叶绿素是绿色果蔬中主要的呈色物质,也是自然界含量较为丰富的植物代谢物,叶绿素具有多种生物活性如抗氧化[1]、抗炎[2]、抗肿瘤[3]等。肠道菌群是机体重要的微生态系统,健康机体内肠道菌群形成的天然屏障可以抵御病菌侵入机体,并通过肠-肝轴调节肝脏代谢[4]。长期高脂膳食会造成肠道菌群结构失调,破坏肠道菌群形成的天然屏障,有害物质穿过屏障进入身体各个部位,刺激机体进行免疫应答释放炎性细胞因子,损伤肝脏代谢功能并导致机体肥胖[5]。哺乳动物不能直接消化吸收蔬菜中的叶绿素,在经过胃肠后,约有95%会进入结肠与肠道菌群产生相互作用,作用后的小分子代谢物能够对机体代谢产生影响。郑红莉等[6]基于流式细胞技术研究后发现叶绿素(叶绿素a和叶绿素b含量占比分别为70.99%和21.12%)可显著调节益生菌假长双岐杆菌(Bifidobacterium pseudolongum)与鼠乳杆菌(Lactobacillus murinus)的丰度。不仅如此,LI等[7-8]使用富含叶绿素的菠菜提取物(主要是叶绿素a和叶绿素b),对高脂膳食喂养的C57BL/6 J小鼠进行干预后,发现其可改善高脂小鼠肠道微生物菌群失调并抑制炎症因子的升高,进而缓解高脂膳食诱导的低度炎症和血糖值。但是,此前的研究采用的多是叶绿素粗提取物(含有叶黄素、类胡萝卜素、多糖等),实验结果可能存在干扰因素。在课题组的前期研究中发现[9],结肠中的叶绿素大多是以脱镁叶绿素及其衍生物的形式存在。随着更进一步研究,发现在高脂膳食诱导小鼠结肠中,是脱镁叶绿酸a(pheophorbide a,Pheo a)在与微生物产生主要相互作用,并对机体健康产生潜在有益影响,但其作用机制和潜在健康效应还需深入研究[10]。因此,阐明脱镁叶绿酸a介导肠道菌群改善高脂饮食诱导肥胖的机制及量效关系,还需进行深入的研究。
鉴于此,本实验让高脂膳食小鼠额外摄入脱镁叶绿酸a,利用组织病理、血液生化及高通量测序技术(微生物多样性和肝、菌群代谢组学),研究在不同质量浓度(0.16、0.12、0.08、0.04 mg/mL)脱镁叶绿酸a干预下,对高脂膳食诱导的肝肠损伤的缓解作用及机制,对于高脂膳食人群的膳食指导有重要意义。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
紫菜(干坛紫菜,产地福建霞浦),重庆市北碚区永辉超市;盐酸、丙酮、石油醚(60～90 ℃)、乙醚、乙醇、乙腈、甲醇、多聚甲醛、氯化钠、碳酸氢钠、氯化钙、氢氧化钠、羧甲基纤维素钠(sodium carboxymethylcellulose,CMC-Na),川东化工公司(中国重庆);乙酸铵、丙酮、甲醇、乙腈均为色谱纯,Sigma-Aldrich贸易有限公司(中国上海);PBS,Bio-sharp公司(中国北京);水为超纯水。
1.2 仪器与设备
BSM-120.4型电子天平,上海卓精电子科技有限公司;Agilent 1290超高效液相色谱仪,美国Agilent公司;Impact Ⅱ四极杆飞行时间质谱仪(具有Bruker Compass DataAnalysis 5.1数据处理软件),德国Bruker公司;Vortex-2涡旋混匀仪,上海沪析实业有限公司;RE-52AA旋转蒸发器,上海亚荣生化仪器厂;罗氏血糖仪,Roche Accu-Chek(德国,慕尼黑);DW-HL398超低温冷冻贮存箱,中科美菱低温科技股份有限公司;UV-5200紫外可见光分光光度计,上海元析仪器有限公司;KQ5200DE型数控超声波清洗器,昆山市超声仪器有限公司;Mini Spin高速微型离心机,德国Eppendorf公司。
1.3 实验方法
1.3.1 提取和测定脱镁叶绿酸a
参照实验室已有的方法制备脱镁叶绿酸a[11],称取初始紫菜原料50 g,撕成碎片放入破壁机中打散至粉末状态,加入100 mL纯水搅拌均匀,随后加入4倍体积的丙酮浸泡12 h,采用高速滤纸进行过滤。加入1 mL 3.88 mol/L左右的HCl溶液摇晃至溶液轻微变成黄色,再加入50 mL乙醚、过量NaCl固体和少量的NaHCO3粉末中和盐酸。随后进行分层萃取,将上层清液在55～60 ℃条件下减压旋转蒸干。
采用实验室已有的层析方法分离原液中的脱镁叶绿酸a[11],将原液均匀点样在1 mm厚的滤纸板上,进行石油醚洗脱的薄层层析[(V(石油醚)∶V(乙醇)∶V(甲醇)=60∶20∶1)]。将层析得到的脱镁叶绿酸a条带裁下用丙酮溶解后,得到相应的脱镁叶绿酸a-丙酮溶液,放置于-20 ℃冰箱中保存至使用。
利用超高效液相-二极管阵列检测器(ultra high performance liquid phase diode array detector,UPLC-DAD)对脱镁叶绿酸a进行定量,测定其浓度。检测条件参考实验室原有的方法进行设定[12]。DAD检测器记录在300～750 nm下的色谱图,利用实验室所建立的基于叶绿素标准品所作标准曲线进行定量测定。
