酱香型白酒以红缨子高粱和小麦为原料酿造而成,在国内外深受广大消费者的喜爱,是中国四大基本香型之一。在历史的进程中,酱香型白酒工艺不断优化创新,最终形成独具特色的“12987”酿造工艺,通过复杂的工艺,酿造出具有酱香突出、幽雅细腻、酒体醇厚、回味悠长和空杯留香等特色的酒体[1]。酱香型白酒工艺的关键支撑点被简称为“四高两长”,“四高”指高温制曲、高温堆积、高温发酵和高温馏酒,其中高温堆积的目的之一是富集堆积环境中的酿酒和非酿造的微生物菌群,因此高温堆积的过程被称为“二次发酵”,是酱香型白酒区别于其他香型白酒的因素之一[2-3]。
酱香型白酒在堆积过程中,温度逐步升高,但堆积醅从内至外,不同部位的温度、溶氧量皆存在差异性,导致不同部位的堆积醅在理化指标、微生物菌群种类上存在明显差异性,进而使不同部位堆积醅富集的物质种类与含量存在差异[4-5]。李喆等[6]对酱香型白酒堆积发酵过程中不同空间位置酒醅差异性比较,明确不同空间位置酒醅存在明显差异性。杨磊等[7]通过调整糟醅堆形状、增加糟醅堆中氧气含量、减少堆糟坝面积3个方面对高温堆积发酵工艺的创新研究进行浅析,并对后续研究方向提出建议。李潮云等[8]研究酱香型白酒二轮次堆积发酵酒醅,明确堆积过程中理化指标的变化规律。当前堆积工艺研究中,对堆积过程理化指标差异变化、微生物群落种类与数量差异变化的研究内容较多,但是上述差异最终导致产酒酒体差异的研究内容较少。
本研究旨在对比不同部位堆积醅因理化差异所导致单独发酵产酒酒体,在酒质、风味感官、四甲基吡嗪、色谱理化指标等方面的差异情况,为酱香型白酒堆积工艺的创新优化提供一定参考。
1 材料、设备与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 材料
酱香型白酒酒醅:取自神农架生态酒业酿造车间三、四、五、六轮次完成高温堆积准备入窖池发酵的酒醅,以堆积醅底部中心为原点,分为里层(0～60 cm)、中层(60～160 cm)、外层(160～210 cm)、表面(210～230 cm)4个部分堆积醅。
分层原理:以入窖前堆积醅不同部位温度作为分层依据,30～35 ℃为里层,35～40 ℃为中层,40～45 ℃为外层,45～50 ℃为表面。
酒醅理化检测样品:取自不同部位堆积醅,每个部位堆积醅取样点位如图1所示,不同水平同一部位和同一水平不同位置的取样点共12个,每个取样点取200 g糟醅,均匀混合后,取500 g糟醅用于理化检测[7]。
a-堆积醅分层剖面图;b-堆积醅分层平面图
图1 堆积醅分层剖面图与平面图
Fig.1 Sectional map and plan of stacked grains
酱香型白酒酒样:来自三～六轮次不同部位堆积醅单独发酵产酒,酒体酒精度分别为55%vol、55%vol、54%vol、54%vol,从三～六轮次,每轮次里层、中层、外层、表面等部位单独发酵产酒的酒样各10瓶,三～六轮次不同部位堆积醅单独发酵产酒的酒样共160瓶,酒样样品均在避光、恒温(20 ℃左右)、恒湿(70%左右)且密封的酒窖中储藏2个月以上[9-10]。
1.1.2 试剂
1.1.2.1 糟醅理化检测试剂
酚酞、亚铁氰化钾(均为分析纯),天津市北联精细化学品开发有限公司;CuSO4·5H2O(均为分析纯),天津市凯通化学试剂有限公司;亚甲基蓝(均为分析纯),天津市科密欧化学试剂有限公司;NaOH、酒石酸钾钠、葡萄糖、邻苯二甲酸氢钠(均为分析纯),国药集团化学试剂有限公司。
1.1.2.2 酒样四甲基吡嗪检测试剂
