天麻为多年生寄生草本兰科植物天麻(Gastrodia elata Bl.)的干燥块茎,其作为名贵中草药,早在《神农本草经》中便以赤箭之名被列为上品,《中国药典》中对天麻功效有“息风止痉,平抑肝阳,祛风通络”的描述。据现代天麻相关的药理学研究表明,天麻在改善认知学习记忆、镇静催眠、抗癫痫和改善心血管等方面具有较好的疗效和生物活性[1-2]。天麻于2023年11月被正式列为药食同源类物质,同时,随着国内外学者对天麻特性、化学成分及药理等方面研究的不断深入[3],均极大地促进了天麻作为食品原料在功能性食品领域的开发及应用[4]。
湖北宜昌地区天麻栽培历史悠久,是我国天麻主产区之一[5]。其中,五峰地区因其地形主要以高山为主,森林覆盖率高达81%,当地土壤与天麻生长所需土壤环境高度契合,此外,当地的亚热带季风气候也更适宜天麻生长和培育,使得该产区的天麻质量品质均远高于药典标准,使其在市场竞争中具有明显的优势[6]。
本研究选取湖北五峰产区代表性品种——乌红天麻,从营养成分、活性成分等方面与全国其他2个主产区——云南昭通及陕西汉中地区的乌红天麻进行比较分析,并以其为原料进行天麻酵素的制备,采用高效液相色谱法和固相微萃取-气相色谱-质谱联用技术对天麻中呈现类似马尿味的特征性风味进行定性表征研究,同时揭示其在发酵过程中主要活性成分及关键特征性挥发物质的变化规律,为后续的天麻深加工产品的改良及产业化技术发展提供理论依据。
五峰乌红天麻粉(记作WF1),五峰昌华药业有限责任公司;五峰牛庄乌红天麻粉(记作WF2),牛庄地区农户种植;云南昭通乌红天麻粉(记作ZT),云南邦铭天麻生物科技有限公司;陕西汉中乌红天麻粉(记作HZ),陕西宁强天麻研究所有限责任公司;纤维素酶(1万U/mL)、高温淀粉酶(18万U/g),安琪酵母股份有限公司;白砂糖,市售;乳酸菌冻干粉LP-S2(菌株保藏编号M:2021340)、马克斯克鲁维酵母冻干粉KW-6(菌株保藏编号M:2020173),安琪生物科技有限公司;天麻素标准品、对羟基苯甲醇标准品,上海麦克林生化科技股份有限公司;乙腈(色谱级),北京沃凯生物科技有限公司;磷酸(色谱级),上海阿拉丁生化科技股份有限公司。
BSXT-06索氏提取器,上海比朗仪器制造有限公司;ME204电子天平(精度0.000 1 g),北京赛多利斯仪器系统有限公司;HE53水分测定仪,瑞士梅特勒-托利多公司;K9860全自动凯氏定氮仪,海能未来技术集团股份有限公司;MFLGM310-14马弗炉,上海马弗炉科技仪器有限公司;DVB/CAR/PDMS复合萃取头(50/30 μm),美国Supelco公司;7890B-5977B气质联用仪、Agilent1200高效液相色谱仪(含DAD检测器),安捷伦科技(中国)有限公司。
1.3.1 理化指标检测
水分含量使用水分测定仪进行测定;总灰分含量参考GB 5009.4—2016《食品安全国家标准 食品中灰分的测定》进行测定;二氧化硫残留量参考GB 5009.34—2022《食品安全国家标准 食品中二氧化硫的测定》测定;pH值采用pH计进行检测;酒精度参照国标GB/T 12143—2008《饮料通用分析方法》中的重铬酸钾法进行测定;粗纤维含量参考GB/T 6434—2022《饲料中粗纤维的含量测定》进行测定;脂肪含量参考GB 5009.6—2016《食品安全国家标准 食品中脂肪的测定》中使用索氏抽提法进行测定;淀粉含量参考GB 5009.9—2023《食品安全国家标准 食品中淀粉的测定》中酸水解法进行测定;蛋白质含量参考GB 5009.5—2016《食品安全国家标准 食品中蛋白质的测定》中凯氏定氮法进行测定。
1.3.2 天麻酵素制备方法
天麻酵素制备工艺流程如下:
天麻粉→加水溶解→酶解熟化→过滤→灭菌→接种发酵→酵素成品
