大黄鱼(Larimichthys crocea)俗称黄花鱼,其营养丰富,味道鲜美,是中国传统的“四大海产”之一,素有“国鱼”的美称[1]。大黄鱼加工产品主要包括盐渍大黄鱼、烟熏大黄鱼和香糟大黄鱼[2],其中轻腌大黄鱼是一种盐渍加工产品,具有低盐(≤6%)和高水分(40%～60%)等特点[3],深受消费者喜爱。但是,在轻腌大黄鱼加工和流通过程中微生物易大量繁殖,使其在后续贮藏和加工中发生腐败。因此,可以通过适当的处理方式对轻腌大黄鱼进行减菌处理,以确保微生物安全的同时最大限度地保持其品质。
微波(microwave,MW)是频率在300 MHz和300 GHz之间的非电离电磁波,具有通过磁场耦合、电穿孔、细胞膜破裂和选择性加热等方式破坏微生物的能力,因而可被用于食品杀菌[4]。微波杀菌可以有效降低食品中潜在微生物的数量并使酶失活,可在保证食品安全的同时保持其营养品质。栾东磊等[5]研究发现,微波处理后三文鱼的营养价值更高,并延长了货架期。然而,微波灭菌过程中也可能因实际温度分布不均匀导致灭菌不完全,或微波作用时间过长导致过热及焦化等现象[6]。因此,微波有必要与其他非热杀菌技术相结合,克服自身的局限性,在提高杀菌效率的同时维持其良好的品质。
微酸性电解水(slightly acidic electrolyzed water,SAEW)是在低压直流电场下,电解NaCl或HCl溶液而制得的水溶液。SAEW具有优异的抗菌活性,在pH 5.0～6.5,SAEW的氧化还原电位(oxidation reduction potential,ORP)特性和有效氯会导致细胞膜破裂和微生物死亡[7]。近年来SAEW在水产品加工的前处理及流通过程得到了广泛应用,有研究报道经SAEW减菌处理后的水产品中大肠杆菌、副溶血性弧菌、假单胞菌、腐败希瓦氏菌及单核增生李斯特菌的数量显著减少[8]。LI等[9]研究表明,SAEW处理对即食海蜇的质构和色泽无显著影响,可以减少其中的铝含量,并对腐败菌有显著抑制作用。LIU等[10]利用SAEW联合姜汁处理鲢鱼鱼片,具有显著的抗菌和抗氧化特性,延缓了鱼片品质下降。目前,微波联合微酸性电解水(M-S)处理水产品的研究还未见报道。
本文研究了MW、SAEW和M-S处理对轻腌大黄鱼微生物、理化指标和风味的影响,旨在为M-S处理应用于水产品杀菌保鲜提供理论参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
轻腌大黄鱼,三都港海洋食品有限公司,规格为0.4～0.5 kg/条。
NaCl(分析纯)、结晶紫中性红胆盐琼脂培养基、平板计数琼脂培养基、冰乙酸、石油醚,国药集团化学试剂有限公司;淀粉指示剂、硫代硫酸钠滴定液(0.01 mol/L),上海源叶生物科技有限公司;假单胞CFC选择性培养基,北京依珊汇通有限公司;铁琼脂培养基,上海朝瑞生物科技有限公司。
1.2 仪器与设备
Harmony-1000酸性电解水生成器,睿安德环保设备北京有限公司;Q510C立式压力蒸汽灭菌器,日本YAMATO公司;LHS-250HC-Ⅱ恒温恒湿箱,上海一恒科学仪器有限公司;KDN-103F自动凯氏定氮仪,上海纤检仪器有限公司;TMS-Pro质构仪,美国Food Technology Corporation公司;Chroma Meter CR400色差计,日本Minolta公司;Spark 10M多功能酶标仪,瑞士Tecan公司;YQ7G-05型微波强化杀菌机,南京永青食品新科技发展有限公司;SA-402B电子舌味觉系统,日本INSENT公司;FlavourSpec®风味分析仪,德国G.A.S公司。
1.3 实验方法
1.3.1 样品制备
本研究使用的SAEW是以5%(质量分数)NaCl溶液通过氧化电位水生成器中带有离子隔膜的电解槽电解而成,制取后立即使用。用有效氯浓度(available chlorine concentration,ACC)测定仪测定其ACC,pH值、ORP采用pH计测定。经测定,SAEW的pH值为6.16±0.07,ORP为(897.0±4.0)mV,ACC为(46.23±1.82)mg/L。
微波杀菌参数为2 450 MHz,900 W,将样品真空包装后放置于微波杀菌机的转盘中心,上方温度传感器可以实时测量样品表面温度,使其温度保持在(35±2) ℃。