四甲基吡嗪、2-乙酰基吡啶(均为色谱纯),上海安谱实验科技股份有限公司;二氯甲烷、无水乙醇、水乙醚、乙酸乙酯、无正己烷(均为色谱纯),美国MERCK公司;乙酸、乙酸钠、Na2CO3、NaHCO3、NaCl、无水硫酸钠(均为分析纯),国药集团化学试剂有限公司;研究用水为实验室自制超纯水[1]。
1.1.2.3 试验酒样多元醇检测试剂
丙三醇、赤藓糖醇、木糖醇(标准品)、水杨苷(内标物质)、N,O-双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺[Bis (trimethylsilyl)trifluoroacetamide,BSTFA]衍生剂、甲醇、无水乙醇(均为色谱纯)、吡啶(分析纯),国药集团化学试剂有限公司,研究用水为实验室自制超纯水。
1.2 仪器与设备
1.2.1 酿造试验设备
100 L容积的圆形网格状小桶40个,博贸金属制品有限公司;有编号的不锈钢吊牌40个,宝洲五金电器有限公司;发酵窖池,劲牌神农架酒业酿造车间设备;5个分体式酒甑,并存在对应的蒸汽管道、冷凝水管道和废水排放管道,劲牌神农架酒业小试试验蒸馏平台。
1.2.2 理化检测设备
DHG-9240A鼓风干燥箱,上海精其仪器有限公司;HH-6数显恒温水浴锅,上海浦春计量仪器有限公司。
1.2.3 四甲基吡嗪检测设备
Agilent 8890-5977B气相色谱-质谱联用仪、DB-FFAP毛细管色谱柱(60 m×0.25 mm,0.25 μm)、HP-5色谱柱(30 m×0.25 mm,0.25 μm),美国Agilent科技有限公司;ODP4嗅闻仪、MPS-2型多功能自动进样系统,德国Gerstel公司;SPME三相萃取头(1 cm 50/30 μm DVB/CAR/PDMS),美国Supelco公司;Milli-Q超纯水仪,美国Millipore公司;AB135-S十万分之一电子分析天平,美国Mettler-Toledo公司;FA2004万分之一天平,上海精密科学仪器有限公司;Multi Reax涡旋振荡仪,德国海道夫仪器公司;ZNCL-BS智能磁力搅拌器,巩义市予华仪器有限责任公司[11]。
1.2.4 多元醇检测设备
Agilent 8890-5977B气相色谱-质谱联用仪,美国Agilent科技有限公司;HP-5MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm)毛细管色谱柱,美国Agilent科技有限公司;AB135-S十万分之一电子分析天平,美国Mettler-Toledo公司;DC12H氮吹仪,上海安谱科技有限公司;电热恒温鼓风干燥箱,黄石恒丰医疗器械厂;Multi Reax涡旋振荡仪,德国海道夫仪器公司;SK8200HP超声波清洗器,上海科导超声仪器有限公司;MPS Robotic自动进样器,德国GERSTEL(哲斯泰)公司。
1.3 试验方法
1.3.1 三、四、五、六轮次不同部位堆积醅单独发酵酱香型白酒制作
根据劲牌神农架酒业酱香型白酒的生产条件,将三、四、五、六轮次完成高温堆积待入窖池发酵的堆积醅进行分层,不同部位堆积醅分别装入100 L容积的网格状小桶内,每个部位装10桶,每桶装40 kg,每轮次10组试验,每组试验里层、中层、外层、表面酒醅各1桶。将小桶埋入窖池同一水平,发酵35～40 d后取出,在劲牌神农架酒业小试试验平台上甑馏酒和取酒样,平台单个酒甑容积与单个小桶酒醅量对应。
1.3.2 酒醅常规理化指标检测
酒醅中水分、酸度、淀粉、还原糖含量的测定,参照DB34/T 2264—2014《固态发酵酒醅分析方法》[12]。
1.3.3 酒样四甲基吡嗪含量检测
1.3.3.1 样品溶液的配制
以无水乙醇为溶剂配制四甲基吡嗪标准溶液,质量浓度范围为10～200 mg/L。样品溶液配制时需将上述标准溶液根据检测酒样的酒精度数,用体积分数为55%或54%的乙醇溶液稀释100倍。