1.3.2 动物实验
如图1所示,48只雄性C57/BL6 J小鼠(6周龄),分为6组,每组8只,组数编号为:HFD-Pheo a 0.16、HFD-Pheo a 0.12、HFD-Pheo a 0.08、HFD-Pheo a 0.04、HFD、NC(动物实验伦理编号:IACUC-20230228-15)。NC组采用正常饲料喂养,其余采取高脂饲料喂养;高脂饲料配方:31.6%(质量分数,下同)猪油+25.8%酪蛋白+16.1%麦芽糊精+9.5%蔗糖+6.5%纤维素+6.5%混合矿物质+3.2%大豆油+0.4%L-胱氨酸+0.3%酒石酸氢胆碱+0.1%混合维生素;正常饲料即基础饲料。其中4组(HFD-Pheo a 0.16至HFD-Pheo a 0.04)用脱镁叶绿酸a-CMC-Na乳液代替饮水,剩余2组用5%(质量分数)CMC-Na乳液代替饮水;脱镁叶绿酸a摄入剂量参考已有研究并设置梯度[13]:0.16、0.12、0.08、0.04 mg/mL(脱镁叶绿酸a-CMC-Na乳液制备方法:将各实验组对应量的脱镁叶绿酸a剂量分别溶解于200 mL的5% CMC-Na溶液中,并超声处理10 min)。喂养条件为:相对湿度55%～65%;室温(25±1) ℃,在12 h黑暗/12 h光照循环条件下喂养,采用标准的实验室饮食。6组连续喂养12周,期间小鼠可以正常饮食。
图1 小鼠实验分组情况
Fig.1 Experimental grouping of mices
注:实验分为6组,实验组小鼠摄入不同剂量的脱镁叶绿酸a-CMC-Na乳液,对照组小鼠摄入5%的CMC-Na乳液。HFD-Pheo a 0.16组:0.16 mg/mL;HFD-Pheo a 0.12组:0.12 mg/mL;HFD-Pheo a 0.08组:0.08 mg/mL;HFD-Pheo a 0.04组:0.04 mg/mL;HFD:高脂膳食;NC:正常膳食。
1.3.3 口服葡萄糖耐量试验(oral glucose tolerance test,OGTT)
当动物实验进行到11周时,利用血糖仪检测小鼠尾静脉血液标本血糖值,进行葡萄糖耐量实验。小鼠禁食12 h[14]后,每组小鼠取4只与该组平均体重接近的进行测量,按2 g/kg剂量灌胃5%(质量分数)葡萄糖溶液[15]。使用血糖仪检测小鼠尾静脉末梢血糖水平,记录注射前(0 min)及注射后30、60、90、120 min的血糖值。最后利用SPSS Statistics 27对数据进行显著性差异分析。
1.3.4 血清生化指标检测
采用已有的方法收集小鼠眼球血[16]。将装有眼球血的抗凝1.5 mL EP管放入4 ℃微型离心机中进行2 000 r/min离心15 min,取上层血清于新的抗凝1.5 mL EP管中,放于4 ℃冰箱待测。
取收集到的血清采用二喹啉甲酸(bicinchoninic acid,BCA)法测蛋白浓度,根据试剂盒测定小鼠血清丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase,ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase,AST)、甘油三酯(triglyceride,TG)、低密度脂蛋白胆固醇(low-density lipoprotein cholesterol,LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(high-density lipoprotein cholesterol,HDL-C)、总胆固醇(total cholesterol,TC)水平;采用全自动生化测定分析仪检测血清中胰岛素(insulin,INS)、脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)、白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)的表达水平,具体操作方法参照试剂盒说明书进行。
与动物机体抗氧化性能相关的指标,采用比色法测定血清总抗氧化能力(total-antioxidant capacity,T-AOC),黄嘌呤氧化酶法测定血清总超氧化物歧化酶(total-superoxide dismutase,T-SOD)以及硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid,TBA)法测定血清丙二醛(malondialdehyde,MDA),操作方法参照相应检测试剂盒说明书进行。