将“三去”后的轻腌大黄鱼在(22±2) ℃条件下冷风干燥至水分含量为(45±2)%。本试验以整鱼进行,随机分为4组。a)CK组(对照组):不做处理;b)SAEW组:轻腌大黄鱼和SAEW的比例为1∶6(g∶mL),使鱼体完全置于SAEW中,浸泡20 min后用无菌纱布擦干鱼体表面水分;c)MW组:将轻腌大黄鱼真空包装后微波杀菌20 min;d)M-S组:将轻腌大黄鱼真空包装后MW杀菌10 min后置于SAEW中浸泡10 min,再用无菌纱布擦干鱼体表面水分,立即测定其色差值。随后将鱼皮慢慢剥离,取背肌,测定其质构。其余样品搅碎后测定其菌落总数、假单胞菌数、肠杆菌数、产硫化氢细菌数以及总挥发性盐基氮(total volatile base nitrogen,TVB-N)值,剩余样品置于-80 ℃冰箱保存待检测。
1.3.2 微生物计数
所有样品的稀释根据GB 4789.2—2022《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》中的方法进行,接种方法采用倾注法,菌落总数培养基采用平板计数琼脂培养基;假单胞菌培养采用假单胞菌CFC选择性培养基;肠杆菌培养采用结晶紫中性红胆盐葡萄糖琼脂培养基;产H2S细菌培养采用铁琼脂培养基,每个稀释梯度做2个平行。肠杆菌科置于37 ℃恒温培养箱中培养(24±1) h,其余培养基置于28 ℃恒温培养箱中培养(48±1) h,再分别进行菌落计数。
1.3.3 TVB-N值测定
参照GB 5009.228—2016《食品安全国家标准 食品中挥发性盐基氮的测定》,使用自动凯氏定氮仪测定。
1.3.4 色差值的测定
参照石钰琢等[11]的方法,选取大黄鱼腹部3个位点测定亮度值(L*)、红度值(a*)及黄度值(b*),每个样品重复测量5次。
1.3.5 质构分析
参照刘安齐等[12]的方法,分别取4组轻腌大黄鱼的背部肌肉,去皮,切成2 cm×2 cm×1 cm的小块,使用P/5柱形探头进行质构测定,包括硬度、弹性、黏附性、咀嚼性、胶黏性和内聚性。测试速度50 mm/min,形变量50%,回升高度30 mm。每组样品独立测定6次。
1.3.6 过氧化值(peroxide value,POV)测定
参照GB 5009.227—2023《食品安全国家标准 食品中过氧化值的测定》中滴定法进行测定。
1.3.7 硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid, TBA)值测定
参照WANG等[13]的方法并稍作修改,以样品中丙二醛含量(mg/kg)表示TBA值。称取5.0 g均质后的鱼肉置于100 mL具塞锥形瓶中,加入50 mL质量分数为7.5%的三氯乙酸溶液,加塞密封,振荡器振摇30 min后用双层滤纸过滤,收集滤液。取1 mL所得滤液加入等量TBA(0.02 mol/L),沸水浴反应30 min取出冷却至室温,取上清液在532 nm波长处测定吸光度。以1,1,3,3-四乙氧基丙烷做标准曲线,重复测量3次。
1.3.8 滋味测定
参考ZHANG等[14]的方法并稍作修改,取样放入水浴锅中使其中心温度达到40 ℃,称取鱼肉试样50.0 g,按料水比1∶5(g∶mL)加入40 ℃超纯水匀浆,8 000 r/min离心10 min,取上清液倒入电子舌专用容器中,每个样品设置测定4个循环,为保证结果的稳定性,删除第1个循环,取后3次的测量结果进行分析。
1.3.9 挥发性风味物质测定
自动进样条件:称取3.0 g鱼肉置于20 mL顶空瓶中,孵育温度40 ℃,孵化转速500 r/min,孵育时间15 min,采用顶空自动进样的方式,进样量500 μL,进样针温度65 ℃,不分流模式进样。
GC条件:采用强极性色谱柱MXT-WAX(30 m×0.53 mm,1 μm),柱温60 ℃,载气为N2(≥99.999%),载气的流速程序:起始流速2 mL/min,保持2 min,8 min内升至10 mL/min,接着10 min内升至100 mL/min并保持10 min,运行时间为30 min。迁移管温度为45 ℃,分析时间为30 min,载气/漂移气为N2。
1.4 数据统计及分析
采用SPSS 25.0软件进行统计学分析,结果以“平均值±标准差”表示,P<0.05表示差异显著;使用GC-IMS仪器内置的NIST数据库对挥发性化合物进行定性分析并生成指纹图谱;运用SIMCA14.1软件对挥发性风味物质进行正交偏最小二乘判别分析(orthogonal partial least squares discriminant analysis,OPLS-DA);利用软件Origin 2023绘图。
