麦麸是小麦加工工业的主要副产物,我国麦麸年产量为3 300万t,约占小麦加工量的20%。麦麸中富含维生素B族、维生素E、胡萝卜素,以及钾、磷、钙和镁等矿物质[1],具有调节血糖水平、预防高血压、促进肠道蠕动、防止便秘和预防结肠癌等功能特性[2]。同时,麦麸中含有18种氨基酸,包括人体必需的所有氨基酸。有研究表明,麦麸蛋白中的多种氨基酸比小麦蛋白具有更好的生理功能和营养价值[3]。近年来,大众对于均衡膳食结构的关注度提高,开发全麦制品对于提高全民健康水平具有重要意义。
然而研究表明,直接添加麦麸会弱化面筋蛋白网络结构[4],对面团产生不良影响进而影响制品的品质。此外,麦麸膳食纤维中含有大量吸水能力较强的羟基基团,在面团形成的过程中与面筋争夺水分子从而阻碍面筋网络结构的形成[5]。其中,麦麸添加量、麦麸粒度、麦麸本身的结构和性质等均会影响全麦制品的品质。为了提高麦麸在食品中的利用率,通常对麦麸进行预处理以减弱其对食品的不利影响。生物发酵处理方法是目前改善麦麸特性的一种有效方法,以乳杆菌属(Lactobacillus)为主的乳酸菌是食品发酵工业中应用很广泛的菌种,乳酸菌发酵过程产生的以乳酸为主的有机酸不仅可以降低基质的pH,抑制发酵过程中杂菌的生长,而且能够激活麦麸基质中存在的酶,有利于麦麸分解。此外在发酵过程中,乳酸菌在生长过程中产生的植酸酶等相关酶系能够降解麦麸中不能被人体直接利用的特定组分,减少营养物质的破坏,从而提高营养物质的吸收利用率。乳酸菌液态发酵效果较好,然而在固态基质中发酵进程较为缓慢。研究表明,米曲霉发酵麦麸产生的小分子物质可以为乳酸菌的生长提供小分子糖类与氨基酸,可以有效促进麦麸固态发酵产生更好的效果[6]。同时,米曲霉与乳酸菌发酵产生的风味物质,与麦麸中的风味物质结合能够减弱麦麸异味,提升食品口感。
因此,本研究拟在前期研究的基础上,利用布氏乳杆菌-米曲霉协同发酵处理麦麸,通过添加不同比例发酵前后的麦麸,测定混合粉的粉质特性、糊化特性、面筋含量、巯基/二硫键含量、蛋白质二级结构及电泳特性,探究生物复合发酵麦麸对面团特性的影响,为全麦食品的开发提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 实验材料
麦麸,益海嘉里集团;小麦粉,市售中粮神象高筋粉;布氏乳杆菌(Lactobacillus buchneri)KY828224、米曲霉(Aspergillus oryaze)KU320673,中国农业大学工学院饲料调制与加工实验室分离纯化保藏;MRS培养基、PDA培养基,北京奥博星生物技术有限责任公司;SDS-PAGE凝胶制备试剂盒,北京索莱宝科技有限公司。
1.2 仪器与设备
生化培养箱,韶关泰宏公司;手提式高压蒸汽灭菌锅,上海申安医疗器械厂;混合实验仪,法国肖邦技术公司;快速黏度分析仪,瑞典PERTEN公司;面筋仪、电加热干燥器,北京东孚久恒仪器技术有限公司;离心机,德国Eppendorf仪器有限公司;傅里叶红外光谱仪,北京锐利分析仪器公司;凝胶成像仪、电泳仪,北京六一生物科技有限公司;紫外分光光度计,尤尼柯(上海)仪器有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 菌种活化
布氏乳杆菌活化:将菌株冻存液接种至5 mL MRS液体培养基中于37 ℃培养24 h,传代2次后转入50 mL MRS液体培养基中,于37 ℃下培养24 h,梯度稀释确定布氏乳杆菌浓度,制得菌体悬浊液,于4 ℃条件下保存待用。
米曲霉活化:挑取4 ℃斜面保存的菌丝接种至PDA平板上活化,于28 ℃培养箱中培养4～6 d至平板上长满孢子,使用无菌水冲洗收集孢子于锥形瓶中,制成孢子悬液备用。使用血球计数板确定孢子悬液的浓度,制得孢子悬浊液,于4 ℃条件下保存待用。
