藏猪又名“人参猪”,属高原野外牧养类瘦肉型猪,是我国重要地方猪种遗传资源之一。高原地区环境相对封闭,无外来污染,藏猪肉质鲜嫩、风味独特、蛋白含量高、各种矿物质及微量元素丰富。近年来,有诸多学者对藏猪肉的营养与风味进行了探索性研究,与其他地方猪种相比,藏猪肉含水率较低,其里脊肉中干物质及营养成分含量高,且含有较高的多不饱和脂肪酸和芳香族游离氨基酸[1]。

中式火腿作为一种健康的猪肉加工制品,因其独特风味而深受消费者的喜爱。目前国内知名的火腿多以地方猪种为原料制成,如金华火腿采用金华猪“两头乌”[2]、云南宣威火腿采用乌金猪[3]等。此外,藏区也有食用发酵藏猪肉制品“帕宫”的饮食习惯和消费市场[4],因此藏猪作为高值区域特色种质资源,具有开发发酵产品的潜力。

西藏高原地区由于特殊环境,形成了特异性的微生物种质资源。然而在制作火腿时,由于微生物生长被藏区严苛的自然条件所限制,造成了发酵周期不固定、生产效率低、品质稳定性差等问题。考虑利用藏源优异微生物来解决此类问题。大量研究证明益生菌对肉制品品质的形成具有重要作用,且作为发酵剂被广泛应用于发酵肉制品研究[5]。GE等[6]发现植物乳杆菌的发酵作用降低了肉制品的pH值和水分活度,对抑制病原菌生长、延长肉制品保质期具有一定作用。GONG等[7]发现利用汉森酵母S25能够促进火腿中醇类化合物的产生,且挥发性风味物质产量高,对于丰富火腿滋味具有重要作用。GOGOI等[8]利用嗜酸乳杆菌和微球菌混合发酵,结果显示接种火腿在感官特性、整体可接受性等方面被评为优异。但针对藏猪开发的藏猪火腿,并采用外源发酵微生物改良藏猪火腿品质的研究鲜见报道。

因此,本研究以藏猪火腿为研究对象,设置自然发酵组(NF)、副干酪乳杆菌组(Lactobacillus paracasei,LP)、马克思克鲁维酵母组(Kluyveromyces marxianus,KM)、复配发酵组(LP+KM,简称LK),通过在藏猪后腿接种发酵菌粉,于腌制、晾晒、发酵和成熟4个阶段后对火腿采样,探究接种发酵方式对藏猪火腿pH值、水分活度、色泽、质构、风味等方面的影响规律,为了解藏猪肉的发酵特性提供数据支持,同时为益生菌发酵藏猪肉制品的高效开发提供技术依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

生鲜藏猪后腿,宝兴县夹金印象食品有限公司,规格为(8.37±1.47)kg/支,共48支。发酵菌株：副干酪乳杆菌M3-16(保藏号CCTCC NO.M20231240)、马克思克鲁维酵母MY4(保藏号CCTCC NO.M20221052),均保藏于中国典型培养物保藏中心,为作者所在课题组前期从藏族特色发酵食品曲拉、青稞酒醅中分离所得,是具有良好发酵特性的菌株[9]。上述2种菌株制备的干粉式直投发酵剂,活菌数达到1010～1011 CFU/g。

氯化钾、氯化钠,国药集团化学试剂有限公司;氘代氯苯,高教研(北京)科技有限公司。

1.2 仪器与设备

JYS-A800绞肉机,九阳股份有限公司;UV-5500 紫外可见分光光度计,上海元析仪器有限公司;CR-400色差分析仪,柯尼卡美能达控股公司;TA.XT Plus质构仪,英国Stable Micro System公司;S220pH计,梅特勒-托利多国际贸易(上海)有限公司;GC-2030气相色谱-质谱联用仪,日本株式会社岛津制作所。

1.3 实验方法

1.3.1 火腿制作方法

火腿制作工艺参照GB/T 19088—2008 《地理标志产品 金华火腿(含第1、2号修改单)》、T/JHHTA 0001—2019 《金华火腿传统加工规程》。选取48支生鲜藏猪后腿进行清洗、修整,随后接种,接种温度13.8 ℃,相对湿度55.4%,用生理盐水与菌粉混合后均匀涂抹于鲜腿表面,接种量为111 mg菌粉/kg鲜腿。接着进行腌制,9 d后补盐,上盐量为3%(质量分数);18 d后二次补盐,上盐量为4%(质量分数)。产品的最终用盐量为猪腿质量的7%(质量分数)。接着进行洗腿、晒腿、整形、发酵、落架,最后堆叠成熟。共设置4个处理组：自然发酵组(NF,未接种)、副干酪乳杆菌组(LP)、马克斯克鲁维酵母组(KM)、复配发酵组(LK,2株菌无拮抗作用且和单菌发酵保持相同接种量,复配比为1∶1[10-11])。分别在腌制后(30 d)、晾晒后(48 d)、发酵后(188 d)和成熟后(258 d)4个阶段对每个阶段的4个处理组各取3支火腿样品。整个加工过程在石台县徽品坊生态食品有限公司(30°N,117°E)完成。

