奶皮子是内蒙古地区的传统美食,是通过全脂牛奶的不断熬煮而在牛奶液面上形成的一层脂肪层,颜色通常为白色且微黄,呈半圆形,直径约15～25 cm,厚约1～1.5 cm,奶皮子是一层厚厚的脂肪,被蛋白质所构成的外壳包裹,且外壳上有很多均匀分布的气泡孔。外侧的蛋白层可保护内侧的脂肪不受或延缓氧化[1]。奶皮子中有较高的营养价值,在传统发酵奶皮中检测到17种氨基酸和23种脂肪酸,其含量分别为(13.16±2.89)%和(40.14±5.22)%,其中含有7种人体所需的必需氨基酸。脂肪酸中主要以研究棕榈酸(C16∶0)、油酸(C18∶1n9c)和硬脂酸(C18∶0)为主[2]。由于奶皮子的脂肪含量高,奶皮子中残留的脂酶以及微生物的生长会引起油脂的氧化,奶皮开袋后常温下极易发生腐败。目前奶皮子常采用真空包装的方式在低温冷冻的条件下进行贮藏运输,由于我国的冷链运输不发达,导致了奶皮子的销售半径受到了极大限制。目前关于其他包装方式对奶皮子保鲜效果的研究较少,关于气调包装这一类智能包装技术的更少。
气调包装是一种智能包装技术,是通过调整包装内部的气体组成,来达到保鲜的效果,它有着悠久的历史。早在20世纪30年代,欧美就开始研究利用CO2气体保存肉制品[3-4]。20世纪50年代,N2和CO2气体被开发出来代替牛肉罐头和奶酪罐头中的空气,有效地延长了保质期。20世纪60年代,由于各种气密高分子包装材料的出现,很多食品如肉类、水果、蔬菜、糕点、茶叶、乳制品等都成功采用了气体置换包装技术[5],气调包装技术在肉类、果蔬包装应用广泛,通常选用高浓度O2和CO2混合气用于肉类的包装[6],高浓度的O2可以保持肉类色泽红润[7],对微生物也有一定抑制作用,而CO2是气调包装中的一种重要的气体组分,在低浓度下,CO2可以促进多种微生物的繁殖,而在高浓度下,它可以抑制大多数需氧细菌、霉菌等微生物的繁殖[8],延长微生物增长的停滞期和指数增长期,达到防腐防霉作用。果蔬的气调包装很多为自发气调包装,自发气调包装是选用有一定透过性的包装材料将果蔬包裹,减缓果蔬的呼吸作用,使果蔬的呼吸水平保持在较低的状态,也可以向果蔬包装中主动充入CO2气体来减缓其呼吸作用,以达到保鲜的目的[9-10]。当CO2浓度高于50%时对某些嗜氧菌及霉菌有很强的抑制作用甚至将其杀灭,但是CO2不是对所有的微生物都有抑制效果,对乳酸菌、酵母菌这一类可以进行无氧呼吸或是兼性厌氧的微生物无抑制作用。由于CO2容易被食品中的水分或脂肪吸收从而使包装内气压降低容易造成软包装塌瘪[11],当CO2浓度过高时,CO2与水反应形成碳酸,会使食物发酸,所以CO2通常与N2按一定比例进行混配然后再使用。本文旨在探究不同气氛比例对奶皮子保鲜效果的影响,选出最适气氛比例,用于奶皮子的保鲜包装。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
奶皮子,阿鲁科尔沁旗天山镇奥都奶食;PA/PE高阻复合袋,沧州华良包装装潢有限公司。氢氧化钠甲醇溶液,盐酸/甲醇溶液,硫酸钠溶液,正己烷/异丙醇混合溶液,正己烷,孟加拉红琼脂,平板计数琼脂(plate counting agar,PCA)。
1.2 仪器与设备
MODEL 9001ME气体混配器,丹麦PBI Dansensor公司;DZ-400真空包装机,上海佳诚包装机械有限公司;Clarns680气相色谱仪,美国珀金埃尔默仪器有限公司;CR-20色差仪,日本柯尼卡美能达公司;PEN3电子鼻,德国Airsense公司;SX-300高压蒸汽灭菌锅,日本TOMY公司;HR40-1142生物安全柜,青岛海尔特种电器有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 感官评定