1.3.5 组织病理学观察
将收集到的肝脏组织固定在多聚甲醛溶液(体积分数为4%)中48 h,经过石蜡包埋、切片、苏木精-伊红(hematoxylin eosin,HE)染色和油红O染色等步骤处理后进行组织病理学观察。取收集到的结肠样本,用多聚甲醛溶液(4%)固定48 h,再经过石蜡包埋、切片以及阿利新蓝-过碘酸-雪夫(alcian blue-periodic acid schiff,AB-PAS)染色和HE染色后进行病理学观察并分析。
1.3.6 高脂膳食诱导的肠道菌群测定
新鲜粪便采集自喂养完成后的C57BL/6 J小鼠,每只小鼠粪便取3～5颗放入无菌冻存管中至于-80 ℃冰箱贮存。各组随机取3只小鼠粪便进行肠道菌群检测。按照试剂盒说明书从样品中提取出肠道菌群的总DNA,使用PCR扩增细菌16S rRNA基因的V3和V4区。回收PCR产物后使用2%琼脂糖凝胶电泳检测,最终扩增产物在Illumina公司(加州,美国)的PE250平台进行测序,使用QIIME2软件进行分析。
1.3.7 肝脏代谢组和粪便代谢组检测
肝脏代谢组预处理:每只小鼠剪取一片肝脏组织(100～120 mg)于贴好标签的1.5 mL离心管中称重并记录,置于液氮速冻,随后放入-80 ℃冰箱保存。将冻存的肝脏组织转移至5 mL离心管按照1∶9的料液比(即1 g肝脏组织加入9 mL的提取液)加入甲醇-乙腈-水(体积比2∶2∶1)后,使用均质机匀浆涡旋1 min,并超声处理10 min,于12 000 r/min离心10 min[17]。上清液用0.22 μm微孔滤膜过滤,分装在液相小瓶中保存于-80 ℃待测。
粪便代谢组预处理:取出冻存的粪便样品100 mg于1.5 mL离心管中,吸取0.6 mL生理盐水到已灭菌的微型离心管中并使用均质机匀浆涡旋1 min,超声5 min后立即冷冻离心(10 000 r/min,4 ℃,5 min)。吸取上清液0.2 mL加入0.8 mL乙腈-甲醇(体积比1∶1)于新离心管内,进行冷冻离心(10 000 r/min,4 ℃,5 min),取上清液200 μL进行样品制备。
非靶向代谢组方法参考实验室已有方法,采用超高效液相色谱-质谱联用技术(ultra-high performance liquid chromatography-mass spectroscope,UPLC-MS)进行检测,进样程序参考已有研究[18]。检测条件:色谱柱采用Poroshell 120 C18(2.1 mm×100 mm,1.9 μm),柱温30 ℃,进样量5 μL,时间30 min,ESI正、负离子模式进行质谱采集。ESI正离子模式下流动相A[0.1%(体积分数)甲酸-水],流动相B(乙腈);ESI负离子模式下流动相A(0.1% 甲酸-水-5 mmol/L乙酸铵),流动相B(乙腈)。
1.4 数据分析
所有实验组均为6个平行,肠道微生物多样性检测设置3个平行,实验数据使用SPSS Statistics 27进行显著性分析。组间比较采用最小显著性差异法分析,P<0.05为存在显著差异,用Origin 2021进行作图。微生物组学部分的原始数据进行分类操作单元的划分(ASV水平),肠道菌群丰度及微生物种类差异分析通过美吉生物云平台(https://www.majorbio.com/)分析。超高效液相色谱-质谱联用技术非靶向检测肝脏和粪菌提取液,原始数据放入Bruker Data Analysis 5.1软件进行校正后,profile.文件转为MzXML格式放入Wizard MZmine 3进行降噪、基线校正、归一化、去同位素等处理。KEGG(https://www.genome.jp/kegg/)在线注释后的数据导出为Excel文件,表格数据根据样本组别进行分列整理。非靶向代谢组学相关分析使用基迪奥在线生信云处理平台(https://www.omicshare.com/tools/)。富集分析结果分析采用Metaboanalysis 5.0。
2 结果与分析
2.1 脱镁叶绿酸a定量分析
利用UPLC-DAD技术对脱镁叶绿酸a进行定量分析。结果显示采用层析方法分离的脱镁叶绿酸a纯度达到95%,与同课题组以往的研究结果一致[10]。
2.2 小鼠喂养过程体重变化
取各组小鼠1周体重的平均值进行绘图,结果如图2所示,前6周小鼠体重差异无统计学意义(P>0.05)。随着实验进行到第8周之后,实验组小鼠的体重均低于HFD组小鼠。各组小鼠体重都有明显增加,而NC组小鼠的体重增加比较缓慢,此时HFD组小鼠体重同实验组和NC组小鼠体重出现显著性差异(P<0.05),但是仍与HFD-Pheo a 0.04组小鼠体重无显著性差异(P>0.05);高脂膳食导致的小鼠体重变化与先前研究一致[19]。
