糖尿病(diabetes mellitus, DM)因其严重程度和高发病率引起全世界的广泛关注。餐后高血糖是糖尿病患者的主要症状。α-葡萄糖苷酶(α-glucosidase, AG)是位于小肠细胞中消化碳水化合物最后一步的关键葡萄糖苷水解酶,催化二糖和低聚糖转化为可吸收的单糖,从而引发后高血糖现象。AG抑制剂可通过竞争性抑制糖苷酶活力,延缓碳水化合物的消化和减少葡萄糖的吸收,可有效降低餐后高血糖,有助于治疗糖尿病及相关并发症[1-3]。目前,市场上常用的降糖药物是阿卡波糖[4]和伏格列波糖[5],均属于化学合成类药物,对人体有许多副作用,如胃肠功能障碍、腹胀和腹泻[6]。因此,开发具有高葡萄糖苷酶抑制活性和低毒性的新药具有重要意义。

药物开发工作的早期阶段主要集中在药物的识别及筛选。近年来,研究者从食品蛋白质水解物中提取多种生物活性肽[7-9],然而要从成分复杂的蛋白酶解液中分离出生物活性肽,需经过多步纯化,步骤繁琐,耗时长。固定化酶利用酶与抑制剂间的特异性相互作用,可实现复杂混合物中目标分子的快速筛选和富集[10-11]。已有课题组利用磁性介质固定化血管紧张素转换酶(angiotensin converting enzyme,ACE),用于分离和识别长蛇鲻鱼蛋白水解物中ACE抑制肽的分离[12];孙美玲[13]将ACE固定在介孔分子筛Zn-SBA-15上,用于ACE抑制肽的亲和分离,并结合反相高效液相色谱(reverse phase high performance liquid chromatography,RP-HPLC)对亲和分离组分进一步分离纯化,最终分离得到2个ACE抑制肽。可见,将固定化酶用于酶抑制剂的分离纯化是可行的[14-16],由于金属有机骨架(metal organic frameworks, MOFs)具有高比表面积、高孔隙率以及良好稳定性等特点,已成为一种很有前途的酶固定化载体。目前,利用MOFs固定化AG,并将其作为亲和分离介质,用于AG抑制剂的分离纯化鲜见文献报道。

本研究将AG原位封装在沸石咪唑酯骨架结构材料(zeolitic imidazolate framework,ZIF-7)中,然后利用多巴胺的自聚合反应[17],在其表面包裹一层聚多巴胺(polydopamine,PDA),制备得到一种新型的固定化酶3-MPBA/AG@aZIF-7/PDA。然后以2种不同类型的AG抑制剂：Ile-Tyr-Gly(ITG,非竞争型抑制剂)与Cys-Tyr-Gly(CTG,竞争型抑制剂)[18]作为抑制剂模型分子,考察了多肽浓度、吸附时间、pH和温度等因素对3-MPBA/AG@aZIF-7/PDA吸附能力的影响,并对其吸附机理进行探讨,为酶抑制剂的产业化制备提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

多肽ITG和CTG(98%),吉尔生化(上海)有限公司;HPLC级三氟乙酸(99.9%),上海阿拉丁生化技术有限公司;HPLC级甲醇、乙腈,上海麦克林生化科技有限公司;其余试剂均为国产分析纯;实验用水为娃哈哈纯净水。

1.2 仪器与设备

Agilent 1260型高效液相色谱仪,美国安捷伦公司;反相色谱柱(Zorbax SB-C18,4.6 mm×150 mm)、BCE224I-1CCN型分析天平,赛多利斯有限公司;DF-101S型集热式恒温磁力搅拌器,上海力辰邦西仪器科技有限公司;H1850R型低温高速离心机,湖南湘仪实验室仪器开发有限公司;FD-1A-50型冷冻干燥机,博医康(北京)仪器有限公司;PHS-3E型pH计,上海仪电科学仪器股份有限公司;SUPRA 55 Sapphire场发射电子显微镜(scanning electron microscopy,SEM);JSM-F200透射电子显微镜(transmission electron microscope,TEM),JEOL公司;MiniFlex600 X射线衍射(X-ray diffraction,XRD),Rigaku公司;Nicolet IS10傅里叶变换红外光谱仪(Fourier transform infrared spectrometry,FT-IR),Thermo公司。

