酱油是常见的调味品之一,我国的酱油酿造历史悠久,最早可追溯至周朝[1]。影响酱油品质的因素有很多:发酵工艺、环境因素、发酵时间、菌种等,现阶段对于酱油发酵工艺优化的研究主要集中于外源添加菌种或者其他底物进行发酵、调控发酵过程中的温度或者湿度、运用不同的发酵工艺 (日式工艺、浇淋工艺)、优化发酵方式包括高盐稀态发酵法、固态发酵法、固稀结合发酵法等。酱油发酵过程中菌种发挥着不可替代的作用,国内外对于酱油中的菌种研究主要包括筛选酱油发酵中的优势菌株并进行再构建后投入酱油发酵中、优化酱油制曲过程中的曲霉种类及比例和在酱油发酵过程中运用已报道的功能性菌株。
酱油发酵过程中所运用到的曲霉包括米曲霉、红绶曲霉和黑曲霉,大多运用在酱油的制曲阶段。黑曲霉同米曲霉相同,可分泌大量酶系,如蛋白酶、纤维素酶等[2-3],且有研究表明黑曲霉的酸性蛋白酶和β-葡萄糖苷酶活力较强[4]。现阶段酱油中黑曲霉的研究主要集中在制曲阶段与米曲霉按比例添加进行混合制曲,有研究发现将米曲霉和黑曲霉进行不同比例混合制曲之间差异很大,总蛋白酶含量会提升且生成了较多的特征性挥发性香气物质,酱油中的总氮、游离氨基酸大幅度上升,种曲中的类黄酮、不饱和脂肪酸、酚类物质等也有所变化[5-8]。黑曲霉在酱油发酵中还起到其他的重要作用,黑曲霉能够促进柠檬酸的积累[9],而柠檬酸是酱油中的关键呈味有机酸,对酱油的酸味有贡献[10];黑曲霉分泌的一种脯氨酸内肽酶(a prolyl endopeptidase,APE)可以提升酱油中脯氨酸的含量且APE还能够降解B3亚基,减少了酱油的二次沉淀[11],脯氨酸是一种甜味氨基酸,其对酱油的滋味有促进作用。现也有将黑曲霉运用于各种发酵产品中的研究,有研究利用黑曲霉进行小麦胚芽蛋白发酵制备小麦胚芽蛋白肽[12],将黑曲霉与其他菌混合后接种到普洱茶中发酵可有效缩短发酵周期,挥发性风味物质如酚类物质也有所增加[13]。
黑曲霉在酱油发酵过程中起着重要作用,常常被用于制曲阶段,探究与其他微生物混合制曲对酱油中关键物质的影响,但现阶段研究中鲜有探究在盐水发酵过程中添加黑曲霉的影响,在前期研究中团队发现黑曲霉是酱油发酵过程中的优势菌种且发酵初期黑曲霉丰度最高,然后慢慢回落,在40 d和60 d时丰度有所回升,因此本研究在酱油发酵的中后期接种黑曲霉进行发酵,旨在探究黑曲霉的外源添加是否对酱油中的香味物质及滋味物质产生影响,从而使酱油的品质得到提升。
1 材料与方法
1.1 实验材料
酱油发酵基料,广东美味鲜调味品有限公司;黑曲霉GDMCC3.25,广东微生物菌种保藏中心。
马铃薯葡萄糖水,环凯生物科技有限公司;氨基酸标准品,北京索莱宝科技有限公司;2-甲基-3-庚酮,上海阿拉丁生化科技股份有限公司;有机酸标准品,上海源叶生物科技有限公司;其他试剂均为国产分析纯。
1.2 主要仪器设备
气相色谱-质谱联用仪,美国安捷伦公司;HPLC(SPD-M20A检测器),日本岛津公司;x0-1柱温箱,济南清川仪器有限公司;L530高速离心机,湖南湘仪实验室仪器开发有限公司;ME204电子天平,梅特勒-托利多仪器 (上海) 有限公司;PHS-3C-01 pH计,上海三信仪表厂。
1.3 实验方法
1.3.1 菌种培养
将黑曲霉先在PDA培养基上30 ℃培养5～7 d,再按2.5% (体积分数) 比例接种至PDA液体培养基,30 ℃、220 r /min培养至孢子数达109 个/mL。
1.3.2 酱油发酵工艺
将酱油发酵基料混匀置于5 L发酵罐中,发酵罐上端加盖玻璃盖,避免异物掉落进酱油且保证空气与酱油发酵基料有充足的接触面积,在露天处发酵,每15 d搅拌1次,在发酵到40、60 d时,加入培养到 OD600值达0.733,109 个/mL的黑曲霉(下文分别表示为HD40、HD60),同时发酵一组未添加任何物质的酱油样品为对照组(下文表示为CK),发酵90 d后进行取样。