图2 各组小鼠体重的变化
Fig.2 Changes in body weight of mices
注:HFD组与NC组同期相比,**P<0.01,***P<0.001;实验组与HFD组同期相比,▲P<0.05,▲▲P<0.01,▲▲▲P<0.01(下同)。
如图2所示,高浓度组(HFD-Pheo a 0.16、0.12)对于高脂膳食小鼠体重抑制有明显的帮助,而低浓度组(HFD-Pheo a 0.08、0.04)机制效果减弱,但实验组之间不具有统计学意义。
2.3 脱镁叶绿酸a对高脂膳食小鼠血糖值的影响
判断小鼠是否患有糖尿病的诊断标准为:血糖正常:空腹血糖值(fasting plasma glucose,FPG)<6.1 mmol/L,同时OGTT 2 h血糖值<7.8 mmol/L。糖尿病前期:6.1 mmol/L≤FPG<7.0 mmol/L或7.8 mmol/L≤OGTT 2 h血糖<11.1 mmol/L。糖尿病:FPG≥7.0 mmol/L和(或)OGTT 2 h血糖≥11.1 mmol/L[20]。
如图3所示,HFD-Pheo a 0.16、0.12组和NC组的小鼠血糖值都属于正常值的范围,而HFD-Pheo a 0.08、0.04组和HFD组的小鼠血糖值不管是初始时还是2 h后都超出了正常范围,属于糖尿病血糖值范围。说明高脂膳食会促进小鼠的血糖值增长,这与KREBS等[21]的研究结果一致。
图3 各组小鼠血糖值的变化
Fig.3 Changes in blood glucose values of mices
由图3可知,HFD组小鼠血糖值与另外5组具有显著性差异(P<0.05),可判定为造模成功。同时说明脱镁叶绿酸a会对小鼠血糖指数有明显抑制作用,并且高浓度组(HFD-Pheo a 0.16、0.12)与HFD组相比小鼠血糖值的差异性更加显著,说明摄入不同剂量的脱镁叶绿酸a对小鼠血糖指数抑制效果不同,呈剂量依赖关系,高剂量(HFD-Pheo a 0.16、0.12)有明显的改善作用。
2.4 小鼠血清生化指标测试结果
2.4.1 生理生化指标差异
生理生化指标测定结果如表1所示。ALT和AST是被广泛应用于评价肝脏功能的指标[22],HFD组的均高于NC组,实验组的ALT、AST水平虽然均低于HFD组,但结果并不显著(P>0.05),说明高脂膳食会影响小鼠ALT、AST水平升高。TG、TC、LDL-C和HDL-C是临床血脂分析的重要指标[23],正常小鼠血清中TG、TC活力较低,当肝脏发生损伤、坏死或受到破坏时,就会引起二者在血清中活性增加。HFD组TG、TC水平的均显著高于NC组(P<0.05),而实验组的均低于HFD组,尤其是高浓度组(HFD-Pheo a 0.16,0.12)与HFD组相比具有显著性差异(P<0.05),数据结果表明高脂膳食会诱导小鼠TG、TC水平升高,脱镁叶绿酸a对此具有抑制作用且抑制效果与脱镁叶绿酸a的摄入量相关,可判断其趋势是摄入量越高抑制效果越显著。当肝细胞受损时LDL-C含量将会升高,而HDL-C含量将会减少。HFD-Pheo a 0.12组的LDL-C水平较HFD组相比显著降低(P<0.05);HDL-C水平显著性提高(P<0.05),其余实验组较HFD组相比也有所降低但结果并不显著(P>0.05);则脱镁叶绿酸a会降低小鼠体内LDL-C水平,升高HDL-C水平,但数据结果表明其作用效果与摄入量无明显依赖性。
表1 小鼠血清生化检测分析
Table 1 Analysis of serum biochemical assays in mice
项目HFD-Pheo a 0.16HFD-Pheo a 0.12HFD-Pheo a 0.08HFD-Pheo a 0.04HFDNCALT/(U/L)125.90±2.50128.35±3.75136.00±3.52132.24+3.55146.50±2.97138.62±2.73AST/(U/L)189.55±14.65189.98±12.76186.36±8.78195.91±9.39221.83±58.44191.68±10.82TG/(mmol/L)1.09±0.07b1.22±0.17b1.37±0.091.41±0.051.48±0.11a1.17±0.09LDL-C/(mmol/L)2.65±0.062.53±0.09b2.80±0.042.84±0.042.81±0.07a1.30±0.03HDL-C/(mmol/L)3.64±0.07b3.87±0.31b3.50±0.073.19±0.122.76±0.19a3.58±0.17TC/(mmol/L)4.34±0.13b3.61±0.46b4.93±0.11b4.86±0.24b8.07±0.25a4.22±0.17
