物分为八大类,包括醇类化合物(8),醛类化合物(13)、酮类化合物(10)、萜烯化合物(14),、烷烃类化合物(2)、酸类化合物(3)、酯类化合物(8)、其他化合物(3)。
表1 不同桂花中主要香气成分的阈值及气味活度值
Table 1 The threshold and odor activity values of major aroma components in vary Osmanthus fragrans kinds and absolute
化合物阈值/(mg/kg)ROAV金桂银桂丹桂四季桂BYJGLYJSSJZHLGKYZYGYHZSGHGRXG香气描述二氢-β-紫罗兰醇0.003[13]49.979.2446.033.036.918.877.975.633.72紫罗兰花香γ-壬内酯0.007 9[13]1.110000000.210果香,桃子,草莓二氢猕猴桃内酯0.001 5[13]4.49000024.1315.4414.970油脂香,果香,麝香,豆素样香气(E,E)-2,4-庚二烯醛0.049[18]3.734.142.231.992.482.291.481.570.97脂肪,清香苯乙醛0.004[20]16.2118.2011.78010.9810.0027.2833.939.43蜜甜花香香叶基丙酮0.06[21]0.990.2700.320.840.991.711.110.18花香,淡木香反式-芳樟醇氧化物(呋喃型)0.1[25]0.361.050.360.360.680.330.931.240.43果香,柑橘香,花香香叶醇0.001 1[25]29.34041.67290.4521.0214.408.657.11玫瑰香,果香二氢-β-紫罗兰酮0.001[25]220.92106.22291.915.1218.9222.0431.3541.0474.31果香,带木香底蕴己醛0.005[26]05.734.4715.316.133.655.177.552.77青香α-紫罗兰酮0.006[27]6.3710.823.0101.539.2410.377.831.21木香,花香顺式-芳樟醇氧化物(呋喃型)0.006[28]1.993.210.270.240.910.671.972.610.75花香,陈香,木香β-月桂烯0.015[28]1.041.081.982.083.551.341.421.741.32花香,果香β-紫罗兰酮0.5[29]0.280.590.9700.050.190.170.120.41木香,花香γ-癸内酯0.09[30]3.740.262.000.340.734.065.005.360桃香,草莓香,果香(E)-柠檬醛0.04[30]000.363.1000000.06柠檬香,柑橘香(E)-2-己烯醛0.05[30]01.16000.450.220.580.420青香芳樟醇0.002 4[30]85.1840.0977.758.1536.5153.9554.884.513.09花香,铃兰香,陈香
由附表1(https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.040368)可知,4个桂花品种群中,从挥发性香气物质种类上来看,金桂群(31～36)比银桂群(25～30)、丹桂群(31～33)、四季桂群(28)更为丰富;从挥发性物质总含量上来看,金桂群也明显高于银桂群和四季桂群(P<0.05),其中波叶金桂挥发性香气化合物含量最高[(2 725.35±155.17) μg/kg],速生金桂次之[(2 206.18±160.66) μg/kg],日香桂含量最低[(773.60±68.10) μg/kg]。其中,速生金桂中对甲氧基苯乙醇物质含量[(553.51±11.07) μg/kg]远高于其他物质,但仅在波叶金桂、中华龙桂和日香桂中被检测到;其次为γ-癸内酯和二氢-β-紫罗兰酮。