1.3.3 感官评价
由10名经过专业培训的人员组成感官评分小组。取出酱油进行离心,将各样品进行乱序编号,编成3位数,让参与感官评定人员进行定量评价,每次入口的酱油量保持一致,对酱油从色泽、香气、滋味、体态4个方面进行感官评分,满分为10分,评分标准参考 GB/T 18186—2000《酿造酱油》中感官特性及张振斌[14]的方法进行拟定。
1.3.4 理化指标检测
将发酵结束的样品进行离心,取上清液进行各指标的测定。根据GB 5009.235—2016《食品安全国家标准 食品中氨基酸态氮的测定》中的方法对酱油样品中的全氮含量进行测定,根据GB 5009.8—2023《食品安全国家标准 食品中果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖的测定》中的方法对酱油样品中的总糖含量进行测定,根据GB 12456—2021《食品安全国家标准 食品中总酸的测定(含第1号修改单)》中的方法对酱油样品中的总酸含量进行测定,色度值(L值)测定运用紫外分光光度计在520 nm处测定吸光值。
1.3.5 固相微萃取(solid-phase microextraction,SPME)-GC-MS测定挥发性物质
参照WANG等[15]的方法稍作改动,样品准备:取 8 mL 酱油和 2 μL 2-甲基-3-庚酮甲醇溶液(0.816 μg/μL,内标物) 于 20 mL 的顶空进样瓶中,在振荡器中45 ℃加热 20 min 后,利用固相微萃取针吸附 40 min后进样;GC条件:进样口温度250 ℃,解析时间5 min;程序升温为40 ℃保持2 min,以4 ℃/min 升温至120 ℃,保持2 min,然后以7 ℃/min 升温至210 ℃,保持10 min,载气为高纯氦气,载气流速1.0 mL/min,不分流。MS条件:EI 离子源电子能量为70 eV,发射电流200 μA,离子源和传输线温度为 250 ℃,扫描模式为全扫描,扫描时间为 1～45 min,m/z 扫描范围 30～500。挥发性化合物定性分析:采用 NIST14谱库进行检索对比,再根据保留时间和标准质谱比对来确定物质结构。
1.3.6 游离氨基酸测定
参照黄毅等[16]的方法,稍作修改进行游离氨基酸测定,先将样品进行衍生化处理,再利用HPLC进行测定,根据峰形和峰面积进行游离氨基酸的定性及定量分析,根据标准曲线计算出样品中所含的游离氨基酸含量,结果表示为每毫升酱油中游离氨基酸的含量 (mg/mL)。
1.3.7 有机酸测定
配制不同浓度的有机酸标准品,取一定量的样品进行10倍稀释,过0.45 μm滤膜待测,参照WU等[17]的方法稍作改动,色谱柱为C18,流动相为0.01 mol/L 的KH2PO4溶液(pH=2.82) 和纯甲醇,比例为97∶3(体积比),流速0.5 mL/min,柱温30 ℃,检测器是紫外检测器,检测波长215 nm,进样量20 μL,根据出峰时间及峰面积进行定性定量分析。
1.3.8 数据分析
本文图以Graphpad、Origin软件进行绘制,数据采用SPSS 22.0进行分析,表示为“平均值±标准差”,采用ANOVA进行显著性差异分析(P<0.05),所有数据通过3次重复检测实验得到。
2 结果与讨论
2.1 感官评价