注：与NC组比较,aP<0.05;与HFD组比较,bP<0.05(下同)。
2.4.2 炎症因子含量差异
炎症因子含量测定结果如表2所示。高浓度组(HFD-Pheo a 0.16、0.12)的INS水平较HFD组显著降低(P<0.05),而HFD组小鼠的INS水平与NC组相比较高。根据胰岛素抵抗指数(HOMA-IR=空腹胰岛素×空腹血糖/22.5)数值大小将各组小鼠分为胰岛素抵抗(IR)和非胰岛素抵抗(N-IR),结果发现实验组和HFD组小鼠均属于IR范围[24]。这说明高脂膳食摄入过多会导致内脏脂肪堆积,从而造成小鼠体内INS水平偏高,出现INS抵抗的现象。从数据结果来看,脱镁叶绿酸a可改善INS抵抗现象,其改善效果与摄入量存在依赖关系,摄入量越高改善效果更好,但其作用机理仍需进一步研究。
表2 小鼠血清炎症因子含量分析
Table 2 Analysis of serum inflammatory factor levels in mice
项目HFD-Pheo a 0.16HFD-Pheo a 0.12HFD-Pheo a 0.08HFD-Pheo a 0.04HFDNCINS/(mU/L)26.77±0.079b28.69±1.52b32.34±0.31b44.38±0.0049.28±1.55a28.10±0.57LPS/(pg/mL)350.90±0.01b354.91±0.03b453.85±0.03489.79±0.04484.90±0.06a350.83±0.01IL-1β/(pg/mL)69.83±0.8068.77±0.8068.24±0.2757.72±0.78b69.21±0.47a47.62±0.17IL-6/(pg/mL)43.11±0.5244.37±1.3445.94±0.23b46.77±0.61b43.57±0.18a43.13±0.60TNF-α/(pg/mL)185.90±0.00184.11±0.12155.42±0.24b164.78±1.20b215.59±1.03a145.58±0.65
LPS常被认为是炎症、肥胖和代谢紊乱之间的关键联系,它可以通过与白细胞结合引导其产生转录因子,再通过转录因子刺激TNF-α、IL-1β、IL-6等炎性胞质分裂因子的产生,最终引发炎症[25]。该实验结果表明高脂膳食会增加小鼠体内LPS的活性,脱镁叶绿酸a对此具有改善作用且高浓度组(HFD-Pheo a 0.16,0.12)改善效果更加显著(P<0.05)。
IL-1β、IL-6、TNF-α作为炎症反应的重要调节因子,在机体健康中起着关键作用[26]。与NC组比较,HFD组IL-1β、IL-6、TNF-α水平明显升高(P<0.05);与HFD组比较,HFD-Pheo a 0.04组IL-1β水平明显降低(P<0.05),HFD-Pheo a 0.16、0.12组IL-6水平和HFD-Pheo a 0.12组TNF-α水平有所降低但无显著性(P>0.05)。结果表明,高脂膳食会导致脂肪组织过度积累,进而刺激炎症因子的表达水平提高,最终加剧炎症反应;而脱镁叶绿酸a对于肥胖引起的炎症具有积极调节作用,但其调节效果与摄入量并未表现出强烈的相关性。
2.4.3 抗氧化酶活性及氧化产物含量差异
T-SOD、T-AOC、MDA是机体重要的生化指标,它们与氧化应激、脂质过氧化等过程密切相关[27]。T-SOD是一种重要的抗氧化酶,能够清除机体内的超氧阴离子自由基,从而减轻氧化应激反应。T-AOC反映了机体对自由基的清除能力,是评价抗氧化能力的重要指标。MDA是脂质过氧化物的产物,其含量可以反映脂质过氧化的程度。如表3所示,HFD组与NC组比较,T-SOD、T-AOC含量明显降低,MDA含量明显升高(P<0.05);高浓度组(HFD-Pheo a 0.16,0.12)与HFD组相比,T-SOD、T-AOC含量明显升高,MDA含量明显降低(P<0.05)。结果表明高脂膳食会导致小鼠体内T-SOD、T-AOC活性下降,MDA含量增加,进而加重氧化应激反应,增加患慢性疾病的风险,这与先前研究结果一致[28]。而脱镁叶绿酸a具有强的抗氧化作用[26],可以提高T-SOD、T-AOC的表达量和活性,提高二者清除自由基的能力,进一步增加其含量同时减少MDA的产生。
表3 小鼠体内抗氧化酶活性及氧化产物含量分析
Table 3 Analysis of antioxidant enzyme activities and oxidation product contents in mice