将天麻粉(100目)按质量比1∶9加入纯水,搅拌溶解后添加天麻粉质量分数0.2%的纤维素酶和0.8%的淀粉酶,分别在55及90 ℃酶解3 h,酶解冷却后使用150目的纱布将酶解液和滤渣进行分离过滤,得到天麻酶解液,再经121 ℃高温蒸汽灭菌30 min后,添加0.03%植物乳杆菌冻干粉和0.03%马克思克鲁维酵母冻干粉混合均匀后用封口膜密封,置于30 ℃恒温培养箱中静置发酵48 h后得到天麻发酵液,又称天麻酵素。
1.3.3 天麻素及对羟基苯甲醇含量的测定
参考《中国药典》的方法,采用高效液相色谱法测定原料及天麻酵素中天麻素及对羟基苯甲醇的含量。
高效液相色谱条件为:Symmetry C18色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);柱温30 ℃;流速0.6 mL/min,进样体积10 μL;检测波长220 nm;流动相A为0.1%(体积分数,下同)磷酸水溶液,流动相B为乙腈。梯度洗脱程序:0~10 min,B由3%升至10%;10~15 min,B为10%;15~20 min,B由10%下降至3%。
样品前处理:天麻粉:取天麻粉末(过100目筛)约2 g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入52%稀乙醇50 mL,称定质量,超声处理30 min,放冷,再称定质量,用稀乙醇补足减失的质量,滤过,精密量取续滤液10 mL,浓缩至近干无醇味,残渣加乙腈-水(体积比3∶97)混合溶液溶解,转移至25 mL量瓶中,用乙腈-水(3∶97)混合溶液稀释至刻度,摇匀,滤过,取续滤液,即得。
天麻酶解液/发酵液:将液体于5 000 r/min离心10 min,取上清液过0.22 μm水系滤膜上机待测。将各检测结果带入液相所测标准曲线,计算天麻素及对羟基苯甲醇含量,其中天麻素标准曲线方程为:Y=15.037X-20.957,R2=1(其中X代表峰面积,Y代表天麻素含量,μg/mL);对羟基苯甲醇Y=15.037X-20.957,R2=1(其中X代表峰面积,Y代表对羟基苯甲醇含量,μg/mL)。
后文中对于天麻粉中有效成分总量按公式(1)进行计算:
有效成分总量/(mg/g)=天麻素含量+对羟基苯甲醇含量
(1)
1.3.4 挥发性物质的测定及分析
采用顶空固相微萃取法对天麻酶解液和酵素的挥发性风味成分进行提取和富集[7]。称取1.5 g氯化钠后吸取5 mL待测样品于30 mL顶空瓶中,加盖后放于50 ℃水浴锅中平衡20 min,DVB/CAR/PDMS复合萃取头在50 ℃下萃取30 min,然后进样,250 ℃解析5 min。
定性分析:将图谱中峰的质谱图与NIST17库中的物质质谱图进行比对,保留匹配度大于80的化合物,并按公式(2)进行未知物质量浓度的计算:
挥发性物质量分数
内标物质量分数
(2)
由于每1种挥发性物质在样品中呈现的强度不一样,而每1种化合物对整体气味的作用效果受浓度和阈值共同影响,因此采用香气活度值(odor activity value,OAV)反映样品中的挥发性物质对主体风味贡献程度[8]。当OAV<0.1时,说明该物质对样品香气贡献较小;当0.1≤OAV<1时,说明该物质对整体香气起到修饰作用;当OAV≥1时,说明该物质是样品的关键香气活性化合物,OAV按公式(3)进行计算:
(3)
采用SPSS 25.0、Excel 2021软件处理数据,Origin 2018软件绘制做图,所得实验均重复3次,数据以平均值±标准差表示。
不同产区4种乌红天麻粉的理化成分含量如表1所示。
表1 不同产区4种乌红天麻粉的理化成分
Table 1 Physicochemical compositions of four kinds of G.elata powder from different production areas