1.3.2 pH、水分活度测定

pH值：按照GB 5009.237—2016《食品安全国家标准食品中pH的测定》方法稍作改动。将2 g肉样剪碎,加入10倍去离子水进行稀释,8 000 r/min高速匀浆20 s,将电极插入混合物中,待数值稳定后进行读数。水分活度值：参照GB 5009.238—2016《食品安全国家标准 食品水分活度的测定》。称取1 g样品放入样品皿中,每隔5 min记录水分活度仪响应值。

1.3.3 肉色测定

采用色度仪测定色差。将样品切成约1.5 cm3的方块,色度仪使用前先用白色瓷片进行校准,在横切面上随机选取5个点进行测定重复测定,记录其亮度值(L*)、红度值(a*)和黄度值(b*)。

1.3.4 质构测定

质构仪参数设置参考史巧等[12]的方法,稍作改动。将样品切成1.5 cm3的方块状,放在质构仪上使用直径35 mm的圆柱形探头(p/50)测定硬度、咀嚼性、胶着性、弹性。参数设置为：前探头速度为2.00 mm/s;测定中探头速度为1.00 mm/s;测定后探头速度为1.00 mm/s;上升高度20 mm;压缩比为60%。

1.3.5 挥发性风味物质测定

参照鄢嫣[9]等的方法稍有改动。采用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用(Solid phase microextraction-gas chromatograph-mass spectrometry, SPME-GC-MS)对火腿进行挥发性风味物质提取,顶空小瓶中称有5 g样品,加入20 ng氘代氯苯内标。使用50/30 μm DVB/CAR/PDMS顶空固相微萃取头于60 ℃水浴下恒温萃取50 min后进行解析。GC条件为：色谱柱：Thermo Scientific TraceGOLD TG-624SilMS柱(60 m×250 μm×1.4 μm);进样口温度250 ℃,进样法为无分流;升温程序：初始温度为40 ℃,保持10 min,以5 ℃/min的速率增加到200 ℃,然后以20 ℃/min的速率增加到280 ℃,保持时间为5 min。MS条件为：离子源(EI)温度为230 ℃,界面温度为250 ℃,溶剂延迟时间为2 min。

1.3.6 感官评价

参考ANDRÉS等[13]的感官评价方法稍作改动,对成熟期发酵藏猪火腿进行感官评价,由10名平均年龄30岁的肉类食品研究人员,男女各5名,分别从气味、滋味、口感、肉色、组织状态等5个方面对藏猪火腿进行感官评分,并记录结果。评价标准如表1所示。

1.4 数据处理

样品均进行3次重复试验;使用SPSS 27.0软件进行方差分析和Duncan’s多重比较,当P<0.05时具有显著性;使用Origin 2021、SIMCA 14.1进行绘图。

2 结果与分析

2.1 发酵藏猪火腿的pH值变化

pH值常作为肉及肉制品品质检测的重要指标,低pH值有助于抑制腐败菌,提高肉制品安全性。图1为藏猪火腿在制作过程中pH值变化。随着加工时间延长,LP组和KM组pH值均呈现下降趋势,从起始约pH 6.7分别降低至pH 6.03和pH 6.21,成熟后接种发酵组明显低于NF组(P<0.05),说明接种发酵后微生物的繁殖加速了一些化合物的分解代谢,生成的有机酸类物质从而降低了pH值。而LK组pH值在晾晒至腌制后出现轻微上升,可能是复配发酵剂中酵母菌对蛋白质分解后产生的氨基酸、胺类等物质对乳酸菌代谢产生的有机酸类物质有一定缓冲作用[14]。在成熟后,各组火腿pH值差异显著(P<0.05),NF组pH值高于LP组、KM组和LK组,且LK组pH值最低,为5.96,与贮藏1年的金华火腿相比(6.24)[15],具有更低的pH值,可能是乳酸菌和酵母菌的协同作用,增强了乳酸菌的产酸能力,从而降低了pH值[16],在一定程度上保证了火腿的安全性。