1.3.3.2 工作液的配制
以二氯甲烷为溶剂配制四甲基吡嗪标准溶液,以二氯甲烷做溶剂逐级稀释成标准系列工作液1～6,标准系列工作液中四甲基吡嗪的质量浓度范围660.12～38 749.00 μg/L。
1.3.3.3 内标液的配制
以二氯甲烷为溶剂配制质量浓度500.0 mg/L 2-乙酰基吡啶作为内标溶液[1]。
1.3.3.4 提取方法
准确吸取4 mL 1.3.3.1节中所述样品于50 mL离心管中,加入20 μL(2-乙酰基吡啶,500 mg/L)内标溶液,混合均匀,以Na2CO3/NaHCO3缓冲液调节pH值为5～6,加超纯水稀释酒样酒精度为10%vol,加入NaCl进行饱和,涡旋5 min,再分别加入2 mL不同萃取溶剂,涡旋振荡5 min,冰浴超声波10 min,以8 000 r/min离心10 min,静置12 h,收集下层萃取液,加入无水Na2SO4脱水,过滤后所得样液用气相色谱-氮磷检测仪(gas chromatography-nitrogen phosphorus detector,GC-NPD)分析。
酒样同样使用上述方法提取四甲基吡嗪,并进行GC-NPD分析。
1.3.3.5 分析检测仪器条件
气相色谱条件:进样口温度为250 ℃,进样量为1 μL,分流进样,分流比为10∶1;载气为高纯N2(纯度≥99.999%),流速为1 mL/min;升温程序:初温60 ℃,保持2 min,以3 ℃/min升至150 ℃,再以40 ℃/min升至240 ℃,保持5 min[13]。
NPD检测器条件:温度300 ℃,H2流速3 mL/min,空气流速60 mL/min,尾吹气流速8 mL/min[11]。
1.3.4 酒样多元醇含量的检测
1.3.4.1 标准储备液的配制
分别准确称取1.1.2.3节中的标准品适量于10 mL容量瓶中,用甲醇定容至刻度,混匀后储于棕色玻璃瓶中备用。
1.3.4.2 内标使用液的配制
准确称取1.1.2.3节中的内标物适量于容量瓶中,用无水乙醇定容至刻度,使内标使用液质量浓度约为20 mg/L,混匀后储于棕色玻璃瓶中备用。
1.3.4.3 混合标准中间液的配制
分别吸取适量1.3.4.1节中的标准储备液于10 mL容量瓶中,用甲醇定容,得到混合标准中间液HB0,混匀后储于棕色玻璃瓶中备用。
1.3.4.4 标准系列工作液的配制
分别吸取HB0溶液0.05、0.10、0.25、0.50、1.00、1.50、2.00 mL于5 mL容量瓶中,用甲醇定容至刻度,混匀后储于棕色玻璃瓶中备用,记为HB1～HB7。
1.3.4.5 样品前处理
分别取酒样20 mL,用旋转蒸发仪在真空条件下蒸干,用1 mL甲醇溶解,取100 μL于2 mL液相小瓶中,再加入100 μL内标使用液,混匀后室温下温和N2吹干,待衍生化。
BSTFA衍生化:取上述吹干后的标准溶液和样品,依次加入100 μL BSTFA衍生剂和100 μL吡啶,摇匀,70 ℃反应3 h,反应完成储存于-20 ℃下。将样品和标准系列工作液HB1～HB7用GC-MS分析。
1.3.4.6 仪器参考条件
气相色谱条件:进样口温度为250 ℃;载气为He,流速1.0 mL/min,分流比20∶1;升温程序为初温40 ℃,保持2 min,以6 ℃/min升温至150 ℃,再以2 ℃/min升温至180 ℃,最后以10 ℃/min升温至270 ℃,并保持10 min。
质谱条件:电子电离源,电子能量70 eV,离子源温度230 ℃;扫描质量范围50～650 aum;扫描方式:先采用全扫描模式进行定性分析,并对仪器参数进行优化,确定目标化合物和对应内标物的保留时间及特征离子,然后对化合物进行分组,再采用选择离子监测(selected ion monitoring,SIM)扫描。