指标WF1WF2HZZT水分/%94.02±0.01a92.58±0.03b89.90±0.03d91.69±0.02c总灰分/%2.35±0.07b2.50±0.00b2.35±0.07b3.40±0.14a淀粉/(g/100 g)68.65±0.21b72.90±0.14a67.40±0.71b59.90±0.14c蛋白质/(g/100 g)5.91±0.03b5.09±0.03c5.87±0.08b9.60±0.46a粗纤维/(g/100 g)1.35±0.71b1.20±0.00b1.50±0.14b5.10±0.14a脂肪/(g/100 g)0.20±0.000.20±0.000.15±0.070.20±0.00SO2残留量/(mg/kg)7.02±0.89c51.88±2.86a3.04±0.22c12.87±0.10b天麻素/(mg/g) 4.507±0.284a 3.361±0.006b 2.434±0.121c 0.833±0.059d对羟基苯甲醇/(mg/g)1.753±0.151b0.825±0.011d1.260±0.005c3.368±0.226a有效成分总量/(mg/g)6.2604.1863.6944.201
注:不同小写字母表示不同处理间差异显著(P<0.05)。
由表1中各物质含量可知,4种乌红天麻粉的水分含量为89.90%~94.02%,各天麻样品间差异显著(P<0.05)。总灰分的含量为2.35%~3.40%,样品ZT的总灰分显著高于其他样品组,且各组均符合相关标准中总灰分不得超过4.5%的规定。淀粉是天麻中的主要物质之一,4种乌红天麻粉中淀粉含量达到了59.9~72.90 g/100 g,其中样品WF2的淀粉含量显著高于其他组(P<0.05)。蛋白质和粗纤维的含量分别为5.09~9.60和1.20~5.10 g/100 g,其中ZT样品组的蛋白质和粗纤维含量均显著高于其他样品组(P<0.05),其含量与近年来其他的天麻研究中的含量相符[9-10];而相比重庆地区的乌红天麻,本研究的4种乌红天麻中的蛋白质含量均偏高,粗纤维则偏低[11]。脂肪作为天麻中含量较低的物质,其含量仅为0.15~0.20 g/100 g。
目前,我国中药材初加工过程采用硫磺熏蒸是普遍的技术手段,主要起到干燥、防腐、漂白、延长贮藏期的作用。而鲜天麻也因其水分含量较高难以长期保存,通常也要经过硫磺熏蒸[12]。但天麻在硫熏后会使产生异味,且会对天麻品质造成影响[13-14],因此《中国药典》中对于SO2的残留量也进行限量要求,由表1可知,4种乌红天麻粉中WF2样品中的SO2的残留量显著高于其他组,但均已达到规定限量要求,而造成WF2样品中存在少量SO2残留的原因可能是由于产地的规范化程度较低,导致部分农户在采收初加工的过程中存在熏硫延长保藏期的情况产生。
天麻素的含量是评价天麻品质好坏的最重要化学指标之一[15],表1中乌红天麻粉中有效成分的检测结果表明,五峰本地天麻粉WF1、WF2中的天麻素含量均显著高于其他地区;而ZT样品组的天麻素含量较低,但其对羟基苯甲醇的含量显著高于其他样品组。而对于天麻粉中的天麻素及对羟基苯甲醇总量,在药典中要求为≥0.25%即2.5 mg/g,4种乌红天麻中的天麻素及对羟基苯甲醇的总量为3.694~6.260 mg/g,其中WF1中的有效成分总量最高达到了6.260 mg/g,是药典标准的2.5倍,且远高于其他样品组,其次为ZT、WF2,分别为药典标准的1.68和1.67倍,HZ样品组中的有效成分总量在4个样品组中含量最低,但其含量也达到规定要求的1.47倍。
2.2.1 关键活性成分成分变化