1.3.2 布氏乳杆菌-米曲霉共培养实验
采用双层平板划线法对布氏乳杆菌与米曲霉进行共培养实验[7]:将布氏乳杆菌培养至对数期,于MRS固体培养基上划线(3 cm),37 ℃培养24 h后倒入含有1%米曲霉孢子菌悬液的PDA平板上,置于28 ℃恒温生化培养箱中培养,观察其生长情况。
1.3.3 麦麸发酵
称取50.0 g麦麸于250 mL锥形瓶中,121 ℃高压蒸汽灭菌20 min,冷却后使用无菌水调节水分至60%,按照布氏乳杆菌-米曲霉2∶3的复配比例接种进行发酵,总接种量设置为108 CFU/g(湿基)。混匀后使用透气封口膜密封后于31 ℃生化培养箱中发酵3 d,培养结束后烘干至恒重,粉碎后过100目筛。
1.3.4 混合粉的制备
将发酵前后的麦麸分别添加到小麦粉中,添加量分别为混合粉质量的3%、6%、9%、12%、15%(质量分数),4 ℃冰箱保存备用。
1.3.5 混合粉粉质特性的测定
采用Mixolab2肖邦混合实验仪对混合粉面团流变学特性进行测定。使用“Chopin s”实验协议,加热模块温度为30 ℃,以水分基数14%、目标扭矩(1.1±0.05) Nm为标准并根据样品的水分含量计算称样量及加水量。
1.3.6 混合粉糊化特性的测定
使用快速黏度分析仪,参照GB/T 24853—2010进行测定,按照14%湿基进行校准确定称样量及加水量。
1.3.7 混合粉面筋含量的测定
湿面筋含量的测定:参照GB/T 5506.2—2008《小麦和小麦粉面筋含量第2部分:仪器法测定湿面筋》测定;干面筋含量测定:参照GB/T 5506.4—2008《小麦和小麦粉面筋含量第4部分:快速干燥法测定干面筋》测定。
1.3.8 混合粉面筋蛋白巯基/二硫键含量的测定
称取15.0 g混合粉,按照GB/T 5506.2—2008《小麦和小麦粉面筋含量第2部分:仪器法测定湿面筋》洗出面筋,真空冷冻干燥48 h后粉碎备用。测定参照徐茹等[8]的方法进行。准确称取150 mg样品,加入1 mL tris-甘氨酸缓冲液中,混匀后加入4.7 g盐酸胍,并用tris-甘氨酸缓冲定容至10 mL作为待测液。
游离巯基的测定:取1 mL样液,与5 mL 8 mol/L的脲溶液混匀后加入0.1 mL Ellman’s试剂,混匀后于412 nm处测得吸光度值,巯基含量的测定如公式(1)所示。
总巯基含量的测定:取1 mL待测样液,与5 mL 8 mol/L的脲溶液混合,加入0.1 mL巯基乙醇,于室温反应1 h后加入10 mL 12%的三氯乙酸溶液,继续于室温反应1 h,5 000 r/min离心10 min后弃上清液,沉淀用三氯乙酸洗涤后溶于10 mL 8 mol/L的脲溶液中,加入0.08 mL Ellman’s试剂。取1 mL该溶液并加入5 mL Tris-甘氨酸缓冲液,混匀后于412 nm测得吸光度值,总巯基含量的测定如公式(1)所示,二硫键含量测定如公式(2)所示:
(1)
(2)
式中:D为5.02(游离巯基)和10(总巯基);C,样液质量浓度,mg/mL,本实验样液质量浓度为15 mg/mL;N2,总巯基数;N1,游离巯基数。
1.3.9 混合粉蛋白质二级结构的测定
精确称取2 mg面筋蛋白样品,在红外干燥灯下将样品与KBr按照1∶200(质量比)于干燥清洁的玛瑙研钵中充分研磨均匀。后使用压片机压成均匀透明的薄片放入红外光谱仪中进行扫描。扫描参数为扫描范围4 000～400 cm-1,分辨率为4 cm-1,扫描次数32次。
图谱使用Peakfit 4.0软件进行基线校正、去卷积、二阶导数拟合处理,依据各峰与二级结构对应关系计算各结构含量。
1.3.10 混合粉电泳特性的测定