食品的外观会影响产品及其营销特性[12],尺寸、形状、纹理、质量、光泽和颜色等是食品进行感官评定的重要参数[13]。以第0天的样品作为满分组,随机抽取7～8名食品相关专业的研究生按照表1感官评定表进行感官评定,分别从奶皮子的风味、质地2个方面对奶皮子进行感官评定。奶皮子中脂肪酸的氧化是影响奶皮子风味的重要因素。
表1 奶皮子感官评定表
Table 1 Sensory evaluation table of vrum
项目内容分数/分风味(20分)奶香浓郁20奶香变淡18～19奶香全无,油腻16～17有异味15～14质地(10分)成张,气泡孔均匀10表面油脂析出8～9油脂析出严重,变黄6～7
1.3.2 色差测定
进行色差测定时首先进行色差仪的白度校准,校准完成后再进行奶皮子色差的测量,测量结束后需清洁镜头,再进行第2个样品的测量。使用色度计时测量时,L*和b*的值需要进行同步记录。L*值表示奶皮子的亮度值,数值大表示偏白,数值小表示偏黑;b*值表示黄度值,数值大表示偏黄,数值小表示偏蓝。
1.3.3 挥发性风味物质测定
电子鼻可以检测出不同气体组分的奶皮子在贮藏一定时间后,奶皮子的挥发性风味物质的变化[14],从而可以反映出不同气体对奶皮子内风味物质的影响。电子鼻内部含有10种不同的金属氧化物气体传感器用于气体的检测,如表2所示。称取5 g 奶皮子置于40 mL顶空瓶中,用多层保鲜膜进行封口,再用高阻隔的胶带进行密封,在60 ℃水浴中加热30 min,随后插入电子鼻的针头对奶皮子的挥发性成分进行分析。电子鼻参数：冲洗时间120 s,采样间隔1 s,采样时间100 s,调零时间10 s,预采样时间5 s,载气流量300 mL/min。
表2 电子鼻传感器性能
Table 2 Performance of electronic nose sensor
阵列序号传感器性能描述R1W1C对芳烃成分,苯类灵敏R2W5S灵敏度大,对氮氧化合物敏感R3W3C对芳香成分灵敏,氨类敏感R4W6S主要对氢类敏感R5W5C对短链烷烃、芳香成分敏感R6W1S对甲基类灵敏R7W1W对硫化物灵敏R8W2S对醇类,醛酮类灵敏对醇类,醛酮类灵敏R9W2W对芳香成分,有机硫化物灵敏R10W3S对长链烷烃灵敏
1.3.4 脂肪酸的测定
参考张孚嘉[15]的方法,稍作修改测定脂肪酸含量。首先向2 mL样品中加入4 mL正己烷/异丙醇混合溶液,然后加入2 mL硫酸钠溶液,在室温下以5 300 r/min,离心20 min。上清液在20 mL水解管中提取,混合后加N2干燥。再加入2 mL氢氧化钠/甲醇溶液并在50 ℃水浴15 min,冷却后加入2 mL盐酸/甲醇标准溶液在80 ℃水浴1.5 h。冷却至室温,先后加入3 mL水及6 mL正己烷,振荡混匀,离心机离心分层。抽取上层液体10 mL,并添加无水硫酸钠干燥后进行检测。
1.3.5 微生物总数测定
微生物总数的测定严格按照GB 4789.2—2022《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》执行。称取5 g奶皮子放入预先杀菌的均质袋中,加入45 mL生理盐水,摇晃,使奶皮子完全溶解,得到匀浆。将匀浆按1∶10体积比进行梯度稀释,吸取1 mL稀释液注入无菌培养皿中,与营养琼脂培养基混匀后,放入(36±1) ℃的恒温培养箱中培养24～48 h观察结果。各包装组处理的奶豆腐在贮藏的第0、5、10、15、25天分别取样进行微生物总数测定。
1.3.6 霉菌菌落总数的测定