乌红天麻发酵过程中的有效成分变化如图1所示,天麻粉在经过酶解后,其酶解液中有效成分的含量相比天麻粉中的含量均有明显变化,其中发酵前和发酵后天麻素含量分别为1.55~10.24 mg/mL和0.99~8.93 mg/mL,其中WF1样品组中的天麻素含量最高,达到10.174 mg/mL,且显著高于其他样品组;而羟基苯甲醇含量在发酵前后分别为5.21~6.70 mg/mL和3.94~4.74 mg/mL,其中ZT样品组中的对羟基苯甲醇含量显著高于其他样品组。近年来对于天麻发酵过程中的相关研究还有所欠缺,对于发酵液中的有效成分,本研究发酵液中对羟基苯甲醇含量达到赵敏等[16]所制得天麻酵素中0.69 mg/mL的5.7~6.8倍;此外段桂媛[17]发现发酵后的天麻素和对羟基苯甲醇含量均达到1.75和0.89 mg/g。
图1 乌红天麻粉发酵过程中有效成分的变化
Fig.1 Changes of active ingredients during the fermentation process of Gastrodia elata powder
注:不同小写字母表示不同处理间差异显著(P<0.05)。
乌红天麻发酵前后过程中关键理化指标如表2所示,乌红天麻粉经过酶解熟化预处理后pH值为4.52~4.76,而发酵过程后pH值下降至3.29~3.57,酒精度达到0.22%vol~0.37%vol,说明乳酸菌和酵母菌能够利用天麻熟化后的营养物质进行协同发酵,乳酸是发酵过程中植物乳杆菌的主要发酵代谢产物[18],能够赋予天麻酵素柔和的酸度风味,而酿酒酵母则通过利用天麻中淀粉水解产物作为主要碳源物质,产生一定量的酒精,增添天麻酵素的酒香风味。另外,通过对比分析发现,4种乌红天麻酵素中乳酸含量为5 595.45~8 538.15 μg/g,不同产区的天麻经同一条件发酵生成的乳酸含量存在显著差别,说明天麻原料品质的不同会影响天麻发酵过程的发酵程度,推测原因是天麻粉中原料成分差异而致使微生物利用及发酵代谢的差异情况,具体影响作用还需进一步系统深入探究。
表2 乌红天麻粉发酵过程中理化指标
Table 2 Physicochemical indexes during the fermentation process of G.elata powder
组别发酵前pH发酵后pH酒精度/%vol乳酸含量/(μg/g)WF14.52±0.013.37±0.010.31±0.015 595.45±749.04WF24.67±0.013.34±0.000.37±0.036 821.30±628.19HZ4.59±0.013.57±0.040.35±0.016 265.20±416.63ZT4.76±0.003.29±0.010.22±0.038 538.15±645.80
2.2.2 天麻发酵过程各阶段挥发性组分的变化
发酵食品的风味形成是较为复杂的生化变化过程,除原料差异和工艺影响外,发酵微生物也具有至关重要的作用,而植物性原料为基质的发酵食品则有品种繁多、风味各异的特点,但主要的风味物质成分主要有酯类、酮类、醛类、酸类、醇类、酚类等。天麻作为植物性原料,其中的蛋白质、碳水化合物、脂质等主要营养物质均可在微生物的作用下转化新增特殊风味,4种乌红天麻酶解液及其发酵液中挥发性成分见附表1(https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.040168,附表2同)。
天麻酶解液主要是将天麻中的纤维素、淀粉进行水解后而得到小分子化合物,水解后的糖经过酶解过程中的加热分解后,会形成一种牛奶糖般的香气特征,生成以呋喃为主的挥发性成分,如2,3-二氢苯并呋喃、2-乙酰基呋喃等化合物;且随着反应的进行会生成大量低分子醛类,而天麻中的物质大多含有苯环,则因此生成了大量糠醛、苯甲醛、苯乙醛和5-羟甲基糠醛等物质。