1.3.5 感官评价
1.3.5.1 产酒酒质品评分级
依据GB/T 26760—2011《酱香型白酒》以及S-BZ-ZL-036 《劲牌神农架酒业公司大曲酱香基酒验收标准》,选择符合GB/T 33404—2016《白酒感官品评导则》的品酒容器,容量为50 mL、无色透明、无花纹的酒杯,组织劲牌公司8位国家级评酒委员在温度为(20±1) ℃的品评室内对三～六轮次不同部位堆积醅单独发酵产酒的酱香型白酒样品进行质量分级,同时对产酒酒体的色、香、味、格进行品评分级,分为酱香、一等醇甜、二等醇甜[9]。
1.3.5.2 风味感官品评
根据国际感官分析标准(ISO 8586:2012)和国家标准GB/T 12311—2012《感官分析方法 三点检验》,组织劲牌公司8位国家级评酒委员在温度为(20±1) ℃的品评室内对三～六轮次不同部位堆积醅单独发酵产酒的酱香型白酒样品进行感官评价。分别将20 mL酱香型白酒样品倒入专用白酒品尝杯中,由所有小组成员嗅闻白酒样品讨论香气属性,筛选出酱曲香、花果香、酸香、粮香、焦香、甜感、绵感、酸味、涩味、杂味、焦糊味共10个香气属性;随后小组成员采取0～5分制(感官越好分数越高)对样品10个香气属性的强度进行评分[2-3]。
1.4 试验次数与数据分析方法
三、四、五、六轮次不同部位堆积醅单独发酵试验,每轮次10组试验,每组试验里层、中层、外层、表面等部位酒醅各1桶(即一甑)。平行试验的“平均值±标准偏差”表示各化合物的最终定量结果。分别采用SPSSAU对样本的数据进行整理,采用origin对数据进行图形展示。
2 结果与分析
2.1 三、四、五、六轮次不同部位堆积醅理化指标
酱酒固态发酵过程中,水分、酸度、还原糖和淀粉含量,都是酒醅发酵的重要理化指标,对指导酱酒生产过程中的工艺调控具有重要意义,每轮次的理化指标过高或者过低都不利于酒醅中微生物的繁殖代谢,最终影响产酒酒质[14]。
李喆等[6]的试验表明,酒堆不同空间位置酒醅的理化参数及风味物质成分存在显著差异性。本实验分析了三到六轮次入窖堆积醅理化指标变化规律,发现同一轮次不同部位酒醅理化指标存在差异,且不同轮次同一部位酒醅理化指标也存在差异,与李喆等[6]试验结论基本一致。
如图2所示,同轮次不同部位堆积醅入窖、出窖的水分、酸度,从外至里呈现上升趋势;不同轮次同一部位堆积醅入窖、出窖水分随着轮次的增加,水分逐步升高,酸度逐步降低;同一轮次同一部位堆积醅,从入窖至出窖,酒醅水分、酸度升高。同轮次入窖堆积醅中,中层堆积醅还原糖含量最高;不同轮次同一部位堆积醅入窖还原糖含量呈先上升后降低;同一轮次不同部位堆积醅从入窖至出窖,还原糖含量皆明显降低。同一轮次不同部位堆积醅入窖淀粉含量,从外至里整体呈现降低趋势;不同轮次同部位堆积醅入窖淀粉含量,随着轮次的增加淀粉被逐步消耗。
a-三～六轮次不同部位堆积醅入窖、出窖水分含量;b-三～六轮次不同部位堆积醅入窖、出窖酸度含量;c-三～六轮次不同部位堆积醅入窖、出窖还原糖含量;d-三～六轮次不同部位堆积醅入窖、出窖淀粉含量
图2 三～六轮次不同部位堆积醅入窖、出窖理化指标
Fig.2 Three to six rounds of different parts of the accumulation of fermented grains into the cellar and out of the cellar physical and chemical indicators
2.2 三、四、五、六轮次不同部位堆积醅产酒酒质差异