2 结果与分析
2.1 微生物数量变化
特定腐败微生物的生长和代谢,形成胺、硫化物、醇、醛、酮等成分,不仅导致大多数水产品腐败变质,也会产生让人无法接受的异味。经减菌处理后大黄鱼的菌落总数、肠杆菌科数、产H2S细菌数及假单胞菌数与未处理组相比均有显著性差异(P<0.05),结果如表1所示。CK组菌落总数为5.83 lg CFU/g,减菌处理后M-S组菌落总数最少,为2.83 lg CFU/g,与CK组相比菌落总数降低了3.00 lg CFU/g。肠杆菌科作为食品污染最常见的微生物之一,是食品杀菌的主要对象。CK组肠杆菌科数为5.59 lg CFU/g,经减菌处理后SAEW、MW、M-S组的肠杆菌科数量显著减少,分别为3.02、2.66、1.63 lg CFU/g。ULUSOY等[15]也发现MW处理可以降低海产品中的致病菌如大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和单核细胞增生李斯特菌。TANTRATIAN等[16]研究发现,SAEW能抑制牡蛎中大肠杆菌的生长繁殖。各处理组假单胞菌数均小于1 lg CFU/g,其中M-S组产H2S细菌数也小于1 lg CFU/g,说明SAEW和MW都对假单胞菌和产H2S细菌有一定的杀灭作用。在本试验中M-S组杀菌效果最好,可能是由于SAEW中的有效氯和微波影响了细胞膜周围电子和离子浓度,从而改变细胞膜的通透性能,使得对生物分子具有潜在氧化损伤的次氯酸更容易进入细菌内部破坏核酸和脱氧核酸,从而导致细菌死亡[17]。
表1 不同减菌处理条件下轻腌大黄鱼的微生物数量 单位:lg CFU/g
Table 1 Microbial counts of lightly salted large yellow croaker in different sterilization treatments
组别菌落总数肠杆菌产H2S细菌假单胞菌CK5.83±0.05a5.59±0.02a4.95±0.01a2.48±0.14SAEW4.08±0.02b3.02±0.04b2.93±0.03b<1MW3.33±0.01c2.66±0.01c1.15±0.21c<1M-S2.83±0.03d1.63±0.21d<1 <1
注:同一列数据上标不同字母表示差异显著(P<0.05)(下同)。
2.2 TVB-N值的变化
TVB-N值是衡量鱼肉货架期和新鲜度的重要指标,微生物分解肉类营养物质而产生基本含氮物质,主要是氨(NH3)、二甲胺、三甲胺、腐胺和尸胺,这些物质会导致肉类变质。由图3可知,与对照组(16.66 mg/100 g)相比,3个处理组的TVB-N值均显著降低(P<0.05)。根据GB/T 18108—2024《鲜海水鱼通则》中规定,TVB-N含量<15.0 mg/100 g即为优质鱼肉,最大可接受限度为30 mg/100 g。因此,3种减菌处理方法均使大黄鱼的TVB-N值保持在可接受的范围内,其中M-S组TVB-N值最低为11.25 mg/100 g,能有效减少鱼肉中产生的含氮物质。SAEW组和M-S组比MW组TVB-N值低,原因可能是因为SEAW为弱酸性,抑制了大部分中性到碱性的细菌的生长,有利于减缓碱性含氮物质的合成,从而降低TVB-N值[18]。
图1 不同减菌处理条件下轻腌大黄鱼TVB-N值的变化
Fig.1 Changes in the TVB-N of lightly salted large yellow croaker in different sterilization treatments
注:不同小写字母表示有显著差异(P<0.05)(下同)。
2.3 色差的变化
色泽是消费者判断水产品品质的重要指标之一,腹部呈“金黄色”是大黄鱼典型体色特征。如表2所示,SAEW组相对其他组L*值显著升高,原因可能是酸性电解水能抑制水产品中多酚氧化酶的活性,而多酚氧化酶可以将酚类氧化为醌,醌类聚合并最终形成黑色色素[19]。SAEW组和MW组的a*值和b*值都显著低于M-S组(P<0.05)。M-S组b*值和对照组无显著差异,说明联合减菌处理后对大黄鱼的b*值没有显著影响,能较好地维持大黄鱼的体表色泽,保证品质。鱼类的a*值和b*值可能与某些肌红蛋白的氧化和脂质氧化有关[20],M-S组a*值和b*值和另外2个处理组相比显著升高的原因可能是联合处理可以抑制肌红蛋白氧化和脂质氧化从而缓解色素氧化。
表2 不同减菌处理条件下轻腌大黄鱼色泽的变化