项目HFD-Pheo a 0.16HFD-Pheo a 0.12HFD-Pheo a 0.08HFD-Pheo a 0.04HFDNCT-SOD/(U/mL)96.45±3.09b98.05±1.60b82.18±1.6781.42±0.3275.01±2.49a92.86±0.49T-AOC/(U/mL)24.28±0.4223.86±0.7817.88±1.26b15.60±0.5112.43±0.29a23.45±0.39MDA/(nmol/mL)27.46±1.11b26.19±1.46b33.65±0.1629.60±0.57b47.94±0.57a27.14±0.27
2.5 脱镁叶绿酸a对高脂膳食小鼠组织病理的影响
观察各组小鼠肝脏结构的情况,HE染色结果如图4所示。NC组小鼠肝脏组织结构清晰,肝小叶界限分明,小叶内的肝细胞排列有序,形成明显索状结构,未出现明显病理学现象。HFD组小鼠肝脏组织有较多的空泡状脂滴形成;肝小叶内炎性细胞浸润增加,还伴随着其结构改变以及肝细胞增生。与HFD组相比,HFD-Pheo a 0.16组的肝脏组织脂肪变性以及炎症反应等症状明显减轻,空泡状脂滴数量明显减少,肝细胞增生得到缓解。其余实验组较HFD组相比,结果虽有所改善,但不够明显。
a-HFD-Pheo a 0.16组;b-HFD-Pheo a 0.12组;c-HFD-Pheo a 0.08组;d-HFD-Pheo a 0.04组;e-HFD组;f-NC组
图4 各组小鼠肝脏组织HE染色图
Fig.4 HE staining of liver tissue of mices
注:“→”代表空泡状脂滴出现,肝细胞肿大;“○”代表肝细胞排列情况。
各组小鼠肝脏组织油红O染色结果如图5所示。NC组小鼠肝脏组织未观察到显著的脂滴积聚现象,而HFD组小鼠脂滴数量明显增多,表现为不均一的红色脂滴聚集在肝细胞周围。与HFD组相比,实验组脂肪变性程度明显减轻,脂滴数量大幅减少且以较为分散的形式存在。初步判断脱镁叶绿酸a对改善高脂小鼠慢性肝炎等疾病有所作用,作用效果与小鼠摄入量有关,摄入量越高,对肝脏疾病的改善效果就越好。
a-HFD-Pheo a 0.16组;b-HFD-Pheo a 0.12组;c-HFD-Pheo a 0.08组;d-HFD-Pheo a 0.04组;e-HFD组;f-NC组
图5 各组小鼠肝脏组织油红O染色图
Fig.5 Oil-red O staining of liver tissue of mices
注:“→”代表肝细胞生长情况;“○”代表脂质沉积情况。
各组小鼠结肠组织AB-PAS染色结果如图6所示。NC组小鼠结肠的黏液层经染色后分布均匀、厚度适中;纤维绒毛呈现出细丝状形态,覆盖在黏膜表面;杯状细胞数量适中,无明显炎症现象。HFD组小鼠出现明显炎症细胞浸润现象;其染色阳性区域较NC组更密集,则结肠黏液层出现增加、增厚现象;杯状细胞形状变圆还伴随着绒毛形状不规则等现象。与HFD组比较,高浓度组(HFD-Pheo a 0.16、0.12)小鼠肠道黏膜损伤有所改变,炎症细胞浸润现象减少,杯状细胞数量增加、体积增大。
a-HFD-Pheo a 0.16组;b-HFD-Pheo a 0.12组;c-HFD-Pheo a 0.08组;d-HFD-Pheo a 0.04组;e-HFD组;f-NC组
图6 各组小鼠结肠组织AB-PAS染色图
Fig.6 AB-PAS staining of mouse colon tissue in each group
注:“→”代表杯状细胞生长情况;“○”代表炎症细胞浸润现象。
各组小鼠结肠组织HE染色结果如图7所示。NC组小鼠未观察到明显的空泡状脂滴和炎性细胞浸润现象;HFD组小鼠空泡状脂滴数量增加且有明显的炎症细胞浸润现象。高浓度组(HFD-Pheo a 0.16、0.12)小鼠与HFD组相比炎症反应现象得到缓解,空泡状脂滴数量明显减少。结果表示高脂膳食可通过破坏肠道黏膜,分泌促炎细胞因子,引起炎症细胞浸润,最终触发慢性低水平炎症反应,小鼠摄入脱镁叶绿酸a后,炎症反应又会得到缓解。说明其具有改善高脂膳食导致的肠道炎症的作用并且高浓度组(HFD-Pheo a 0.16、0.12)的改善效果更加明显。
a-HFD-Pheo a 0.16组;b-HFD-Pheo a 0.12组;c-HFD-Pheo a 0.08组;d-HFD-Pheo a 0.04组;e-HFD组;f-NC组
图7 各组小鼠结肠组织HE染色图
Fig.7 HE staining of mouse colon tissue
注:“→”代表空泡状脂滴生长情况;“○”代表炎症细胞浸润现象。
2.6 脱镁叶绿酸a对高脂膳食小鼠肝脏代谢物的影响