2.2 发酵藏猪火腿的水分活度变化

水分活度在一定程度上可以反映出微生物的生长情况,低水分活度有助于抑制腐败菌和病原菌的生长,从而延长产品货架期。如图2所示,各组藏猪火腿的水分活度值均在0.76～0.89。有报道指出干腌火腿的水分活度>0.91时易被微生物污染[17];LP组、KM组和LK组火腿的水分活度明显低于NF组(P<0.05),水分活度的降低可能是由于盐分的渗透压及火腿表面水分的蒸发使其不断脱水,以及微生物利用火腿本身的游离水进行生长繁殖而造成的[18];LK组明显低于LP组和KM组(P<0.05),且LK组水分活度在成熟后达到最低,为0.76,可能是采用乳酸菌和酵母菌复配发酵以后,乳酸菌产酸使蛋白质持水能力下降,从而降低了水分活度,为酵母菌提供了一定的生长条件,而酵母菌代谢产生的丙酸、二氧化碳等物质又促进了乳酸菌的生长,二者相互作用使得复配发酵后具有更低的水分活度[19],对产品延长货架期有一定作用。

2.3 发酵藏猪火腿的色差变化

颜色是感官品质评定的重要指标之一,直接影响消费者购买欲。肉色主要是通过明亮度(L*)、红度(a*)、黄度(b*)来进行判定。由图3-A可知,与NF组相比,LP组、KM组和LK组的火腿L*值在发酵期和成熟期结束后差异显著且均高于NF组(P<0.05),同时LK组明显高于LP组和KM组(P<0.05),可能与乳酸菌和酵母菌间的相互作用降低了蛋白脂肪氧化的程度有关[20]。

而所有发酵组L*值在成熟后略有下降,可能与加工时间的延长和微生物代谢使得水分流失有关。图3-B中LP组、KM组和LK组火腿a*值在发酵期结束后,相较于NF组,均明显增加(P<0.05),LP组a*最大,LK组次之,这可能是发酵剂中乳酸菌代谢将肉中高铁肌红蛋白转化为亚硝基肌红蛋白,从而赋予其良好色泽。而成熟后LK组藏猪火腿a*值为11.39,高于LP组和KM组,与金华瘦肉火腿(12.11)相接近[21],可能是因为酵母菌在发酵过程中为乳酸菌提供了生长所需的氨基酸、维生素等物质,促进了其生长代谢,加快生成亚硝基肌红蛋白的速率[22],红度增加。图3-C中LP组、KM组和LK组b*值在发酵后、成熟后都显著低于NF组(P<0.05),且LK组b*值最低,而b*值的变化可能与乳酸菌和酵母复配发酵后减缓了脂肪氧化速度有关。采用复配发酵能有效改善火腿色泽,对增加亮度、红度,降低黄度具有明显效果。

2.4 发酵藏猪火腿的质构变化

质构是肉制品感官品质的重要影响指标之一,直接影响消费者喜爱程度。图4显示了火腿在加工过程中的质构变化,硬度能最直观反映产品口感,而咀嚼性则是将样品咀嚼至稳定状态所需要的能量,如图4所示,火腿在发酵期结束后硬度和咀嚼性明显增加(P<0.05),晾晒期、发酵期、成熟期结束LP组、KM组、LK组的硬度和咀嚼性明显小于NF组(P<0.05)且LK组最低,说明复配接种使肉的组织更加松软,可能是乳酸菌和酵母菌复配后的协同作用,促进了生长,加快了蛋白质的消耗[23],硬度和咀嚼性降低。胶着性可以反映出样品内部的黏着程度,与细腻口感密切相关。从图4-C可以看出,4组火腿的胶着性在发酵期结束明显升高,成熟后又降低,且LP组、KM组、LK组明显低于NF组(P<0.05)且LK组最低,可能是乳酸菌和酵母菌复配接种加速了pH值降低,使蛋白质结构组织降解加快,破坏了其内部凝胶结构,使得胶着性降低[24]。弹性是指物质从挤压状态快速恢复原形的能力,弹性越好,口感越饱满,如图4-D所示,LP组的弹性呈现先上升后下降趋势且在发酵期结束时达到最大;KM组在前3个加工阶段无明显差异(P>0.05),成熟期结束后弹性下降;LK组弹性在整个加工过程中均呈现上升趋势,并在成熟期结束弹性达到最大[(0.70±0.11) mm],高于一年陈的宣威火腿(0.59 mm)[25],这可能是复配发酵后乳酸菌和酵母菌相互作用提高了乳酸菌的产酸能力,加速蛋白质分解,低pH环境利于乳酸菌的生长,其产生较多的胞外多糖与蛋白质相互作用,从而增加了火腿的弹性[26]。从数据显示,较NF组、LP组和KM组,采用复配发酵更大程度降低了硬度、咀嚼性和胶着性,提升了弹性,使火腿口感更加柔和。