Table 2 Changes in the color of lightly salted large yellow croaker in different sterilization treatments
组别L*a*b*CK74.89±1.24b-0.83±0.11b32.60±0.97aSAEW77.29±0.07a-2.03±0.07c24.51±2.48bMW74.13±1.47b-1.94±0.11c22.14±1.70bM-S73.54±0.77b-0.63±0.11a32.00±0.38a
2.4 质构的变化
鱼类死后肌肉的硬度、黏附性、内聚性、弹性、胶黏性和咀嚼性的变化是由蛋白酶和细菌繁殖引起的肌纤维蛋白和脂质的改变造成的,肌肉类食品的质地特征与其保水能力、种类、肌纤维密度、蛋白质和脂肪含量有关[21]。因此,质构可用来表征水产品肌肉品质变化。由表3可知,在硬度、弹性、内聚性和胶黏性方面SAEW组与对照组均无显著差异,M-S组和MW组的值显著低于对照组(P<0.05),原因可能是SAEW可以抑制蛋白质、脂质和微生物种群的变化,从而保持鱼肉的质地[22]。和对照组相比,3个处理组咀嚼性均显著降低(P<0.05),张婷等[23]报道咸鱼的感官评分与咀嚼性呈负相关,咀嚼性越低,感官评分越高。MW组总体质构数值都变小的原因可能是加热使鱼肉蛋白结构被破坏,肌纤维断裂。M-S组中MW时间缩短可降低MW对质地的不良影响。
表3 不同减菌处理条件下大黄鱼质构的变化
Table 3 Changes in the texture of lightly salted large yellow croaker in different sterilization treatments
组别硬度/N弹性/mm黏附性/(N·mm)内聚性/Ratio胶黏性/N咀嚼性/mjCK47.30±2.16a3.28±0.29a0.32±0.02a0.48±0.03a22.37±1.07a71.86±3.25a SAEW44.79±1.36a2.94±0.05a0.20±0.02b0.49±0.02a22.03±1.40a62.98±2.38bMW34.66±0.22c2.14±0.22b0.10±0.01c0.30±0.07b11.23±1.49b23.90±1.28cM-S39.21±1.67b1.92±0.11b0.12±0.01c0.25±0.02b9.71±0.63b20.46±2.19c
2.5 POV的变化
POV主要用于表征样品的初级氧化产物,用来判定大黄鱼脂肪氧化程度。由于H2O2性质不稳定,易分解成醛、酮等小分子,因此POV更合适作为脂质早期氧化的指标。由图2可知,3种减菌方式与对照组的POV相比均显著降低(P<0.05),SAEW、MW、M-S组POV分别为0.66、0.59、0.51 mmol/kg。蓝蔚青等[24]研究也发现,经SAEW处理过的海鲈鱼片POV随贮藏时间升高,但远低于对照组。
图2 不同减菌处理条件下轻腌大黄鱼POV的变化
Fig.2 Changes in the POV of lightly salted large yellow croaker in different sterilization treatments
2.6 TBA值的变化
鱼肉产生异味的主要来自鱼肉中不饱和脂肪酸的氧化,TBA值可以反映脂肪氧化的程度,以样品中丙二醛含量(mg/kg)表示TBA值,其值越高,表明产生醛类和酮类等会散发异味的氧化产物越多,含量超过2.2 mg/kg就会产生难闻的气味。由图3可知,3个处理组TBA值与对照组相比均显著降低(P<0.05),M-S组最低为0.76 mg/kg,说明联合减菌处理能有效抑制大黄鱼的脂质氧化,减菌处理后微生物生长繁殖变慢,同时钝化脂肪酶的活性,降低水产品脂肪氧化速率。栾东磊等[5]研究发现,MW能有效抑制三文鱼在贮藏期间的品质劣变;吴怡等[25]研究表明SAEW处理后的海鲈鱼在贮藏过程中的脂质氧化比对照组显著降低,与本研究结果一致。SAEW结合MW的应用可以提高样品的氧化稳定性,降低TBA值,这也与联合处理可以缓解色素氧化的结果相一致。
图3 不同减菌处理条件下轻腌大黄鱼TBA值的变化
Fig.3 Changes in the TBA of lightly salted large yellow croaker in different sterilization treatments
2.7 风味