运用UPLC-MS非靶向代谢组学分析小鼠肝脏代谢物变化,HFD-Pheo a 0.04组和HFD组的肝脏代谢物有显著性差异,说明实验组的代谢模式发生显著变化。如图8-a所示,实验组小鼠肝脏代谢物水平与对照组相比出现显著差异,得到烟酰甘氨酸、琥珀酸、缬氨酸、丙氨酸以及谷氨酸等差异代谢物。对差异代谢物使用KEGG富集分析,以P<0.05为条件进行筛选,结果如图8-b所示。该实验发现,脱镁叶绿酸a缓解高脂膳食诱导的肝脏代谢紊乱主要作用途径为:丙酮酸代谢、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸生物合成、三羧酸循环。
a-肝脏代谢物结果分析;b-肝脏代谢物KEGG富集分析
图8 各组小鼠肝脏代谢物分析
Fig.8 Analysis of liver metabolites of mices
注:pyruvate metabolism-丙酮酸盐代谢;valine,leucine and isoleucine biosynthesis-缬氨酸,亮氨酸和异亮氨酸生物合成;taurine and hypotaurine metabolism-牛磺酸和次牛磺酸代谢;citrate cycle-柠檬酸循环;glyoxylate and dicarboxylate metabolism-乙醛酸和二羧酸代谢;glycine,serine and threonine metabolism-甘氨酸,丝氨酸和苏氨酸代谢;primary bile acid biosynthesis-初级胆汁酸生物合成。
肝脏糖脂代谢紊乱表现为脂质和氨基酸不能正常代谢,会造成体内毒性物质的过度积累,导致肝脏功能受损,使其在清除外源性LPS方面能力下降,最终造成循环中LPS的水平升高。谷氨酸等的代谢紊乱造成的高水平LPS可通过影响肝脏中脂肪酸合成、分解和氧化来改变脂质代谢,导致脂肪在肝细胞中过度积累,进而促进脂肪肝的发展。例如LPS通过诱导巨噬细胞导致三羧酸循环中间产物琥珀酸的积累,琥珀酸可作为肝脏炎症和氧化应激的信号分子,当琥珀酸在小鼠体内积累时,会触发炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α的释放,从而引发肝脏炎症反应。烟酰甘氨酸可在水解酶的作用下分解成烟酰基团和甘氨酸,烟酰基团在酰胺合成酶催化下发生酰胺化反应,生成烟酰胺。烟酰胺具有抗炎、抗氧化等作用,适量的烟酰胺对高脂膳食诱导的脂质代谢紊乱有一定调节作用,通过减少脂肪的堆积来预防和减轻脂肪肝的发展;它还能够提高T-SOD和T-AOC表达量和活性,并降低氧化产物MDA的生成,最终减轻氧化应激对肝脏的损伤。这与前文小鼠血清生化指标测试结果相符合,该实验研究结果表明,脱镁叶绿酸a可能通过调节肝脏内脂质代谢途径,来抑制炎症反应,最终发挥对肝脏的保护作用。
2.7 脱镁叶绿酸a对高脂膳食小鼠肠道菌群的影响
2.7.1 Alpha多样性和Beta多样性评价
Alpha多样性指数常被用来评估样本中微生物群落丰富度和均匀度,本实验采用Chao指数和Shannon指数在ASV水平上进行分析,结果如图9所示。经过Kruskal-Wallis秩和检验后,Chao模型P=0.734 2,Shannon模型P=0.463 2,说明脱镁叶绿酸a对高脂膳食小鼠肠道菌群的丰富度和均匀度影响并不显著。
a-Chao指数;b-Shannon指数
图9 Alpha多样性分析
Fig.9 Alpha diversity analysis
再使用Beta多样性在ASV水平上进行分析,结果如图10所示。采用主坐标分析(principal co-ordinates analysis,PCoA)对高脂膳食小鼠进行脱镁叶绿酸a灌胃后的肠道微生物群落组成,结果表明各组样本之间存在统计学差异,同组样本间有明显的聚类;实验组与HFD组间有明显的分开。使用NMDS(non-metric multidimensional scaling sorting)来评估各组之间的相似性,HFD组与NC组间隔较远且HFD-Pheo a 0.16组与HFD组间隔较远,HFD-Pheo a 0.12、0.08组介于二者中间。经过ANOSIM检验后,PCoA模型和NMDS模型R=0.655 1,P=0.001,参数表明,2种模型分析的组内差异具有统计学意义。
a-PCoA分析结果;b-NMDS分析结果
图10 Beta多样性分析
Fig.10 Beta diversity analysis
注:NMDS1-非度量多维尺度1;NMDS2-非度量多维尺度2。
2.7.2 脱镁叶绿酸a对高脂膳食小鼠肠道菌群物种组成的影响
在门水平和属水平上评估脱镁叶绿酸a对小鼠肠道菌群的影响。如图11-a所示,与NC组小鼠肠道菌群的丰度相比,HFD组门水平的菌群丰度出现明显变化。小鼠摄入脱镁叶绿酸a后,在门水平上占据90%丰度的菌群是厚壁菌门(Firmicutes)和拟杆菌门(Bacteroidota)。与HFD组相比,脱镁叶绿酸a提高了拟杆菌门(Bacteroidota),降低了厚壁菌门(Firmicutes)的丰度,这与先前研究结果一致[8]。