通过对酱油样品的体态、色泽、香气、滋味进行全面地评价,分析在不同发酵时间添加黑曲霉发酵得到的酱油是否有差异,由感官评分雷达图可知(图1),HD40及HD60的感官评价总分较为相近,但这2组样品在体态、色泽、滋味、香气方面均显著优于对照组 (P<0.05),这表明在这2个时间点添加黑曲霉进行发酵有助于提升酱油的总体感官特性,其中HD60在滋味、香气和色泽上分别比对照提高了20.34%、5.80%,17.80%,HD60组酱油在整体风味上更好。为了进一步评判黑曲霉的添加对酱油风味是否存在积极影响,下文进一步分析酱油中的滋味及香气指标。
图1 添加黑曲霉发酵酱油感官评分雷达图
Fig.1 Radar image of sensory score of soy sauce fermented by adding Aspergillus niger
注:CK、HD40、HD60分别代表对照、在40、60 d外源添加黑曲霉(下同)。
2.2 理化指标测定结果
本研究对于发酵90 d后的酱油进行总糖、总酸、全氮、L值的测定,从这几方面探究黑曲霉的添加对于酱油风味的影响。总糖、总酸、全氮是表征酱油滋味的重要指标,酱油的颜色深浅也是考量酱油品质的关键指标之一,而L值就是常用于表征酱油颜色深浅的指标之一。如图2所示,其中HD60在全氮、总酸、总糖含量及色度值均显著高于HD40(P<0.05),HD60总糖含量相较于HD40提升了15.76%,总酸含量提升了6.55%,黑曲霉可分泌酸性蛋白酶,蛋白酶可以水解酱油发酵过程中的蛋白质,使大分子分解为小分子物质,例如糖、酸等,因此也推测在发酵后期加入黑曲霉分泌较多的蛋白酶,黑曲霉活力较高,能够产生更多对于酱油香气及滋味有促进作用的物质,添加黑曲霉发酵酱油的总酸相较于对照组下降可能是发酵后期水分含量的下降从而影响了产酸微生物的代谢活动,使部分酸挥发导致的[18]。对照组与HD60中的全氮含量较为接近,HD60中全氮含量约为1.50 g/100 mL,显著高于HD40 (P<0.05),达到了国标规定的高盐稀态发酵酱油中特级酱油的标准。HD60的L值显著高于对照及HD40表明该组酱油的颜色最深,而酱油的颜色形成主要受到美拉德反应的影响,与相关研究表明黑曲霉的接入会使酱油颜色变深也相对应[5],因此也推测在发酵中后期加入黑曲霉促进美拉德反应的产生从而使酱油的色泽变深,变得更加诱人。由上述4个理化指标结果初步推断,在发酵60 d时添加一定量的黑曲霉相较于40 d添加对酱油的品质更有促进作用。
a-全氮;b-总糖;c-总酸;d-L值
图2 添加黑曲霉发酵酱油全氮、总糖、总酸含量及L值
Fig.2 Total nitrogen, total sugar, total acid and L value of soy sauce fermented by adding A. niger
注:*表示差异显著(P<0.05)。
2.3 挥发性风味物质测定
为了探究不同时间添加黑曲霉对酱油香气的影响,本研究对于酱油中的挥发性物质进行了测定。一共检测到52种挥发性物质,主要包括醇类、醛类、酮类、酚类、吡嗪类、呋喃类、杂环类、酸类、酯类9大类芳香化合物,其中种类及含量较多的主要特征香气物质如图3所示。从各类物质含量来看,酸类物质含量最高达36.92 mg/L,其次是醛类物质达33.50 mg/L,而酚类物质和醇类物质的含量则较低,对照组中的酸类物质含量高于2个添加黑曲霉样品组,HD40、HD60中醛类物质含量显著高于对照组,分别提升21.33%、6.59%,芳香醇类物质含量相较对照组提升了19.18、15.93倍,酚类物质含量分别提升了2.94倍、3.21倍,黑曲霉分泌丰富的酶系将蛋白质等分解成各种挥发性物质或者是形成挥发性物质的前体[19],从而使酱油中挥发性物质种类及含量增多。
图3 三种酱油样品中挥发性物质种类及含量
Fig.3 Categories and contents of volatile compounds of three soy sauce samples