样液制备:准确称取30 mg样品于2 mL离心管中,加入1 mL提取液,2 000 r/min振荡混匀1 h后静置1 h,于沸水浴中加热5 min,待冷却后12 000×g离心10 min,上清液为待测液。
浓缩胶质量分数为5%,分离胶质量分数为12%,样品上样量为18 μL。恒压电泳,电流为25 mA,浓缩胶电压为80 V,分离胶电压为100 V。电泳结束后,电泳胶片先固定3 h后,再染色,脱色结束后,用凝胶成像仪进行成像。
1.4 数据处理
本试验数据采用IBM SPSS Statistics for Windows(Version 16.0)软件进行单因素方差分析,并做Duncan多重比较,显著水平设置为P<0.05。
2 结果与分析
2.1 混合粉的粉质特性
混合粉的粉质特性结果如表1所示,添加麦麸后,混合粉的吸水率随麦麸添加量的增加显著升高。与未发酵组相比,发酵组麦麸添加量低于6%时混合粉的吸水率与纯小麦粉无显著差异。麦麸中不溶性膳食纤维(insoluble dietary fiber,IDF)含量较高,存在的羟基结构与水形成大量氢键,面团的水合能力提高,吸水率增加。此外,戊聚糖是麦麸中重要的非淀粉多糖[9],其分子质量大、支链较多,分子间的相互作用较强,可结合大量水分,具有高黏度、高持水性的特点,这些作用均能够使混合粉的吸水率增加,这与张慧娟等[10]研究结果一致。麦麸经微生物作用后,大分子质量的物质被酶解成小分子质量的物质,网络结构变松散,吸水能力下降[11]。因此,同一添加量下发酵组混合粉吸水率较未发酵组吸水率低。
表1 混合粉的粉质特性
Table 1 Farinograph property of recombinant flour
添加量(质量分数)/%吸水率/%形成时间/min稳定时间/min弱化度/Nm063.70±0.42c4.94±0.64d10.45±0.21a0.01±0.01c364.85±0.07b5.95±0.07c9.30±0.28a0.10±0.01b未发酵665.10±0.00ab6.70±0.00ab6.30±0.13b0.14±0.01a965.45±0.07a6.00±0.14bc6.00±0.14b0.16±0.00a1265.25±0.07ab6.90±0.14a5.40±0.42b0.15±0.00a1565.50±0.14a7.15±0.21a6.30±0.42b0.15±0.01a063.70±0.42cd4.95±0.64ab10.45±0.21a0.01±0.01b363.45±0.07d4.35±0.64b10.00±0.28a0.03±0.02b发酵663.95±0.12c5.00±0.00ab8.20±0.28b0.05±0.00a964.25±0.14b5.35±0.21a7.45±0.49b0.06±0.01a1264.60±0.14a5.50±0.00a6.50±0.42c0.06±0.00a1565.05±0.07a5.65±0.07a5.80±0.14c0.07±0.00a
注：同列不同小写字母间差异显著(P<0.05)(下同)。
形成时间是面团从开始搅拌到最大稠度所需的时间,反映面筋网络形成的速度。未发酵组混合粉面团形成时间随着麦麸添加量的增加显著延长,发酵组混合粉形成时间较未发酵组短。麦麸膳食纤维具有较强吸水能力,可与面筋蛋白争夺水分子,延长面团体系的吸水时间,从而导致面筋网络结构形成时间延长,且面团的形成时间越长,面筋筋力越弱[12]。发酵组混合粉较未发酵组形成时间短,表明发酵后面团的筋力增强。稳定时间及弱化度也可反映面团稳定性及面筋强度,面团的筋力强,稳定时间延长,弱化度低。混合粉面团的稳定时间随着添加量的增加显著降低,麦麸添加量低于9%时,发酵组混合粉稳定时间显著高于未发酵组。当添加质量分数高于3%时,发酵组和未发酵组组内的弱化度均无显著差异,同一添加量下发酵组弱化度显著低于未发酵组。麦麸经发酵后可溶性成分增加,不溶性成分相对降低,在一定程度上减弱了不溶性成分与面筋蛋白争夺水分子的作用。综合而言,发酵组面团筋力强,稳定性更高,但添加量过高仍会稀释面筋蛋白,不利于形成稳定的面团结构。