a-门水平丰度;b-属水平丰度
图11 各组小鼠肠道微生物菌群组成
Fig.11 Composition of intestinal microflora of mices
属水平丰度如图11-b所示,当小鼠摄入脱镁叶绿酸a一段时间后,属水平上主要是拟杆菌属(Muribaculaceae)、乳杆菌属(Lactobacillus)、回肠杆菌(Ileibacterium)和毛螺菌属(Lachnospira)。在属水平上实验组与对照组相比,毛螺菌属(Lachnospira)的丰度有所抑制但无显著性(P>0.05),梭菌属(Clostridium)丰度被显著抑制(P<0.05),推测高脂膳食诱导的肠道菌群和脱镁叶绿酸a的互作产物对其有一定的抑制作用。拟杆菌属(Muribaculaceae)和乳杆菌属(Lactobacillus)丰度显著升高(P<0.05),其作为肠道微生物的重要组成部分参与食物消化和吸收过程,帮助宿主分解复杂的食物成分,在维护肠道健康方面发挥着重要作用。但各实验组肠道菌群丰度变化情况与脱镁叶绿酸a摄入量无明显相关性;这也许是受到肠道微生物自身抵抗力或小鼠个体差异的影响。
肠道菌群失调与肥胖及糖脂代谢紊乱密切相关。研究发现,高脂膳食会导致小鼠脂肪组织堆积、糖耐量受损以及TC、TG等指标含量上升,而脱镁叶绿酸a通过显著提高高脂膳食小鼠体内乳杆菌属(Lactobacillus)等益生菌的丰度,益生菌又通过调节肠道菌群,改善肠道屏障作用,使能量代谢能力提高,抵抗了高脂膳食这一导致肥胖的因素,减少了高脂膳食小鼠体内脂肪堆积,从而延缓肝脏脂肪变性及其炎症反应[29]。
2.7.3 脱镁叶绿酸a对高脂膳食小鼠粪便代谢物的影响
对小鼠粪便代谢物进行非靶向代谢组学分析,结果如图12所示。HFD组小鼠粪便代谢物同NC组存在显著差异(P<0.05),实验组尤其是高浓度组(HFD-Pheo a 0.16、0.12)和HFD组小鼠相比也存在显著差异(P<0.05)。该实验发现高脂膳食诱导的HFD组小鼠与NC组相比出现了草乙酸、甲基-2-羟基异丁酸、α-酮戊二酸等差异代谢物。其中,草乙酸在肠道内可被进一步代谢成其他短链脂肪酸,具有抗炎、抗氧化,调节肝脏能量代谢,维持肠道屏障完整的作用;有助于减少氧化应激对肝脏的损伤,预防慢性炎症和相关的肝脏疾病。α-酮戊二酸作为三羧酸循环的中间产物,帮助提供肝脏代谢所需的能量,参与氨基酸的转运和代谢,具有改善胰岛素抵抗,调节氧化应激等作用。所以当高脂小鼠肠道代谢紊乱时,其体内的INS、TG、TC以及MDA含量会有所升高,这与前文所测的小鼠血清生化指标结果相符合。
图12 各组小鼠粪便代谢物分析
Fig.12 Analysis of fecal metabolites of mices
当高脂膳食小鼠摄入脱镁叶绿酸a后,小鼠体内影响短链脂肪酸生成的相关代谢物(草乙酸、α-酮戊二酸等)出现明显变化,HFD-pheo a 0.16组效果尤为显著。这也可能与脱镁叶绿酸a造成小鼠肠道中拟杆菌属(Muribaculaceae)和乳杆菌属(Lactobacillus)丰度上升有关,二者是产生短链脂肪酸的优势菌,主要产生乙酸与丙酸[10]。说明脱镁叶绿酸a对改善小鼠体内短链脂肪酸生成和肝脏脂质堆积有重要意义,且摄入量越高对其帮助越明显。
3 结论
本实验通过高脂膳食小鼠摄入脱镁叶绿酸a乳液,研究脱镁叶绿酸a对高脂膳食诱导的肝肠损伤缓解效果和作用机制。基于血液生化实验对小鼠血清各项指标的测试,结果表明脱镁叶绿酸a对高脂膳食小鼠体内激素、炎症因子及氧化产物,如TG、INS、IL-6、IL-1β和MDA有明显抑制效果,可有效减轻其患慢性炎症类疾病的风险。基于微生物多样性结果表明,脱镁叶绿酸a在属水平上显著升高拟杆菌属(Muribaculaceae)和乳杆菌属(Lactobacillus)的丰度,降低梭菌属(Clostridium)的丰度。基于UPLC-MS技术对小鼠肝脏和粪便的代谢产物进行分析,结果表明食用脱镁叶绿酸a的高脂膳食小鼠产生的差异代谢物主要富集在丙酮酸代谢、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸生物合成、三羧酸循环等通路,以此来调节高脂膳食小鼠肠道菌群和缓解机体炎症的发生。现有研究结果表明,脱镁叶绿酸a对高脂膳食诱导的肠道菌群及其代谢存在调节作用,具有高脂饮食习惯的代谢综合征人群可多食用富含脱镁叶绿酸a的食物,如紫菜等海藻食品。
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