4种乌红天麻酶解液中共检测出45种挥发性成分,其中共包括醛类化合物12种、酮类化合物4种、酸类化合物5种、酯类化合物6种、醇类化合物7种,酚类化合物3种、烃类化合物2种以及其他化合物6种。对不同保留时间物质进行嗅闻时发现,酶解液中在保留时间为21.86 min时的出峰物质苯乙醛具有明显花香味;而呈臭味的物质主要为保留时间为30.99 min左右时的出峰物质对甲基苯酚,又称对甲酚,其主要表现为马尿味,此结果与近年来研究结果相符[19];此外还存在其他物质造成的腥臭味、消毒水味、以及口水臭味,但这些物质在相应时间内并未完全被仪器所识别。
发酵后的发酵液中共检测出61种挥发性成分,其中共包括醛类化合物3种、酮类化合物3种、酸类化合物13种、酯类化合物12种、醇类化合物17种,酚类化合物6种、烃类化合物2种、醚类1种以及其他化合物4种。对不同保留时间物质进行嗅闻时发现,天麻酵素在保留时间为25.79 min时的出峰物质乙酸苯乙酯具有明显的类似花香的香甜气息,此外在其他保留时间还能闻到柠檬清香及其他芳香味,但这些物质并未被仪器识别;天麻酵素中呈现不良气味的物质除了天麻本身具有的特征性风味物质对甲基苯酚外,相比于发酵前酶解液,可能还存在其他造成尿骚味、马尿味、中药味的物质,但这些物质并未被机器识别,卢义龙[20]的研究也认为二甲基二硫醚可能与天麻特殊的马尿味有关。虽然发酵后出现了其他造成不良气味的物质,但整体风味上,通过嗅闻,相较于发酵前的风味已得到显著改善,推测原因是乳酸菌和酵母菌的协同发酵过程中产生的多种挥发性风味物质相互作用的综合结果。
上述分析结果表明天麻经过乳酸菌和酵母菌的协同发酵后,将原料中的蛋白质、氨基酸、糖类、脂肪适当降解成短肽、游离氨基酸、单糖、脂肪酸等物质进行代谢转化,一部分供自身生产繁殖所需,另一部分则为天麻酵素的特征风味奠定了丰富的前体物质基础。在乳酸菌发酵过程中通过异型乳酸发酵和同型乳酸发酵,生成的发酵产物主要为乙醇、乙醛、乙酸,此外还有少量甲酸、丙酸、丁酸、高级醇等[21]。其中酸类及醇类的种类和数量的上升主要是葡萄糖在代谢、酵解过程中所形成的,且由于天麻原料中含有苯环的物质较多,因此形成了较多以苯甲醇、苯乙醇为主的醇类物质,此外还有在丙酮酸脱氢酶及丙酮酸脱羧酶的参与下形成乙酰辅酶A及“活性乙醛”结合形成双乙酰,在乳酸脱氢酶的作用下也会生成2,3-丁二醇等物质[22];酸类物质则主要为苯甲酸、苯乙酸、苯丙酸及己酸、辛酸、壬酸等直链羧酸,主要是由脂肪、蛋白质等物质经微生物中的酶代谢后所生成。而酯类的数量明显增多,是由于发酵使原料中的蛋白质在蛋白酶和微生物的作用下水解为氨基酸和其他有机酸,进而与醇类物质在酶的作用下发生酯化反应缩合生成大量酯类,使天麻具有酯类的香气。而对于其他物质,如一些含氮、含硫的苯并噻唑、腈类等化合物,这些化合物则是由于酶解时植物组织被破坏,而在酶和微生物作用下生成葡萄糖和进而产生腈类化合物和其他含硫化合物[23]。
将天麻发酵前后的风味物质检测结果进行聚类分析,以欧式距离为测度,来揭示4种乌红天麻发酵过程中挥发性物质组成变化情况,其聚类分析结果见图2。
由图2可知,4种乌红天麻在发酵前的酶解液均能聚为一类,其中各样品又能被细分为三类,其中HZ与WF2能分为一组,而后WF1和ZT各为一组,随着欧式距离的增加,不断聚为一类;而混合发酵后的发酵液则除ZT发酵液外均能被聚为一类,其中WF1和WF2能分为一组,随着欧式距离的增加,HZ也能与其归为一类,而发酵液中ZT发酵液则很难与其他聚为一类。由此可见天麻经过微生物发酵后,整体挥发性风味物质的组成发生了改变,其中ZT乌红天麻在酶解前后差异最大,可能首先是由于其原料本身的特性,其次其营养成分等如蛋白质、粗纤维及对羟基苯甲醇含量较高,导致在发酵后产生的物质种类及含量与其他样品差距较大,而使其挥发性风味物质的组成出现了显著差异,无法与其他组聚为一类。
图2 四种乌红天麻挥发性成分聚类分析
Fig.2 Cluster analysis of the volatile components of the four species of G.elata