本实验分析了三～六轮次堆积醅单独发酵产酒酒质差异,如表1所示,三～六轮次中层与里层堆积醅单独发酵产酒酒质整体明显优于表面与外层堆积醅产酒酒质。
表1 三～六轮次堆积醅不同部位单独发酵产酒酒质 单位:%
Table 1 Three to six rounds of accumulation of fermented grains in different parts of the separate fermentation to produce wine quality
部位酱香率一等醇甜率二等醇甜率三轮次表面08020外层08020中层10900里层108010四轮次表面08020外层08020中层10900里层10900五轮次表面08020外层09010中层108010里层10900六轮次表面06040外层07030中层01000里层01000
2.3 三、四、五、六轮次不同部位堆积醅产酒感官评定结果分析
酱酒风味感官品评是区分酱酒酒质等级以及酱酒酒体特色风味的重要指标,本试验利用感官定量描述分析结果绘制感官雷达图(图3),单因素方差分析结果表明,劲牌神农架酒业不同部位酒醅单独发酵产酒,三、四轮次不同部位堆积醅产酒的酱曲香、甜感、绵感得分最高,五、六轮次不同部位堆积醅产酒焦香得分最高,与许忠平等[15]的研究表明南方其他地区样品花果香和草木香得分高的结论存在差异,这可能与神农架林区特殊的地理位置与地理环境有关。
a-三轮次不同部位堆积醅产酒风味感官;b-四轮次不同部位堆积醅产酒风味感官;c-五轮次不同部位堆积醅产酒风味感官;d-六轮次不同部位堆积醅产酒风味感官
图3 三～六轮次不同部位堆积醅单独发酵产酒感官评分
Fig.3 Three to six rounds of different parts of the accumulation of fermented grains alone fermentation wine sensory score
同轮次不同部位堆积醅单独发酵产酒在酱曲香、花果香、酸香、粮香、焦香、甜感、绵感、酸味、涩味、杂味、焦糊味存在显著性差异(P<0.05)[16]。在香气上,中层、里层堆积醅单独发酵产酒的酱曲香、花果香、粮香、焦香、甜感、绵感优于表面与外层堆积醅单独发酵产酒,表面、外层堆积醅单独发酵产酒的涩味、杂味、焦糊味明显高于中层、里层堆积醅单独发酵产酒酒体。
2.4 三、四、五、六轮次不同部位堆积醅产酒四甲基吡嗪含量变化
在酱香型白酒中,四甲基吡嗪是酱酒主要的健康功能成分之一。四甲基吡嗪由美拉德反应生成,在制曲和堆积发酵中产生,经蒸馏带入酒中,具有扩张血管,改善微循环及抑制血小板积聚作用[17]。
借鉴姚贤泽等[18]试验对比质量差异的思路,本实验将产酒酒体四甲基吡嗪含量作为酱酒酒质差异的指标之一,对三～六轮次不同部位堆积醅单独发酵产酒的四甲基吡嗪含量进行检测分析,结果如图4所示,随着生产轮次的增加,同一部位堆积醅单独发酵产酒酒体中的四甲基吡嗪含量逐步降低,且降幅十分明显。
图4 三～六轮次不同部位堆积醅单独发酵产酒四甲基吡嗪含量
Fig.4 The content of tetramethylpyrazine produced by separate fermentation of fermented grains in different parts of three to six rounds
表面与外层堆积醅单独发酵产酒中四甲基吡嗪含量明显高于中层与里层堆积醅单独发酵产酒,结合彭奎等[19]的研究结果可知,是由于表面与外层堆积醅易与空气接触,酒醅中的溶氧量更高以及酒醅温度更高,使得表面与外层酒醅更适宜产四甲基吡嗪的芽孢杆菌繁殖代谢,最终导致表面与外层酒醅单独发酵产酒酒体中的四甲基吡嗪含量更高。