1.3 实验方法

1.3.1 3-MPBA/AG@aZIF-7/PDA的制备

采用一步原位包埋法合成了3-MPBA/AG@aZIF-7。用磷酸盐缓冲溶液(pH=6.8, 50 mmol/L)配制AG溶液(8 mg/mL)。取1 mL酶溶液与5.2 mg 3-巯基苯硼酸(3-mercaptophenylboronic acid,3-MPBA,溶于20 μL 乙醇)混合,加入到25 mL楔形瓶中,然后加入0.5 mL六水合硝酸锌溶液(56 mmol/L)和5 mL苯并咪唑(50 mmol/L),在25 ℃下持续搅拌50 min。反应结束后,离心(10 000 r/min,10 min)收集沉淀,并用磷酸盐缓冲溶液反复清洗,得到3-MPBA/AG@aZIF-7。

用Tris-HCl(pH=8.5,50 mmol/L)缓冲液配制1 mg/mL多巴胺溶液。吸取10 mL上述溶液,然后加入3-MPBA/AG@aZIF-7(1 g)和48.13 mg过硫酸铵(ammonium persulfate,APS),混匀后,在25 ℃,150 r/min条件下,振荡2 h。反应结束后,离心(10 000 r/min,10 min)收集沉淀,并用去离子水反复洗涤3次,冷冻干燥24 h后,得到3-MPBA/AG@aZIF-7/PDA。

1.3.2 材料表征

使用场发射电子显微镜和TEM对材料表面形貌结构进行表征;采用XRD分析样品的晶体结构;利用FT-IR对材料的表面官能团进行分析。

1.3.3 多肽的测定方法

采用HPLC法测定多肽浓度,测定条件为：使用液相色谱柱Zorbax SB-C18(4.6 mm×150 mm,5 μm),柱温25 ℃,进样量20 μL,检测波长220 nm;检测ITG流动相：95%纯水[含有0.1%体积分数三氟乙酸(trifluoroacetic acid,TFA)]：5%纯乙腈(含0.1%TFA);检测CTG流动相：90%纯水(含有0.1%TFA)：10%纯乙腈(含有0.1%TFA);流速为1.0 mL/min。

1.3.4 吸附单因素试验

称取10 mg 3-MPBA/AG@aZIF-7/PDA,与1 mL多肽溶液混合,吸附一定时间,然后采用HPLC法测定上清液的多肽浓度,按照公式(1)计算材料对多肽的吸附量：

(1)

式中：C0表示吸附前溶液中AG抑制肽的质量浓度,mg/mL;Ct表示时间t时溶液中AG抑制肽的质量浓度,mg/mL;Qt表示给定时间t时溶液中AG抑制肽的吸附量,mg/g;V表示吸附溶液的体积,mL;W表示吸附剂的干重,g。分别考察多肽质量浓度、吸附时间、吸附pH和吸附温度对吸附量的影响。

1.3.5 吸附动力学和吸附等温线研究

基于优化的单因素试验,对3-MPBA/AG@aZIF-7/PDA的吸附机理进行研究。实验条件设置如下：3-MPBA/AG@aZIF-7/PDA 10 mg;温度25 ℃(ITG)或20 ℃(CTG);pH 7.0;多肽质量浓度 4.8 mg/mL(ITG)和3.0 mg/mL(CTG)。采用拟一级动力学模型、拟二级动力学模型拟合实验数据[19]。拟一级和拟二级动力学方程分别如公式(2)、公式(3)所示：

Qt=Qe(1-e-k1t)

(2)

(3)

式中：Qe为平衡吸附容量拟合值,mg/g;Qt为t时间时对应的吸附容量,mg/g;k1为一级吸附速率常数,min-1;k2为二级吸附速率常数,g/(mg·min);t为吸附时间,min。

采用Langmuir和Freundlich等温吸附模型对吸附数据进行分析,研究3-MPBA/AG@aZIF-7/PDA与多肽之间的吸附[20]。Langmuir、Freundlich方程分别如公式(4)、公式(5)所示：

(4)

(5)

式中：Ce为吸附平衡时溶液中抑制肽的质量浓度,mg/mL;Qm为最大吸附量,mg/g;Qe为平衡吸附量,mg/g;KL为Langmuir常数,L/mg;KF为Freundlich常数,mg/g;n为表征吸附强度的Freundlich常数。