将桂花中的风味物质成分及含量进行差异性分析(图1)。醇类物质、醛类物质、酮类物质、萜烯类物质是含量最大差异性较大的成分,烷烃类只存在于少数桂花品种。其中,波叶金桂醇类物质含量达到最高值[(806.28±155.17) μg/kg,P<0.05],而速生金桂主要是酮类和萜烯类含量最高。对甲氧基苯乙醇、二氢-β-紫罗兰醇、β-苯乙醇含量较高,波叶金桂含量明显高于其他桂花品种(P<0.05),其中甲氧基苯乙醇在波叶金桂中最高[(553.51±11.07) μg/kg],中华龙桂含量次之[(390.32±41.13) μg/kg],在其他品种中未见检测。醇类物质的区别可能是导致不同桂花品种香气成分含量较大的因素。二氢-β-紫罗兰酮是所有品种共有的酮类物质,速生金桂含量最高[(291.91±25.84) μg/kg];银桂群含量最低,其中又以中华龙桂品种含量最低[(5.12±0.84) μg/kg]。
a-醇类物质的差异性比较;b-醛类物质的差异性比较;c-酮类物质的差异性比较;d-萜烯类物质的差异性比较;e-酸类物质的差异性比较;f-酯类物质的差异性比较;g-烷烃类的差异性比较;h-其他类物质的差异性比较;i-桂花风味物质总量差异性比较
图1 桂花不同风味物质含量差异性数据示意图
Fig.1 Data diagram of contents difference of different flavor substances in Osmanthus fragrans flower
注:不同小写字母表示差异显著(P<0.05)(下同)。
萜烯作为桂花中最常见的化合物,主要体现为β-月桂烯、柠檬烯、芳樟醇和芳樟醇氧化物类化合物,其中芳樟醇物质含量最高。此次还检测确定8种酯类化合物,包括具有水果香、花香的γ-癸内酯和棕榈酸乙酯。烷烃类和酸类物质含量相对较少,波叶金桂中包含此次检测出的3种酸,天竺葵酸[(18.76±0.37) μg/kg]、棕榈酸[(1.62±0.03) μg/kg]、亚油酸[(3.65±0.07) μg/kg],天竺葵酸和亚油酸仅见于波叶金桂;2种烷烃类物质在阔叶早银桂中最多,其次为硃砂桂。
如附表1(https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.040368)所示,不同品种桂花香气化合物组成和含量均呈现不同的特点。金桂群中,波叶金桂和柳叶金桂最主要的挥发性物质为醇类化合物、酮类化合物、醛类物质和萜烯化合物。波叶金桂解析出36个化合物,其中醇类化合物5个,占总含量的29.58%;酮类化合物7个,占总含量的18.42%;萜烯化合物6个,占总含量的16.53%。柳叶金桂主要为醛、酮类化合物,醛类化合物9个,占总含量的30.02%;酮类化合物6个,占总含量的30.37%;萜烯化合物7个,占总含量的27.88%。速生金桂主要为酮类化合物和萜烯化合物,酮类化合物8个,占总含量的39.49%;萜烯化合物10个,占总含量的29.79%;醇类化合物2个,占总含量的8.31%。银桂群中主要香气化合物体现为醇类、醛类及萜烯类。其中,中华龙桂主要为醇类化合物3个,占总含量的32.70%;萜烯化合物9个,占总含量的36.06%。阔叶早银桂含量比例较高的化合物为醛类化合物8个,占总含量的31.20%;萜烯化合物7个,占总含量的34.84%。需要说明的是,虽然波叶金桂的酮类物质和萜烯化合物含量较低,但是醇类物质含量远高于其他品种(P<0.05),使得波叶金桂花香、果香明显,花香浓郁。阔叶早银桂中萜烯类物质占比达到34.84%,但是萜烯总量[(432.46±36.69) μg/kg]和速生金桂总量[(450.37±26.19) μg/kg]并无显著性差异。
当样品种类较多时,UPSET图可较好地展示品种间的交集。图2展示了9种桂花品种的交集数量和交集情况,波叶金桂所含化合物数量最为丰富,而中华龙桂最少;其次,9个品种的交集化合物有9个,分别是二氢-β-紫罗兰醇、苯甲醛、(E,E)-2,4-庚二烯醛、二氢-β-紫罗兰酮、β-月桂烯、柠檬烯、反式-芳樟醇-氧化物(呋喃型)、顺式-芳樟醇氧化物(呋喃型)、芳樟醇。对于金桂群和银桂群来说,此次检测醇类芳香物质偏高,使得整体花香呈现为果香、花香;丹桂的醇类物质较低,但其酮类化合物含量较高,整体花香呈现为木香、花香;α-紫罗兰酮及β-紫罗兰酮含量偏低导致银桂群品种的甜香偏淡。此前文献有汇报到丹桂和四季桂体现为清新淡雅,金桂因酮类物质及γ-癸内酯含量高而香气甜润馥郁,丹桂则因为酮类物质及芳樟醇类物质偏低则清香不足[20-21],与本实验的结论有所偏差。分析原因可能是因为桂花香气成分的体现会受到地理气候、地理分布、采摘季节、花茬数、温度和处理工艺不同而呈现差异[22-23]。