2.2 混合粉的糊化特性
混合粉糊化特性结果如表2所示,随着麦麸添加量的增加,混合粉的峰值黏度、谷值黏度、最终黏度、衰减值及回生值均显著降低,这与仇成功等[13]的研究结果一致。峰值黏度的变化与混合粉中麦麸含量有关,添加麦麸后淀粉含量被稀释,同时麦麸的存在会阻碍面糊吸收水分,改变了糊化体系中的水分活性状态,减弱淀粉颗粒间的摩擦程度,从而导致黏度降低[14]。在麦麸添加量相同的条件下,发酵组混合粉的黏度显著高于未发酵组。淀粉糊化峰值黏度越高,对面制品的食用品质越有利,发酵处理后的麦麸能够显著改善麦麸制品的品质。回生值为最终黏度和最低黏度的差值,反映了淀粉抗老化性能的大小,一定程度的回生值对淀粉的凝胶强度具有积极的作用[15]。添加麦麸后,混合粉中膳食纤维含量增加,在糊化过程中与面粉竞争水分子,阻碍淀粉的充分糊化,导致回生值降低[16]。未发酵组混合粉的糊化温度高于小麦粉,且随麦麸添加量的增加而升高,这与陈建省等[17]的研究结果一致,由于麦麸的存在阻碍了水分与淀粉颗粒的结合,减少了糊化体系中的可利用水,淀粉不易吸水膨胀,改变了混合粉的热力学特性从而影响了淀粉的糊化特性。当发酵麦麸添加量低于9%时混合粉的糊化温度低于小麦粉。
表2 混合粉的糊化特性
Table 2 Gelatinization characteristics of recombinant flour
添加量(质量分数)/%峰值黏度/(mPa·s)谷值黏度/(mPa·s)衰减值/(mPa·s)最终黏度/(mPa·s)回生值/(mPa·s)峰值时间/min糊化温度/℃04 005±31.11a2 552±6.36a1 483±64.35a4 406±16.26a1 877±9.19a6.24±0.05a67.38±0.53b32 233±12.73c1 334±4.24b 899±8.49c2 674±15.56b1 340±11.31d6.07±0.00b67.75±0.00b未发酵61 960±41.01d1 083±19.09d 878±21.92c2 323±36.06c1 240±16.97e5.90±0.04cd68.10±0.49b91 829±24.04e 974±7.07e 855±16.97c2 259±41.72c1 285±34.65de5.87±0.00d69.30±0.07a122 397±8.49b1 182±30.41c1 216±21.92b2 707±88.39b1 525±57.98c5.93±0.00cd67.65±0.00b152 245±12.02c1 103±12.02d1 142±0.00b2 724±15.56b1 622±3.54b5.97±0.05c67.68±0.04b04 005±31.11a2 552±6.36a1 482±64.35ab4 406±16.26a1 877±9.19a6.24±0.05a67.38±0.53ab33 805±28.99b2 357±24.04b1 448±4.95ab4 170±45.96b1 813±21.92b6.20±0.00a66.93±0.04b发酵63 715±87.68bc2 208±63.64c1 507±24.04a4 021±84.15c1 