2.5 三、四、五、六轮次不同部位堆积醅产酒多元醇含量变化
多元醇是酒醅中的酵母菌在生成酒精的同时通过发酵还原糖生成的,由于糖不能进入白酒中,多元醇是形成白酒甜味的主要来源。在酱香型白酒中,多元醇同样是酱酒醇甜感的主要来源[20]。
本实验对三～六轮次不同部位堆积醅单独发酵产酒的多元醇含量进行检测分析,结果如图5所示,三、四轮次中层堆积醅单独发酵产酒的丙三醇含量最高,五、六轮次里层堆积醅单独发酵产酒的丙三醇含量最高。从三～六轮次的不同部位堆积醅产酒的丙三醇含量来看,酒体中丙三醇含量呈先上升后降低的趋势,在四轮次时各部位堆积醅单独发酵产酒酒体中的丙三醇含量最高。
a-不同轮次不同部位堆积醅丙三醇含量;b-不同轮次不同部位堆积醅赤藓糖醇含量;c-不同轮次不同部位堆积醅木糖醇含量
图5 三～六轮次不同部位堆积醅单独发酵产酒多元醇类含量
Fig.5 The content of polyols produced by separate fermentation of fermented grains in different parts of three to six rounds
同一轮次不同部位堆积醅单独发酵产酒的赤藓糖醇含量整体差异较小,三轮次不同部位堆积醅产酒酒体赤藓糖醇含量最高,且随着轮次的增加,各部位堆积醅单独发酵产酒酒体中的赤藓糖醇含量逐步降低。
从三～六轮次里层堆积醅单独发酵产酒木糖醇含量最高。各部位堆积醅单独发酵产酒酒体中五轮次不同部位堆积醅产酒的木糖醇含量最高,且三、四、六轮次不同部位堆积醅产酒的木糖醇含量皆较低。
3 结论
本研究将神农架生态酒业酿造车间三～六轮次堆积醅进行分层发酵,对不同部位堆积醅理化指标差异和单独发酵产酒差异进行研究。结果表明:a)同轮次不同部位堆积醅和不同轮次同一部位堆积醅在入窖、出窖理化指标变化上具有一定规律性;b)三～六轮次中层与里层堆积醅单独发酵产酒酒质整体优于表面与外层堆积醅产酒酒质;c)在风味感官上,中层、里层堆积醅单独发酵产酒的酱曲香、花果香、粮香、焦香、甜感、绵感优于表面与外层堆积醅单独发酵产酒,涩味、杂味、焦糊味明显低于表面、外层堆积醅单独发酵产酒;d)随着生产轮次的增加,同一部位堆积醅单独发酵产酒酒体中的四甲基吡嗪含量逐步降低,且降幅十分明显。表面与外层堆积醅单独发酵产酒中四甲基吡嗪含量明显高于中层与里层堆积醅单独发酵产酒;e)三、四轮次中层堆积醅单独发酵产酒的丙三醇含量最高,五、六轮次里层堆积醅单独发酵产酒的丙三醇含量最高。在四轮次时各部位堆积醅单独发酵产酒酒体中的丙三醇含量最高。同一轮次不同部位堆积醅单独发酵产酒的赤藓糖醇含量整体差异较小,三轮次不同部位堆积醅产酒酒体赤藓糖醇含量最高,且随着轮次的增加,各部位堆积醅单独发酵产酒酒体中的赤藓糖醇含量逐步降低。从三～六轮次,里层堆积醅单独发酵产酒木糖醇含量最高。五轮次各部位堆积醅单独发酵产酒酒体中木糖醇含量最高,三、四、六轮次不同部位堆积醅产酒酒体中的木糖醇含量皆较低。三～六轮次不同部位堆积醅单独发酵产酒酒体,在丙三醇、赤藓糖醇、木糖醇的含量上具有一定规律性。
本实验通过研究不同部位堆积醅的理化差异和单独发酵产酒差异,明确三～六轮次堆积醅不同部位理化指标差异以及明确三～六轮次不同部位堆积醅产酒酒质、风味感官、四甲基吡嗪含量、多元醇含量的差异。为堆积过程中,通过调整表面与外层堆积醅的理化指标,使得表面与外层堆积醅理化向中层和里层靠近,提高堆积醅中的中层、里层堆积醅占比,从而提高堆积醅入窖发酵后产酒酒质的工艺优化提供依据,也为提高产酒酒体四甲基吡嗪含量提供思路。
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