霉菌菌落总数的测定按照GB 4789.15—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 霉菌和酵母计数》执行。测定霉菌总数所选用的培养基为孟加拉红培养基,专门用于霉菌和酵母菌平板计数,培养基经加热沸腾至完全溶解,高压蒸汽灭菌后使用,其余步骤和微生物总数测定相同,进行3组平行试验,培养5 d后观察结果。
1.4 数据处理分析
每组实验重复3次,结果以平均值±标准差表示。采用IBM SPSS Statistics27.0软件进行数据统计分析,基于Duncan法对各组数据进行多重比较,P<0.05 表示差异显著。
2 结果与分析
2.1 奶皮子感官评定
奶皮子富含大量的油脂、蛋白质,营养成分丰富,奶香味浓郁,入口醇香[16]。使用气调包装的方式对奶皮子进行包装过程中,N2和CO2的比例、贮藏时间等条件都会对奶皮子的感官造成影响。从图1中可以看出各组奶皮子的风味都随着贮藏时间的延长而变差,对奶皮子风味影响最小的是50% N2+50% CO2实验组,对奶皮子风味影响最大的是真空包装组(VP),而且CO2浓度越高对奶皮子的风味影响也就越大。在贮藏初期不同气调比例对奶皮子的风味影响差异不明显(P>0.05),但是从第10天开始高浓度CO2对风味的影响明显高于低浓度CO2(P<0.05)。图2是关于奶皮子质地的柱状图,可以看出气调包装对奶皮子质地的影响要比对风味的影响大,VP组对奶皮子质地的影响最为明显,对奶皮子质地保留最好的也是50% N2+50% CO2实验组,同样CO2浓度越高对奶皮子的质地影响也就越大。在整个贮藏期中对于质地的影响,VP组明显高于其他各组(P<0.05),而其他各组间的显著性差异不明显(P>0.05)。由于CO2容易被脂肪和水分吸收,CO2还可以与水反应形成碳酸[17],从而对其风味和质地会造成一定的影响,所以高浓度CO2对风味和质地的影响明显高于低浓度CO2,相比于其他各组50% N2+50% CO2实验组是一个比较合适的气调比例。
图1 气调包装对奶皮子风味影响
Fig.1 Effect of modified atmosphere packaging on flavor of vrum
图2 奶皮子质地分数
Fig.2 Texture score of vrum
2.2 色差分析
奶皮子的颜色是白色中透着黄色,本文选取了L*和b*来表示奶皮子在贮藏期间色泽的变化。L*表示的是亮度,是颜色深浅的评价指标,数值越大表示越白;b*表示的是黄度,数值越大表示越黄。图3是奶皮子在贮藏期间不同处理方式下L*值的变化情况统计,图4是b*值的变化趋势统计。从图3中可以看出6个实验组奶皮子的亮度值在第5天都出现了明显的升高,颜色明显偏白,这种发白的现象可能是由于低温冷藏环境下奶皮子的蛋白质持续析出形成蛋白质外壳和一部分饱和脂肪酸低温条件下凝固所至[16]。图4中可以明显地看出,贮藏期中各个组的黄度值都不断在升高,而VP组奶皮子的黄度升高较其他各组明显,黄度值的升高说明各个组的油脂都存在一定的自然氧化现象,而VP组黄度升高更加明显是因为VP组由于真空度过高导致奶皮子的外层蛋白质外壳的破坏导致内部大量的油脂析出所至。图5-A是第15天时50% N2+50% CO2实验组奶皮子照片,图5-B是第15天时VP组奶皮子的照片,图5-A和图5-B的对比也可以直观看出真空组黄度偏高。在贮藏至第25天时,由于奶皮子的整体颜色变暗,导致各组奶皮子的黄度值都有一定程度的下降。
图3 奶皮子亮度变化
Fig.3 The brightness change of vrum
图4 奶皮子黄度变化
Fig.4 Yellowness changes of vrum
A-50% N2+50% CO2气调包装组;B-VP包装组
图5 第15天奶皮子对比
Fig.5 Comparison of vrum on day 15
2.3 挥发性风味物质测定