1.3.6 复杂体系中AG抑制肽的筛选

1.3.6.1 火麻仁蛋白酶解液中AG抑制肽的吸附及洗脱

按照参考文献的方法制备火麻仁蛋白酶解液[21]。称取20 mg固定化酶3-MPBA/AG@aZIF-7/PDA,加入2 mL火麻仁蛋白酶解液,在室温下振荡吸附30 min后,离心(7 000 r/min,10 min),弃上清液,用纯水洗涤材料3次,将未吸附的多肽洗净。随后加入2 mL 2 mol/L氯化钠对吸附的多肽进行洗脱(室温,30 min),离心(7 000 r/min,10 min),收集上清液,并测定其AG抑制率。

1.3.6.2 AG抑制率的测定方法

在EP管中依次加入20 μL AG溶液、30 μL待测样品和700 μL 磷酸盐缓冲溶液(pH=6.8, 50 mmol/L),混合均匀后在37 ℃下孵育10 min,随后加入100 μL 4-硝基苯-α-D-葡萄糖苷溶液(4-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside,PNPG,20 mmol/L),37 ℃条件下反应10 min。加入150 μL 碳酸钠溶液(1 mol/L)终止反应。用紫外分光光度计测定反应液在405 nm下的吸光度值,并按照公式(6)计算AG抑制率：

AG抑制率

(6)

式中：A0为不加样品的空白组的吸光值;A1为加入样品组的吸光值;A2为不加样品、不加酶溶液的对照组的吸光值。

2 结果与分析

2.1 生物复合材料结构表征

2.1.1 SEM和TEM分析

采用SEM和TEM对3-MPBA/AG@aZIF-7/PDA的微观形貌进行表征,结果如图1所示。由图1-a可知,3-MPBA/AG@aZIF-7/PDA为不规则的球形纳米颗粒。TEM图如图1-b所示,同样显示了该固定化酶团簇是不规则的球形纳米颗粒组成,这与SEM结果一致。

2.1.2 XRD分析

通过粉末X射线衍射对3-MPBA/AG@aZIF-7/PDA的结构进行分析,结果如图2所示。3-MPBA/AG@aZIF-7/PDA的峰型较宽,表现为弥散峰,说明该生物复合材料属于无定形材料。在本文中,固定化AG是在低浓度的苯并咪唑和Zn(NO3)2条件下制备,已有研究表明,低浓度有机配体和金属离子合成的MOFs多为无定型结构[22]。

2.1.3 FT-IR分析

图3为3-MPBA/AG@aZIF-7/PDA的FT-IR图谱。428、742、1 466、1 241、680、1 370 cm-1处的特征峰分别对应于苯环的Zn—N键、C—H、C—C振动、咪唑环的C—C拉伸振动、3-MPBA的C—S和B—O。1 641 cm-1处的信号对应于AG上Zn2+与羧基之间的配位[23]。3-MPBA/AG@aZIF-7/PDA在3 200～3 650 cm-1处出现较宽的红外光谱带,对应于PDA中醇、儿茶酚和N—H键的拉伸[24],这些结果表明生物复合材料的成功合成。

2.2 ITG和CTG标准曲线

根据HPLC的分析结果,绘制多肽的标准曲线,如图4所示。ITG的标准曲线拟合方程为y=5 188.728 7x-619.507 59,R2=0.995 7;CTG的标准曲线拟合方程为y=9 407.559 12x+518.555 98,R2=0.995 6。2个拟合方程在多肽质量浓度为0.5～2.5 mg/mL时呈良好的线性关系。

2.3 3-MPBA/AG@aZIF-7/PDA的吸附性能

以ITG和CTG作为多肽模型对3-MPBA/AG@aZIF-7/PDA的吸附性能进行研究。

2.3.1 多肽浓度对吸附效果的影响

固定化酶3-MPBA/AG@aZIF-7/PDA在不同多肽浓度下的吸附效果如图5所示。复合材料对ITG和CTG的吸附量随着多肽浓度的增加而增加,但是超过一定浓度后,吸附量基本保持不变。固定化酶对抑制肽的吸附量受酶负载量的影响,不能无限增加。当多肽浓度较低时,增加浓度,可以提高多肽的传质速率,但是达到吸附饱和后,继续增大多肽浓度,吸附量不会发生明显变化。此外,ITG的吸附量高于CTG,这可能是因为ITG是一种非竞争型抑制肽,在AG上有多个结合位点,而CTG是一种竞争型抑制肽,主要结合到酶的活性位点上[18]。