注:不同小写字母代表差异显著(P<0.05)(下同)。
由图4可知,颜色强度归一化范围从最大值1(红色)到最小值-1(蓝色),CK与HD40及HD60之间各类物质的含量有显著性差异,1-辛烯-3醇、苯甲醛、苯乙醛、甲硫基丙醇、愈创木酚、4-乙烯基愈创木酚、羟基丙酮、2,6-二甲基吡嗪、2-甲基-6-乙烯基吡嗪均是检出的关键香气物质[15],多种香气成分相互作用使其整体感官上呈现出浓郁的焦糖味、酱香味、甜香味、烟熏味、烘烤味、果香味和花香味等。添加黑曲霉样品组中关键香气物质含量明显高于对照组,如检测到呋喃类中2-乙酰基呋喃、5-甲基-2-呋喃甲醛含量升高可增强酱油焦糖香、香醋香味,此外,还运用液液萃取-气相色谱-质谱法(liquid-liquid extraction-gas chromatograph-mass spectrometry,LLE-GC-MS)的方法检测到了具有焦糖香味的关键风味物质4-羟基-2-乙基-5-甲基-3(2H)-呋喃酮(4-hydroxy-2-ethyl-5-methyl-3(2H)-furanone, HEMF)及4-羟基-2.5-二甲基-3(2H)呋喃酮(4-hydroxy-2,5-dimethyl-3(2H)furanone,HDMF),且HD60的含量高于HD40,HD60中HDMF达0.13 mg/mL;醇类物质中3-甲硫基丙醇含量在HD40和HD60组相较于对照组提升了5.96、9.64倍,且上述2组均检测到了对照中未检出的1-辛烯-3-醇,为酱油增添了烤土豆香及蘑菇香味;醛类物质中,HD60中苯乙醛较HD40增加了7.55%且均检测到对照中没有的戊醛,提升酱油的果香及花香味;酚类物质中HD60检测到了对照及HD40均未检出的间甲酚,有助于为酱油增添独特的木质风味;此外还检出1H-吡咯-2-甲醛、2-乙酰基吡咯为酱油增加咖啡香和可可香气。总体上HD40及HD60的挥发性物质种类及含量均优于对照组,HD60的香气物质更加饱满,由此也推测在发酵中后期加入黑曲霉,影响了酱油中微生物的代谢活动,也因而产生了更丰富的特征风味物质。
图4 发酵90 d后酱油样品中主要挥发性物质聚类热图
Fig.4 Cluster heatmap of main volatile compounds in soy sauce samples after 90 days of fermentation
2.4 游离氨基酸测定
游离氨基酸是表征酱油鲜味的重要指标,酱油中的呈味氨基酸主要包括鲜味氨基酸、甜味氨基酸和苦味氨基酸。对发酵90 d后酱油样品中常见的11种游离氨基酸进行测定,其中包括鲜味氨基酸2种,甜味氨基酸4种,苦味氨基酸5种,还包括4种必需氨基酸,添加及未添加黑曲霉发酵酱油样品中游离氨基酸含量如表1所示。与对照相比,在40、60 d添加黑曲霉发酵酱油样品的鲜味氨基酸均升高,HD40、HD60相比对照分别提升43.49%、54.93%,但2种添加时间在对鲜味氨基酸的提升方面未见明显差异, HD60中谷氨酸及天冬氨酸含量高达4.70、4.10 mg/mL,而在甜味氨基酸方面,HD60中甘氨酸、丝氨酸、脯氨酸、苏氨酸相较于对照显著增加 (P<0.05),其中苏氨酸含量最高达 (4.33±0.40) mg/mL,有助于增强酱油的甜味,3种酱油中苦味氨基酸含量未见明显差异,因此在60 d添加黑曲霉可以增强酱油的滋味。黑曲霉在发酵过程中分泌了大量的酶系,分解了蛋白质生成酱油中的呈味氨基酸,丰富了酱油的滋味[20]。
表1 发酵90 d后酱油中游离氨基酸含量 单位:mg/mL
Table 1 Contents of free amino acids in soy sauce after 90 days of fermentation