2.5 成熟后发酵藏猪火腿的挥发性风味物质分析

采用SPME-GC-MS对成熟后的藏猪火腿进行挥发性风味物质检测,结果如表2所示。NF组共检测出67种挥发性风味物质,LP组共检测出72种挥发性风味物质,KM组和LK组各检测出75种挥发性风味物质,藏猪火腿中所检测到的挥发性风味物质种类明显高于盘县火腿[27]。其中醛类相对含量最高且在各组中占比最大,分别为42%、48%、46%、51%,其次是醇类物质。较NF组火腿,接种发酵后LP组、KM组和LK组醇、醛、酮、酯类化合物种类及含量明显增加,且LK组中总挥发性风味物质含量最高(55 413.91 μg/g)。

1-辛烯-3-醇和2,3-丁二醇是主要的醇类物质,对火腿香气的形成可能具有重要作用,其中,1-辛烯-3-醇作为火腿中最丰富的醇类能赋予火腿特殊的蘑菇清香[28],其在诺邓火腿[29]、盘县火腿[30]均有检出,而在NF组中并未检测到,在LK组中含量最高,可能是乳酸菌和酵母菌共同作用增加了有机酸类物质的产生,促进脂肪氧化生成部分醇类化合物。醛类中己醛、壬醛含量最丰富,主要来源于脂肪酸的氧化和降解,与LI等[31]对国内不同产地干腌火腿的挥发性风味物质研究结果相一致,而2-辛烯醛仅在KM组和LK组中发现。同时,LP组、KM组和LK组比NF组增加了一些酮类物质,如2-辛酮、4-甲基环己酮,丰富了火腿的风味。2-丁酮和丙酮仅在KM组和LK组中被发现,其为肉制品提供强烈的脂香味[32]。干腌火腿的香气与酯类物质有重要关系,LK组中酯类物质含量及种类均高于其他3组,可能是因为复配菌株间相互促进作用,使乳酸菌产酸、酵母菌产醇量增加,生成了更多的酯类物质[23],从而增加了火腿的香气。

本研究发现,与自然发酵的藏猪火腿相比,接种发酵后许多风味化合物的含量均显著上升,同时产生了新的风味化合物。这些化合物可能是通过微生物降解蛋白产生的脂肪氧化、微生物酯化作用等途径所产生的。而采用复配发酵剂组由于乳酸菌和酵母菌的共生作用代谢出更多的风味物质,极大程度丰富了藏猪火腿的风味。

为进一步研究不同发酵剂对藏猪火腿成熟期挥发性风味物质的影响,根据上述GC-MS测定结果进行PCA分析。如图5-A主成分得分图所示,4组藏猪火腿样品分别分布在第一、三、四象限且没有重叠,说明各组间的挥发性风味物质具有显著差异性。挥发性风味物质的相似度与样品之间距离有关,其中NF组和LP组均分布在第三象限且距离较近,说明这2组火腿在成熟期的挥发性风味物质相似,差异不显著。KM组和LK组分别分布于不同象限,且LK组较其他组距离较远,说明复配发酵和单菌发酵所形成的风味之间存在显著差异。如图5-B所示,在藏猪火腿主成分载荷图中,在PCA1方向载荷值较大的物质有十二烷酸乙酯、4-甲基环己酮、三甲基硫丙醛、癸酸甲酯、1-乙基环丙醇等,说明这些物质对风味形成具有重要贡献作用。在PCA2方向可见辛醇、8-壬烯-2-酮、1,5-戊二醇、邻二甲苯、古巴烯等物质对挥发性风味贡献最大,这些也是形成藏猪火腿之间风味差异的重要化合物。

2.6 成熟后发酵藏猪火腿的感官评价

如图6所示,对接种不同发酵剂的藏猪火腿的肉色、滋味、口感、气味、组织形态5个方面进行感官评定,结果显示,接种发酵组评分均大于NF组,发酵组和NF组在气味、肉色方面的差别明显,NF组略有霉味,发酵组具有脂肪香气。LK组与KM组在滋味上差异不显著(P>0.05),但在肉色、口感、气味、组织状态方面明显高于单菌发酵组。感官分析结果与挥发性风味成分研究结果基本一致,说明所添加的发酵剂在一定程度上可以提高藏猪火腿的整体风味。