用电子鼻对奶皮子进行挥发性风味物质测定得到了图6。奶皮子中对其气氛影响最大的是序号2、7、9,对应于表2中分别为氮氧化合物、硫化物、有机硫化物。这一类挥发性风味物质有一部分是来自于脂肪酸的氧化,如亚油酸氧化产生的1-辛烯-3-酮和(E)-2-壬烯醛,亚麻酸氧化产生的(Z)-1,5-辛二烯-3-酮[18]。从图6中可以看出序号2、7、9与初始样的接近的有30% CO2+100% N2以及VP组,VP组中序号2、7、9对其的影响甚至超过了第0天的初始值,而与初始样差别大的实验组有50% CO2、70% CO2和100% CO2。因此,CO2浓度会对奶皮子的风味物质造成明显的影响,且浓度越高影响越大。CO2容易被油脂和水吸收,与水形成碳酸,而且高浓度CO2下油脂的氧化较缓慢[19],这些可能是CO2造成奶皮子风味缺失的原因。VP组中序号2、7、9对其的影响超过了第0天的初始值的原因可能是VP组由于奶皮子的外层蛋白质外壳的破坏导致了内部油脂析出,使得其挥发性风味物质得到更好的释放。
图6 电子鼻雷达图
Fig.6 Electronic nose radar figure
2.4 脂肪酸测定
脂肪是由甘油和脂肪酸形成的甘油三酯,油脂的氧化过程类似于烯烃的链式聚合反应,存在引发期、增长期、终止期,油脂氧化最开始是由食物中的自由基引起不饱和脂肪酸的分解,氢原子从碳链上脱落,形成新的烷烃自由基使油脂继续被氧化,所以含有更多的不饱和脂肪酸更容易被氧化[20]。食品中油脂氧化后产生的自由基会导致维生素结构的破坏,长期食用可能会导致DNA的损伤,所以油脂氧化后产生的自由基被认为是致癌物质,且油脂氧化后的氢过氧化物在人体内很难排出,会造成肝脏的损伤[21]。奶皮子中含有大量且较为丰富的脂肪酸,其中油酸含量最高,依次为棕榈酸、硬脂酸、肉豆蔻酸、亚麻酸、亚油酸等[22],表3为奶皮子在第0天用气相色谱仪检测出来的脂肪酸及其含量,含量最高的分别为棕榈酸和油酸,所以本文选用了这2种脂肪酸来反映不同气调比例的气调包装对奶皮子保鲜效果。
图7中可以看出贮藏前期,各实验组的棕榈酸含量都出现了不同程度的升高,贮藏后期100% N2实验组和30% CO2实验组的棕榈酸含量继续升高,但是50% CO2和70% CO2以及100% CO2实验组的棕榈酸出现明显的下降,前期各个组的棕榈酸含量升高可能是脂肪在脂酶的作用下生产脂肪酸[15],其中棕榈酸又属于饱和脂肪酸相比于不饱和脂肪酸要更难氧化,此时脂酶的量和活性还不足以氧化棕榈酸这一类饱和脂肪酸,所以导致了棕榈酸含量的升高,但随着贮藏时间延长,CO2对脂酶活性抑制更加明显,所以高浓度CO2组出现了棕榈酸含量减少的现象。图8反映了奶皮子中油酸的变化,油酸在贮藏期间一直处于下降状态,且VP组下降的最为明显,50% CO2和70% CO2以及100% CO2实验组相比于其他低浓度CO2组下降趋势较小,在第15天时对油酸含量保留最高的为50% CO2组。油酸属于不饱和脂肪酸十分容易被氧化,所以CO2对油酸氧化的抑制效果并不是太明显,尤其到了贮藏后期,由于微生物的作用油酸氧化速度进一步加快。
表3 第0天初始样脂肪酸
Table 3 Initial fatty acids on day 0
序号名称波峰面积/%序号名称波峰面积/%1己酸0.79713硬脂酸12.1292辛酸1.05514油酸27.0943癸酸2.61615反油酸0.0884十一烷酸0.32116亚油酸2.2695月桂酸3.06117花生酸0.1496肉豆蔻酸11.03418α-亚油酸0.1507肉豆蔻烯酸0.98519二十一碳酸0.8168十五烷酸0.91420顺-8.11.14-二十碳酸0.1029棕榈酸31.23421芥酸0.07910棕榈油酸2.04022二十三酸0.20511十七烷酸0.66723二十四酸0.02912顺-10-十七烯酸0.214