图2 桂花风味物质的UPSET图
Fig.2 The UPSET graphical representation of Osmanthus fragrans flavor substances
2.2 主成分分析评价不同品种桂花风味物质
为进一步区分不同品种桂花的香气成分,将61种挥发性成分作为因变量,不同品种作为自变量,对挥发性成分进行主成分分析。分析结果如图3所示,9种桂花呈现明显的区域分布特点,金桂群中3个品种和丹桂群的3个品种集中分布,银桂群的2个品种分布较为分散,PCA1和PCA2对样本差异解释度分别为57.83%和16.88%,两轴解释度之和接近80%,能较好反映样本间的相似及差异性。不同品种桂花的成分差异较小,但是含量存在一定差异,且这种不同的差异导致不同桂花香味的差异呈现区别,该结论与此前论文研究结果一致[22,24]。
图3 桂花挥发性化合物PCA得分图
Fig.3 PCA score chart of volatile compounds ofOsmanthus fragrans flower
2.3 不同品种桂花关键特征性香气成分分析
风味物质的含量和阈值对于样本的香气轮廓贡献具有重要意义,直接决定了ROAV的大小。ROAV可用于评价各香气化合物对桂花香气特征的贡献,一般认为ROAV>1的风味物质为关键香气物质,其值越大,贡献越大。表1列出了桂花中ROAV>1的18种关键香气化合物。由表1可知桂花中对香气有贡献的主要有两类:具有青草香特征的化合物包括己醛、(E)-2-己烯醛、(E,E)-2,4-庚二烯醛;具有花香、果香特征的化合物如苯乙醛、α-紫罗酮、二氢-β-紫罗兰酮、香叶基丙酮、α-紫罗兰酮、β-紫罗兰酮、β-月桂烯、cis-芳樟醇氧化物(呋喃型)、trans-芳樟醇氧化物(呋喃型)、芳樟醇、香叶醇、γ-癸内酯、二氢猕猴桃内酯、γ-壬内酯。其中,具有木香、果香的的二氢-β-紫罗兰酮(5.12～291.91)在波叶金桂中有最大的ROAV,在其他8种品种桂花中也有较高贡献,是桂花香味的重要贡献化合物,可作为区别不同品种桂花的特征物质。γ-癸内酯在桂花中含量较多,但其阈值与二氢-β-紫罗兰酮和芳樟醇相比更大,导致γ-癸内酯的ROAV更小。其余较高ROAV的化合物是芳樟醇(8.15～85.18)、二氢-β-紫罗兰醇(3.03～49.97)。
二氢-β-紫罗兰酮是β-紫罗兰酮的氢化形式,具有比β-紫罗兰酮更低的阈值,又比二氢-β-紫罗兰醇更稳定,是桂花和桂花精油的特征性物质[32]。芳樟醇属于萜烯醇类风味代表物质,常见于茶叶、桂花、花椒等植物中。这些低阈值和高ROAV的物质由于其令人愉悦的香味,被广泛应用于香水、香料以及食品加工产业,GB 29957—2013《食品安全国家标准 食品添加剂 二氢-β-紫罗兰酮》已经将二氢-β-紫罗兰酮列为一种食品添加剂。天然提取的风味物质因为植物资源有限、分离难度高等因素,目前一些学者将这类高价值的风味物质转向化学合成、生物酶体外催化转化和微生物发酵合成制备。二氢-β-紫罗兰酮主要是通过化学合成获得,即通过磷酸甲基赤藓醇(methylerythritol phosphate, MEP)/1-脱氧木酮糖-5-磷酸途径(1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate pathway, DXP)途径和甲羟戊酸(mevalonate, MVA)途径先合成萜类化合物的前体异戊烯基焦磷酸(isopentenyl diphosphate, IPP)和二甲基烯丙基焦磷酸(dimethylallyl diphosphate, DMAPP),随后在胡萝卜基因簇的作用下合成β-胡萝卜素,最后在关键酶植物类胡萝卜素裂解双加氧酶(plant carotenoid cleavage dioxygenase, CCD)和转录因子等的作用下发生氧化裂解得到β-紫罗兰酮,再经过脱氢即可得到二氢-β-紫罗兰酮。