3 结论

本文以藏猪后腿为发酵原料,探究接种发酵对藏猪火腿品质特性的影响后发现,藏猪火腿在自然发酵过程中,随着加工时间的延长,火腿的pH值、水分活度、L*值、弹性均降低,硬度和咀嚼性增加,a*值变化不明显。与自然发酵相比,接种发酵可以改善火腿色泽,增加L*值和a*值,降低火腿b*值、pH值和水分活度,尤其是接种副干酪乳杆菌发酵使火腿a*值和弹性在发酵后显著增加,而接种马克斯克鲁维酵母发酵增加了火腿中醇、醛、酮类物质总含量。复配发酵不仅在降低火腿pH值、水分活度,延长保质期等方面优于单菌发酵,而且在改善火腿硬度、增加肉制弹性、丰富火腿风味等方面也具有显著优势,同时也提高了藏猪火腿的气味、肉色、组织形态等方面的感官得分。研究结果表明接种发酵剂尤其是复配发酵剂对改善藏猪火腿品质、提升其风味方面具有积极作用。

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Effect of Lactobacillus paracasei and Kluyveromyces marxianus on quality of Tibetan pig ham

WANG Fei1, Luosangyangji1, HUANG Jingjing2, LUO Zhang1, LIU Zhendong1, ZHANG Erhao1, Lamaocaidan3, LI Liang1*, XIE Ningning2*

1(School of Food Science, Xizang Agriculture and Animal Husbandry College, Nyingchi 860000,China) 2(Institute of Agricultural Products Processing, Anhui Academy of Agricultural Sciences, Hefei 230031,China) 3(Institute of Food and Drug Inspection of Tibet Autonomous Region, Lhasa 850000,China)

Abstract As a characteristic economic pig breed in the plateau, Tibetan pigs have delicious meat and rich nutrition, making them an excellent fermented meat raw material.Using Lactobacillus paracasei (LP) and Kluyveromyces marxianus (KM) to inoculate fermented Tibetan pig hind legs, this study investigated the changes in physicochemical properties (pH value, water activity) and physical properties (color difference, texture characteristics) of cured, air dried, fermented, and matured Tibetan pig ham under single strain (LP or KM) and complex strain (LP+KM, abbreviated as LK) methods, and compared the differences in volatile flavor and sensory evaluation of Tibetan pig ham at the fermentation endpoint.Results showed that compared with natural fermentation (NF, unvaccinated), inoculation fermentation showed significant differences (P<0.05) after fermentation and maturation.Inoculation fermentation reduced the pH value (below 6.75), water activity (decreased by 2%-10%), hardness, chewiness, and adhesiveness of Tibetan pig ham, while improving its color, brightness, and elasticity (P<0.05).Among them, the elasticity of LP and LK fermentation increased by about 40%.Inoculation fermentation increased the total aldehyde, total ketone, and total ester contents of mature ham, and the KM and LK treatment groups formed various new alcohol, aldehyde, and ketone flavor compounds.In addition, the sensory qualities such as tissue morphology, color, appearance, and taste of the LK treatment group were superior to those of the single bacterium fermentation group.It can be seen that the combination of LP and KM plays an important role in enhancing the quality and flavor of Tibetan pig ham, and can be used as a quality improver in the industrial production of Tibetan pig ham.

Key words Tibetan pig; ham; inoculated fermentation; physical and chemical quality; flavor

DOI：10.13995/j.cnki.11-1802/ts.040734

引用格式：王菲,落桑央吉,黄晶晶,等.副干酪乳杆菌和马克思克鲁维酵母接种发酵对藏猪火腿品质的影响[J].食品与发酵工业,2025,51(12)：249-258.WANG Fei,Luosangyangji,HUANG Jingjing, et al.Effect of Lactobacillus paracasei and Kluyveromyces marxianus on quality of Tibetan pig ham[J].Food and Fermentation Industries,2025,51(12)：249-258.

第一作者：硕士研究生(李梁副教授和谢宁宁副研究员为共同通信作者,E-mail：jwllok@sina.com;ningxie512@163.com)

基金项目：西藏自治区科技计划项目(XZ202202YD0004C,XZ202001YD0019C);安徽省重点研发科技援藏项目(2022j11020001)

收稿日期：2024-08-13,改回日期：2024-09-03