通过查阅文献及书籍查找上述挥发性风味物质的感官阈值[24],计算风味物质的OAV,结果见附表2,OAV越大,表示该成分对风味的贡献越大,4种乌红天麻酶解液与发酵液中风味物质解析如表3所示。
由附表2可知,4种乌红天麻的酶解液中OAV>1的物质主要有6种,分别为(Z)-2-壬烯醛、对羟基苯甲醛、对甲基苯酚、2,4-壬二烯醛、壬醛和苯乙醛,这些物质对酶解液的风味物质的贡献程度较大,除对甲基苯酚引起的的马尿味以外,其他物质主要表现为生腥味、青草气息和油脂香气。此外辛醛、2,5-呋喃酮、己醛、己酸和苯乙醇,这些物质主要对整体气味起到辅助作用,其中己酸呈现汗臭味,可能也是造成天麻本身特殊气味的原因之一。而发酵液中主要风味物质主要有6种,其中,异戊醇、对甲基苯酚、壬醛为4种乌红天麻酵素中所共有的主要风味物质,除对甲基苯酚外其主要呈现指甲油和脂肪的气味。此外,丙位壬内酯、乙酸苯乙酯、辛酸乙酯、苯乙醇和苯乙酮,这些物质作为辅助风味物质,为天麻酵素带来了丰富的黄油味、花香、果香、蜂蜜香气和奶酪味等令人愉悦的风味物质。
表3 四种天麻酶解液与发酵液中风味物质的香气特征
Table 5 Aroma characteristics of flavor substances in enzyme digest and fermentation broth of four kinds of G.elata
物质香气特征对甲基苯酚强烈的类似苯酚香气以及烟草酚香(马尿味)(Z)-2-壬烯醛生腥味苯乙醛具有类似风信子的香气2,4-壬二烯醛脂肪气味、带青草气、草药气息对羟基苯甲醛微弱的令人愉快的甜香气味壬醛呈强烈脂肪气息己醛生油脂和青草气辛醛脂蜡香己酸汗臭味2,5-呋喃酮焦糖味苯乙酮奶酪味、甜味、扁桃仁苯乙醇蜂蜜香气异戊醇指甲油芳樟醇柑橘、花香、青香以及木香丙位壬内酯香甜、黄油味乙酸苯乙酯花香辛酸乙酯酒香、果香
综上,4种乌红天麻在酶解和发酵后的风味物质上具有相似性,共有的主要挥发性物质为对甲基苯酚和壬醛,说明天麻本身特有的特征性风味物质为该2种成分,天麻特有的“不良”风味物质主要为对甲基苯酚和己酸,在发酵后能使异戊醇、丙位壬内酯、乙酸苯乙酯、己酸、辛酸乙酯、苯乙醇和苯乙酮等具有令人愉悦的风味物质的主要及辅助风味物质增加,使天麻除特有风味外的其他风味物质均能让人感到较为愉悦,进而提高人们的接受度。近年来,还有天麻发酵的相关研究表明发酵能降低天麻的苦涩味[25]。
通过将湖北五峰产区的2种乌红天麻与其他产地进行对比分析,五峰天麻总灰分为及SO2残留量均达到药典要求,同时天麻素及对羟基苯甲醇的总量也远高于药典标准,其中总含量最高的WF1达到6.26 mg/g,分别是汉中HZ天麻、邵通ZT天麻的1.69和1.49倍。因此,以五峰天麻为原料进行深加工开发系列功能食品,在生物活性成分上具有一定品质优势。
天麻本身具有令人不愉悦的风味,这对于后续的精深加工产业发展形成一定限制和阻碍,本研究以天麻为原料,采用乳酸菌及酵母菌的协同发酵形成酵素后,发现其pH值、乳酸等关键指标含量均能满足植物酵素行业标准要求,其中天麻素和对羟基苯甲醇含量最高可达10.174、4.74 mg/mL;同时通过对发酵过程的特征性风味解析,发现呈马尿味的特征性表征物质为对甲基苯酚,另外己酸所呈现的汗臭味可能也是带来不良气味的原因,此外还存在其他物质造成的腥臭味、消毒水味以及口水臭味,但这些物质在并未被仪器所识别;而OAV和聚类分析结果均表明天麻在经过酶解处理和发酵后,酯类、醇类及酸类等具有令人愉悦风味物质的种类有所增加,从而使天麻原有的不良风味整体上得到了显著改善,更容易被消费者接受,这可为天麻后续的深加工产业化指导提供一定理论基础。
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