813±20.51b6.10±0.04b66.93±0.04b93 636±12.73c2 127±45.96c1 490±4.95ab3 846±24.04d1 715±15.56c6.21±0.01a67.70±0.00ab123 487±7.78d2 041±0.71d1 446±7.07ab3 681±0.71e1 640±0.00d6.17±0.05ab68.13±0.53a153 323±12.02c1 900±0.71e1 423±11.31b3 469±9.90f1 570±10.61e6.10±0.04b68.10±0.57a
2.3 混合粉的面筋含量
面筋是麦谷蛋白和麦醇溶蛋白通过二硫键聚合而成的一种凝聚物,面筋含量与制品品质密切相关,是决定小麦粉加工品质的一项重要指标。图1为添加不同比例麦麸时混合粉的湿面筋和干面筋含量。加入麦麸后,2组混合粉面团面筋含量均显著降低。麦麸添加取代了小麦粉,当添加量高于6%时,形成面筋的麦谷蛋白和醇溶蛋白的含量降低[18],未发酵组混合粉的面筋含量呈明显的下降趋势。当添加量高于9%时,麦麸会严重阻碍面筋蛋白之间的交联,影响面筋结构的形成,洗涤过程中面筋可能出现损失,导致其含量显著降低。由于发酵处理麦麸可以减小麦麸对面团的负面影响,相同添加量下发酵组混合粉的面筋含量显著高于未发酵组,这与混合粉的粉质特性结果一致。
a-混合粉湿面筋含量;b-混合粉干面筋含量
图1 混合粉面筋含量
Fig.1 Gluten content of mixed flour
注:不同小写字母表示未发酵组间差异显著(P<0.05),不同大写字母表示发酵组间差异显著(P<0.05)(下同)。
2.4 混合粉巯基-二硫键含量
小麦粉在吸水形成面团的过程中,醇溶蛋白和麦谷蛋白通过二硫键的交联形成面筋网络结构。但面筋蛋白之间会发生游离巯基-二硫键交换反应,而巯基氧化作用、巯基与二硫键的交换反应都会产生新的二硫键,从而将氨基酸残基连接起来形成稳定的蛋白质分子排列结构[19]。因此巯基和二硫键的含量对面筋网络具有重要的影响,也与蛋白质的性质密切相关。
图2为不同添加量下未发酵组与发酵组混合粉面筋蛋白中巯基和二硫键的含量。随着麦麸添加量的增加,二硫键含量显著降低(由12.73 μmol/g降至9.89 μmol/g)、游离巯基含量显著增加(由2.34 μmol/g增至3.37 μmol/g),这与张慧娟等[20]的研究结果一致。当麦麸添加量为3%～12%时,发酵组混合粉面筋蛋白二硫键含量显著高于未发酵组,这表明发酵处理在一定程度上抑制了麦麸添加对面筋蛋白的破坏。当添加量低于6%时,麦麸对于面筋蛋白的稀释作用较小,且麦麸膳食纤维中的活性羟基可能阻止了二硫键交换过程中在蛋白质上形成的部分自由基的累积[21],发酵组和未发酵组游离巯基含量无显著差异,但其含量显著高于面粉中的游离巯基含量。当添加量大于6%时,两组的游离巯基含量开始出现显著差异,麦麸添加量为15%时,未处理组游离巯基的含量为3.37 μmol/g,比小麦粉高44%。麦麸膳食纤维可能与面筋蛋白竞争水分子或形成空间位阻,中断面筋蛋白分子间的二硫键[22],使混合粉中游离巯基含量增加、二硫键含量降低,表明蛋白质的空间结构变得松散,面筋网络稳定性遭到破坏。
图2 混合粉中巯基和二硫键含量的变化
Fig.2 Changes in the content of sulfhydryl and disulfide bonds in mixed flour
2.5 混合粉面筋蛋白二级结构