目前,通过大肠杆菌、酿酒酵母以及解脂耶氏酵母等合成生物学研究较多,桂花中ROAV较高的化合物二氢-β-紫罗兰酮、二氢-β-紫罗兰醇以及芳樟醇的异源表达合成路线如图4所示[33-35]。造成不同品种桂花的风味物质区别的原因可能是由于体内CCD、TPP等酶和细胞内乙酰辅酶A的积累差异造成。
图4 二氢-β-紫罗兰酮和芳樟醇等萜烯化合物的异源生物合成途径
Fig.4 The biosynthetic pathway of dihydro-β-ionone and terpene compounds such as linalool
注:DHAP (dihydroxyacetone phosphate):磷酸二羟基丙酮;DAG (diacylglycerol):二脂酰甘油;TPP (thiaminepyrophosphate):焦磷酸硫胺素;G3P (glyceraldehyde 3-phosphate):甘油醛-3-磷酸;HMGS (3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A synthase):羟甲基戊二酰辅酶A合酶;HMGR (3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase):3-羟基-3甲基戊二酰辅酶A还原酶;GPP (geranyl pyrophosphate):香叶基焦磷酸;PMK (phosphomevalonate kinase):磷酸甲羟戊酸激酶;MVAPP(pho-sphormevalonate):焦磷酸甲羟戊酸;idi (isopentenyl diphosphate isomerase):异戊烯基焦磷酸异构酶;FPP (farnesyl pyrophosphate):法尼基焦磷酸;LIS (linalool synthase):芳樟醇合成酶;GGPP (geranylgeranyl pyrophosphate):香叶基香叶基焦磷酸合酶;CarRP:番茄红素环化酶/八氢番茄红素合酶;CarB:八氢番茄红素脱氢酶。绿色箭头表示的引入外源酶所催化的生化反应,黑色箭头表示内源存在的生化反应。
3 结论与讨论
影响花、叶类产品的质量因素较多,其中风味是影响这类产品质量的重要因素之一。本实验通过对9个品种的桂花进行挥发性成分检测及主成分分析、香气阈值考察,明确了不同品种桂花风味差异来源,为桂花品种分类及产业加工提供依据,并为四川地区桂花品种鉴定、质量标准建立提供数据参考。
实验共解析出61种香气成分。结果表明,在挥发性物质种类数量和总含量上金桂相比银桂、丹桂、四季桂更为丰富(P<0.05);其次,波叶金桂中的5种醇类物质含量贡献达到29.58%,其中对甲氧基苯乙醇含量最高,也是波叶金桂区别于其他品种桂花大量存在的化合物。α-紫罗兰酮、β-紫罗兰酮、二氢-β-紫罗兰酮、香叶基丙酮、芳樟醇及芳樟醇氧化物(呋喃型)、香叶醇、γ-癸内酯、β-苯乙醇、二氢-β-紫罗兰醇、己醛、苯甲醛、(E,E)-2,4-庚二烯醛和壬醛是9种品种桂花的共有物质。进一步的主成分分析表明,不同品种桂花群具有区分度,差异在于物质含量的多少。18个ROAV>1的特征香气成分中,二氢-β-紫罗兰酮是桂花中最重要的香气贡献者,体现为花香、木香、果香。芳樟醇、(E,E)-2,4-庚二烯醛、二氢-β-紫罗兰醇、α-紫罗兰酮、β-月桂烯、香叶醇、α-紫罗酮、γ-癸内酯等化合物也是桂花的重要香气贡献组分。总体而言,金桂群品种在贡献花香、果香、木香的风味特征和物质含量上有较大的优势,更适合进行花果香型产品的复配和开发。
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