图7 奶皮子棕榈酸变化
Fig.7 Changes of palmitic acid in vrum
图8 奶皮子油酸变化
Fig.8 Changes of oleic acid in vrum
2.5 微生物菌落总数
奶制品中主要污染型微生物包括腐败型微生物和致病型微生物,腐败型微生物主要包括乳酸菌、丙酸菌、丁酸菌以及胨化细菌等,霉菌也是乳制品主要污染微生物之一。细菌可以产生不同种类的脂肪酶,包括水解水溶性酯的羧酸酯酶和水解长链三酰甘油底物的脂肪酶[23],真菌中酵母菌和霉菌也可以产生脂肪酶,产脂肪酶的霉菌主要有根霉、曲霉、青霉和毛霉等[24]。所以在奶皮子贮藏过程中随着贮藏时间的增长,微生物总数增加,将进一步导致奶皮子中脂肪的氧化,加速其腐败变质。测定奶皮子贮藏期间微生物总数是对气调保鲜效果直观地反映。
从表4中可以看出,在贮藏到第5天时100% N2组和30% CO2组包装的奶皮子的菌落总数要明显比其他4组多,其中100% N2组中菌落总数达到了1 250 CFU/g,而100% CO2只有776 CFU/g,且两者存在显著性的差异(P<0.05),到了贮藏后期100% N2组和30% CO2组继续保持较大幅度的增长,且100% N2组在第15天达到了10 016 CFU/g已经超过了内蒙地方标准DBS15/001.2—2016《食品安全地方标准 蒙古族传统乳制品 第2部分：奶皮子》对奶皮子规定的10 000 CFU/g,30% CO2组也增长到了9 736 CFU/g接近超标,但在第15天时70% CO2组的微生物总数也出现了明显的增长,且还与100% N2组之间存在了一定的相关性(P>0.05)。在气调包装中CO2的浓度超过50%时对嗜氧微生物就有较好的抑制作用,所以在贮藏前期高浓度CO2组对微生物具有较好的抑制效果[25]。在贮藏后期70% CO2组菌落总数出现了大幅的上升,可能是由于碳酸的形成降低了奶皮子的pH,为乳酸菌、酵母菌这一类厌氧型微生物或兼性厌氧型微生物创造了较好的生存环境,从而导致了微生物总数的增长。从表4中可以看出抑菌效果最好的是100% CO2组和VP组,50% N2组次之。图9-A为第0天的微生物生长情况,图9-B～图9-D分别为100% N2组在第5天、第10天、第15天的10-1梯度下菌落生长情况,图9-E～图9-G分别为50% N2组在第5天、第10天、第15天的10-1梯度下菌落生长情况,可以直观地看出50% N2和70% N2组菌落总数相对较少,微生物的生长受到抑制。
2.6 霉菌菌落总数
霉菌是乳制品的一种污染型微生物,霉菌可以产生脂肪酶加速奶皮子脂肪的氧化,而且部分霉菌可以产生一定量的毒素,在食用过程中将会对人体健康造成严重的威胁,所以霉菌是非致病菌中危害较大的一种,内蒙地方标准DBS15/001.2—2016对奶皮子中霉菌菌落总数规定不超过90 CFU/g,所以只要在奶皮子中检测出了霉菌,可视为超标。孟加拉红培养基可以用于霉菌的菌落总数计量,也可以用于酵母菌菌落总数的计量,区分孟加拉红培养基上2种菌落的方法也很简单,在孟加拉红选择培养基中,霉菌菌落有明显菌丝,背面中心呈深粉红色、四周呈浅粉色,易于计数。酵母菌落较小,呈粉红色,表面光滑、湿润、黏稠,便于观察计数。如表5所示,在贮藏前期未发现有霉菌的生长,在第10天时100% N2组出现了霉菌菌落,第15天时100% N2组、70% N2组、VP组都出现了霉菌,第25天时,各组均出现酵母菌菌落,只有50% N2没有出现霉菌菌落。图10-A～图10-C分别为VP组、100% N2组、70% N2组在第15天时的霉菌生长情况。而50% N2组、100% CO2组、30% N2组未发现霉菌菌落,可知较高浓度CO2能够有效地抑制霉菌的生长。