呈味类型游离氨基酸 CKHD40HD60鲜味天冬氨酸2.70±0.97a3.84±0.97a4.10±0.44a谷氨酸2.98±1.09a4.31±1.11a4.70±0.44a甜味甘氨酸1.27±0.45a1.78±0.42ab2.11±0.28b丝氨酸2.03±0.32a2.00±0.47ab2.28±0.36b脯氨酸0.92±0.42a1.66±0.43b1.87±0.19b苏氨酸2.49±1.17a3.40±0.90ab4.33±0.40b苦味精氨酸2.26±0.58a2.40±0.56a2.96±0.42a缬氨酸1.00±0.41a2.39±1.52b2.40±0.21b组氨酸0.74±0.30a1.00±0.27a1.22±0.17a异亮氨酸1.14±0.95a1.29±0.32a1.88±0.26a亮氨酸1.60±1.03a2.42±0.55ab3.06±0.29b
注:同列不同小写字母表示具有显著差异(P<0.05)。
2.5 有机酸含量测定
有机酸也是酱油中重要的滋味物质之一。主要对酱油中的乳酸、乙酸、酒石酸、苹果酸、琥珀酸及柠檬酸进行了检测。由图5可知,含量较高的为苹果酸、柠檬酸、琥珀酸,而酒石酸、乳酸及乙酸的含量则相对较少。HD40中各有机酸含量均少于对照组及HD60,对照组和HD60组未见明显差异,除了酒石酸及柠檬酸显著高于对照(P<0.05)。琥珀酸呈现一种较为爽口的味道,在后续加热烹饪过程中还可以分解为重要挥发性物质酯类[21-22],在3种酱油样品的检出量均较高,HD60相较于HD40显著提升4.17%(P<0.05)。HD60中柠檬酸较对照显著提升12.74%(P<0.05),且也有研究表明柠檬酸可以延缓克罗诺杆菌的生长[23],而克罗诺杆菌是一种致病菌,因此也推断HD60中柠檬酸的显著提升也可抑制部分致病性微生物的生长。综合而言HD60相对于HD40更有助于酱油中有机酸的积累。
a-乳酸、乙酸、酒石酸;b-苹果酸、琥珀酸、柠檬酸
图5 酱油样品中有机酸含量图
Fig.5 Contents of organic acids in soy sauce samples
3 结论
通过对不同发酵时间单独外源添加黑曲霉发酵酱油样品进行感官评价、理化指标、游离氨基酸、有机酸及挥发性物质测定结果可以得到,HD60 组酱油风味提升更为明显 (P<0.05)。在感官评价方面,HD60在滋味、香气及色泽方面分别相较于对照提升了20.34%、5.80%、17.80%;在理化指标方面,HD60的总酸、全氮、总糖、L值均显著高于HD40(P<0.05);在游离氨基酸方面,HD60中检测到的鲜味氨基酸含量最高,达(8.70±0.88) mg/mL,各甜味氨基酸相较于对照也显著提升(P<0.05);有机酸HD60中的柠檬酸相较于空白显著提升12.74%(P<0.05),琥珀酸相较于HD40提升4.17%,有助于改善酱油的口感;在挥发性物质方面,特征香气成分在2个添加时间的检出量均有所提升,如3-甲硫基丙醇、苯甲醛、苯乙醛、HDMF、4-乙烯基愈创木酚、羟基丙酮、2,6-二甲基吡嗪等均有不同程度的提升,因此由这些指标综合推断在发酵过程中外源添加一定量的黑曲霉对于酱油风味的提升有积极影响,且在60 d添加黑曲霉的影响更为显著。本研究为酱油生产过程中菌种优化方面提供了一定的理论基础,在后续实验中也会进一步对于黑曲霉的添加量进行优化以及对酱油中物质变化的代谢通路进一步研究,为酱油发酵产业中菌种工艺优化方面提供更为全面科学的理论依据。
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