蛋白质的二级结构是指蛋白质多肽链中有规则重复的构象,蛋白质二级结构的变化与氢键、二硫键等作用力的改变有关,在面筋网络结构的形成过程中起着重要的作用,关系面团的品质。烟酰胺I带(1 600～1 700 cm-1)可用于蛋白质二级结构的表征,为探究麦麸添加后对混合粉的蛋白质分子结构的影响,测定蛋白质α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规则卷曲结构的含量,结果见图3。
a-未发酵组混合粉蛋白质二级结构;b-发酵组混合粉蛋白质二级结构
图3 混合粉蛋白质的二级结构的变化
Fig.3 Changes in secondary structure of proteins of mixed flour
由图3可知,未发酵组随着麦麸添加量增加,β-折叠及α-螺旋含量降低,无规则卷曲含量增加,表明麦麸添加对蛋白质二级结构的构象产生显著影响,蛋白质无序化结构增加。而当发酵组麦麸添加量低于6%时,β-折叠含量无显著差异,此时α-螺旋的含量呈现略微升高的趋势,添加量高于6%时二者含量显著降低。α-螺旋和β-折叠是相对较为有序的构象[23],发酵处理在一定程度上可以减少蛋白质稳定构象向其他结构的转变,减弱了麦麸添加对于面筋蛋白的负面影响。
2.6 混合粉的SDS-PAGE凝胶电泳特性
面团中高分子质量麦谷蛋白亚基HMW-GS及亚基组合与面制品的品质性状具有紧密的联系[24],高HMW-GS含量会增强面筋蛋白的韧性。为明确混合粉蛋白质亚基分子质量,可采用SDS-PAGE蛋白质电泳进行分析。SDS-PAGE电泳是利用SDS阴离子去污剂和还原剂的作用,破坏蛋白质亚基的非共价键使蛋白质带负电,蛋白质单个亚基被解离出来。当分子质量在15～200 kDa时,蛋白质的迁移率和分子质量的对数呈线性关系,不同分子质量的亚基分子质量PAGE凝胶上的迁移速率不同,从而产生不同的条带。蛋白质SDS-PAGE条带的位置和深浅可以直观地反映蛋白质分子质量的变化。
混合粉蛋白非还原条件下的电泳带变化如图4所示。添加麦麸后麦麸的条带数无差异,表明添加麦麸对蛋白质亚基的组成没有显著影响[25]。未发酵组中当麦麸添加量超过6%时,低分子质量麦谷蛋白亚基、清蛋白和球蛋白条带颜色加深,此时蛋白质的SDS可提取率增大,蛋白质发生解聚;但添加发酵后的麦麸颜色变化幅度较小,表明发酵后的麦麸对于蛋白质的结构的影响要低于未发酵组的麦麸,这也与前面的结果一致。
a-未发酵组混合粉蛋白电泳图;b-发酵组混合粉蛋白电泳图
图4 混合粉蛋白SDS-PAGE电泳图
Fig.4 SDS-PAGE electrophoresis of mixed flour protein
3 结论
本研究通过添加不同比例发酵前后的麦麸至面粉中制成混合粉,探究其对面团特性的影响。结果表明,添加发酵麦麸能够显著降低麦麸添加对面制品的不利影响,当发酵麦麸的添加量低于6%时,能够有效改善混合粉的粉质特性和糊化特性,湿面筋含量和二硫键含量显著提高。同时,添加发酵麦麸能够弱化麦麸对面筋蛋白的破坏,α-螺旋和β-折叠含量变化较小,在一定程度上能够缩减蛋白质稳定构象向其他结构的转变,减弱了添加麦麸对面筋蛋白的不利影响。当麦麸添加量高于6%时,无论麦麸发酵与否,面团的面筋含量、β-折叠及α-螺旋的含量显著降低,蛋白质出现解聚现象。研究结果表明,麦麸添加量高于6%时,混合粉的粉质特性、糊化特性与面筋含量均显著降低,不利于面团稳定结构的形成,影响麦麸面制品的营养品质,因此可将麦麸添加量控制在6%以下。利用本研究工艺制成的发酵面团可用于制作面条、馒头、面包和饼干等面制品,发酵处理对改善全麦制品的风味特性具有积极效果。研究结果不仅可以为全麦制品中麦麸添加量的确定提供理论依据,而且可以为提高麦麸的附加值和利用率,扩大麦麸在面制品中的应用提供参考。
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