表4 奶皮子菌落总数
Table 4 Total bacterial count of vrum
时间/d菌落总数/(CFU/g)100% N230% CO2+70% N250% CO2+50% N270% CO2+30% N2100% CO2VP0 580±43Aa 580±43Aa 580±43Aa 580±43Aa 580±43Aa 580±43Aa5 1 250±196Aa 1 026±45Aa 986±104Ab 706±90Ab 776±88Ab 966±147Ab10 8 240±287Ba 5 766±601Ba 4 783±1 154Bb 4 960±404Bb 4 166±78Ba 4 040±906Bb1510 016±1 123Ba 9 736±164Ca 5 750±744Bb 8 620±795Ca 5 640±698Bb 6 510±336Cb2514 067±2 043Cab13 380±2 298Dabc10 360±655Cbc10 273±720Dc11 572±1 324Cbc16 320±1 315Da
注：同行上角标不同小写字母代表差异显著(P<0.05);同列上角标不同大写字母代表差异显著(P<0.05)。
A-第0天时的微生物菌落照片;B～D-100% N2组在第5天、第10天、第15天的菌落生长情况;E～G-50% CO2组在第5天、第10天、第15天的菌落生长情况
图9 菌落生长情况
Fig.9 Colony growth
表5 孟加拉红培养基菌落生长情况
Table 5 Colony growth of Bangladesh red medium
组别第0天第5天第10天第15天第25天酵母菌霉菌酵母菌霉菌酵母菌霉菌酵母菌霉菌酵母菌霉菌VP× ×× ×× ×√ √√√√√√√100% N2× ×× ×× √√ √√√√√√√30% CO2+70% N2× ×× ×√ ×√ √√√√√√√50% CO2+50% N2× ×× ×× ×× ×√√××√√70% CO2+30% N2× ×× ×√ ×√ ×√√√×√√100% CO2× ×× ×× ×× ×√√××√√
注：√表示有菌落生长、×表示未发现菌落生长。
A-真空组;B-100% N2组;C-30% CO2组
图10 霉菌生长情况
Fig.10 Mold growth
3 结论
本文对奶皮子分别用纯CO2,30% CO2+70% N2、50% CO2+50% N2、70% CO2+30% N2、纯N2的充气比例的气调包装和VP包装在4 ℃下进行包装贮藏。贮藏期间对6个实验组进行检测,微生物实验中CO2浓度越高对微生物的抑制效果越好,尤其是对霉菌这种需氧型微生物有很好的抑制效果。在霉菌实验中70% CO2、纯CO2、50% CO2直到第15天时也未发现霉菌菌落,而100% N2组在第10天时就检出了霉菌菌落,但CO2对酵母菌这一类厌氧型或兼性厌氧型微生物的抑制效果不明显,在脂肪酸实验中,CO2可以降低奶皮子中脂肪酶的活性,抑制霉菌及其他一些可以产脂肪酶的微生物的生长,所以高浓度CO2对饱和脂肪酸的氧化有一定的抑制作用,而对于不饱和脂肪酸而言没有明显的抑制效果。所以综合以上实验结果,高浓度的CO2对微生物有较好的抑制效果、对奶皮子中脂肪酸的氧化也有一定的抑制作用,但是过高的CO2浓度对奶皮子的感官有较大的影响。所以综合考虑下,50% N2+50% CO2比例的气调包装较其他几组有更好的保鲜效果,更适合应用于奶皮子的冷藏保鲜。
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