2.3.2 吸附时间对吸附效果的影响

在ITG和CTG初始质量浓度分别为4.8和3.0 mg/mL时,测定不同吸附时间条件下3-MPBA/AG@aZIF-7/PDA的吸附量,结果如图6所示。在0～20 min内,吸附量随吸附时间的延长逐渐增加,这可能是因为多肽从溶液中到达吸附位点需要一定的时间。当吸附时间达到20 min,继续延长吸附时间,吸附量增加不明显,此时材料上大量的吸附位点被占据,吸附与解吸逐渐达到平衡状态[25]。

2.3.3 pH对吸附效果的影响

不同pH条件下,3-MPBA/AG@aZIF-7/PDA对ITG和CTG的吸附如图7所示。吸附量随pH值的变化而变化,因为这2种肽的吸附是基于酶与抑制肽的特异性相互作用。在不同pH条件下,多肽的结构发生了变化,影响了传质速率,从而改变了吸附行为。对于ITG,pH值在5.0～8.0保持不变,选温和的中性条件进行吸附,即选择pH值为7.0;CTG的最佳吸附pH值为7.0。

2.3.4 温度对吸附效果的影响

在不同温度条件下,3-MPBA/AG@aZIF-7/PDA对ITG和CTG的吸附如图8所示。温度对固定化酶吸附抑制肽的影响取决于具体的酶和肽的性质。一般来说,升高温度可能会增加酶的活力和亲和力,从而增强固定化酶对抑制肽的吸附[26]。然而,过高的温度可能会导致酶的变性或失活,从而减弱对抑制肽的吸附能力。ITG的最佳的吸附温度为25 ℃;CTG最佳的吸附温度为20 ℃。

2.4 吸附动力学研究

为进一步探究ITG和CTG在3-MPBA/AG@aZIF-7/PDA上的吸附机理,分别采用拟一级动力学模型(pseudo-first-order kinetic model,PFO)和拟二级动力学模型(pseudo-secord-order kinetic model,PSO)对实验数据拟合,结果如图9所示。3-MPBA/AG@aZIF-7/PDA对ITG和CTG的吸附量随着吸附时间的延长而增加,在20 min后达到吸附平衡。根据拟合结果得到的吸附参数如表1所示,对于ITG和CTG,PFO的R2分别为0.996 8和0.994 7,高于PSO的R2,且PFO拟合得到平衡吸附量更接近实验值,表明3-MPBA/AG@aZIF-7/PDA对ITG和CTG的吸附更符合拟一级动力学模型,以物理吸附为主。

2.5 吸附等温线研究

配制一系列不同浓度的多肽溶液,测定不同多肽浓度条件下3-MPBA/AG@aZIF-7/PDA对多肽的吸附效果,然后分别采用Langmuir模型和Freundlich模型对数据进行拟合,结果如图10所示,吸附参数如表2所示。对于ITG的吸附,Langmuir模型和Freundlich模型的相关系数R2分别为0.928 4和0.883 3,表明Langmuir模型拟合出来的结果与实际的测定数据更吻合,吸附是一个单分子层吸附过程,吸附位点是有限的。对于CTG的吸附,同样Langmuir模型拟合出来的结果与实际的测定数据更吻合,属于单分子层吸附。此外,Langmuir模型拟合得到的ITG和CTG最大吸附量Qmax分别为372.83 mg/g和183.33 mg/g,表明3-MPBA/AG@aZIF-7/PDA是一种很有前途的富集AG抑制肽的材料。

2.6 复杂体系中AG抑制肽的筛选

将3-MPBA/AG@aZIF-7/PDA作为亲和分离介质,对火麻仁蛋白酶解液中的AG抑制肽进行分离纯化,收集洗脱液,并测定其对AG的抑制活性,结果如表3所示。火麻仁蛋白酶解液质量浓度为1 mg/mL时,AG抑制率为13.89%,经过分离纯化,相同条件下洗脱液的AG抑制活性提高到73.81%,说明3-MPBA/AG@aZIF-7/PDA能与酶解液中的AG抑制肽发生特异性结合,可有效地对其进行纯化。

3 结论与讨论

该研究制备了一种新型的固定化酶3-MPBA/AG@aZIF-7/PDA,并研究了该材料对2种不同类型的AG抑制肽ITG和CTG的吸附行为,验证3-MPBA/AG@aZIF-7/PDA在AG抑制剂快速筛选中的应用潜力。结果表明,制备得到的3-MPBA/AG@aZIF-7/PDA为不规则球形纳米材料,具有无定形结构。对于ITG,在多肽质量浓度为4.8 mg/mL,吸附时间为20 min,pH值为7.0,温度为25 ℃时,最大吸附量为191.06 mg/g;对于CTG,在多肽质量浓度为3.0 mg/mL,吸附时间为20 min,pH值为7.0,温度为20 ℃时,最大吸附量为129.50 mg/g。吸附动力学和吸附等温线结果表明,3-MPBA/AG@aZIF-7/PDA对ITG和CTG的吸附符合拟一级动力学吸附模型,属于单分子层吸附的物理吸附过程。拟合得到的ITG和CTG最大吸附量可分别达到372.83和183.33 mg/g。复杂体系筛选实验结果表明,经固定化酶分离纯化的洗脱液对AG抑制率从13.89%提高至73.81%。由此可见,3-MPBA/AG@aZIF-7/PDA有望在AG抑制剂快速筛选领域实现广泛应用。

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Preperation of 3-MPBA/AG@aZIF-7/PDA and their application in adsorption of α-glucosidase inhibitory peptides

LIU Jingxing1,2, LI Zhuoying1, CHEN Ting1, LI Caixia1, HE Ziyu1, WANG Zefen3*, LAN Xiongdiao1*

1(School of Chemistry and Chemical Engineering, Guangxi Minzu University, Guangxi Key Laboratory for Polysaccharide Materials and Modification, Institute of Chemical and Biological Transformation Processes, Nanning 530006, China) 2(Hunan Light-Textile Industrial Design Institute CO.Ltd., Changsha 410015, China) 3(Guangxi Autonomous Region Center for Analysis and Test Research, Nanning 530022, China)

Abstract Immobilized enzymes have good stability and reusability compared to free enzymes and can be used for rapid screening of enzyme inhibitors.In this study, a novel immobilized α-glucosidase 3-MPBA/AG@aZIF-7/PDA was synthesized and characterized.In addition, Ile-Tyr-Gly (ITG, non-competitive inhibitory peptide) and Cys-Tyr-Gly (CTG, competitive inhibitory peptide) were used as adsorption models to study the adsorption properties of 3-MPBA/AG@aZIF-7/PDA.Results showed that the adsorption capacity of 3-MPBA/AG@aZIF-7/PDA for ITG and CTG was 191.06 mg/g and 129.50 mg/g, respectively, under the optimized adsorption conditions.The adsorption kinetics and adsorption isotherm studies indicated that the adsorption of both ITG and CTG by 3-MPBA/AG@aZIF-7/PDA conformed to the proposed one-stage adsorption kinetic model, which was mainly a physical adsorption process, and the adsorption process conformed to the Langmuir isothermal adsorption model that was dominated by the adsorption of monomolecular layers.Moreover, it was found that the immobilized enzyme could efficiently isolate the AG inhibitory peptides from the complex system.These results indicate that the immobilized enzyme is of great value in isolation and enrichment of functional peptides, and 3-MPBA/AG@aZIF-7/PDA is a promising material for the efficient isolation of α-glucosidase inhibitors.

Key words α-glucosidase; inhibitory peptides; adsorption kinetics; adsorption capacity

DOI：10.13995/j.cnki.11-1802/ts.039980

引用格式：刘精杏,李焯颖,陈婷,等.3-MPBA/AG@aZIF-7/PDA的制备及其对α-葡萄糖苷酶抑制肽的吸附[J].食品与发酵工业,2025,51(12)：191-198.LIU Jingxing,LI Zhuoying,CHEN Ting, et al.Preperation of 3-MPBA/AG@aZIF-7/PDA and their application in adsorption of α-glucosidase inhibitory peptides[J].Food and Fermentation Industries,2025,51(12)：191-198.

第一作者：硕士研究生(兰雄雕副教授和王则奋高级工程师为共同通信作者,E-mail：lanxiongdiao@163.com;wangzefen@126.com)

基金项目：广西民族大学校引进人才科研启动项目(2018KJQD06);广西自然科学基金青年基金项目(2022GXNSFBA035499);广西自然科学基金面上项目(2021GXNSFAA075043)

收稿日期：2024-05-23,改回日期：2024-08-12