2.7.1 滋味的变化
电子舌中使用的化学传感器,如生物传感器、光学质量传感器或电化学传感器,与分析物反应并产生电信号,以此来分析食物或饮料的基本味道[26]。不同减菌处理方式的轻腌大黄鱼滋味响应程度如图4所示,其中咸味的无味点为-6.00,其余味道的无味点均为0。4组样品的风味轮廓形状相似,以鲜味和苦味为主;3个处理组的苦味值均显著低于空白对照组(P<0.05),鲜味值SAEW组和M-S组显著高于对照组(P<0.05),说明经过减菌处理也能较好地保持大黄鱼鲜味物质的稳定性。
图4 不同减菌处理条件下轻腌大黄鱼的电子舌雷达图
Fig.4 Electronic tongue radar chart of lightly salted large yellow croaker in different sterilization treatments
2.7.2 挥发性风味物质的变化
通过软件内置的NIST和IMS数据库对挥发性风味物质进行定性分析,在所有样品中共鉴定出46个化合物,还有2个化合物未能定性,其中有8种化合物具有单体和二聚体2种形式。因此共鉴定出36种化合物,包括10种酯类、9种醛类、7种酮类、6种醇类、2种萜类、1种杂环类和1种酸类。采用Gallery Plot插件生成相应指纹图谱,如图5所示。对照组和处理组共有的挥发性化合物主要有乙醇、乙酸异丙酯、丙酮、丁醛、乙酸乙酯、甲基乙基酮、2-甲基丁酸甲酯、乙醛、丙醛、庚醛、正丁醇、丙醇、1-戊烯-3-醇。醛类物质主要在脂肪氧化等过程产生,主要有果味、杏仁味及花香味,也有一部分呈鱼腥味,如乙醛;酯类在食品中的香味有着关键作用,主要呈令人愉快的果香及芳香味;部分酮类物质具有果香及花香味,少量醇类物质贡献植物香气和芳香气味。与对照组相比,3个处理组的酯类、醛类、醇类、酮类物质含量均有所增加。SAEW组明显增加的物质有乙酸异丁酯、2-庚酮、丙酮、异戊醛、异丁醛和丙醇,其中丙醇具有刺激性气味,而MW组的丙醇含量显著减少;同时和对照组相比,MW组和M-S组中的乙酸(刺激性酸味)和乙醛(刺激性醛味)都显著减少,说明MW处理可以降低产生不愉快气味物质的含量。M-S组相对于其他组增加的挥发性风味物质主要有2-戊酮、己醛、丁醛、戊醛、异戊酸异丁酯,其中醛类主要是由鱼肉中多不饱和脂肪酸在脂肪氧合酶的作用下形成的氢过氧化物裂解而成[27],M-S处理后醛类物质增加可能是SAEW和MW同时影响了脂肪氧合酶活性。
图5 不同减菌处理条件下轻腌大黄鱼挥发性化合物的指纹图谱
Fig.5 Fingerprint profile of volatile compounds in lightly salted large yellow croaker in different sterilization treatments
以定性的36个化合物为X变量,不同减菌处理组的轻腌大黄鱼为Y变量,建立OPLS-DA模型,模型对X和Y矩阵的解释率用
和
表示,模型的预测能力用Q2表示,R2和Q2越接近1.0,说明模型的拟合性越好。本次分析中的自变量拟合指数
为0.958,因变量拟合指数
为0.986,模型预测指数(Q2)为0.973,其中
表示该模型可以反映95.8%的数据,且两者都大于0.9说明该模型有较好的预测能力。根据OPLS-DA得分图(图6-a),3个处理组和对照组分别位于置信区间的左右两侧,并且具有比较明显的区分度。图6-b为经过200次置换检验,对OPLS-DA所做的模型进行验证,从图6-b可以看出,R2与纵轴相交(0,0.147),Q2与纵轴相交(0,-0.793),说明该模型没有过度拟合现象,具有较好的预测能力。
a-OPLS-DA得分图;b-OPLS-DA模型置换验证图;c-聚类热图
图6 不同减菌处理条件下轻腌大黄鱼挥发性化合物的OPLS-DA得分图、OPLS-DA模型置换验证图及聚类热图
Fig.6 Plot of OPLS-DA score, replacement verification of OPLS-DA models and clustering heat map of the volatile compounds of lightly salted large yellow croaker in different sterilization treatments
将模型中VIP>1的挥发性物质筛选为特征风味物质,共筛选出风味特征标志物共有18种,分别为乙酸异丙酯、庚醛、2-庚酮、乙醇、乙酸异丁酯、乙酸、α-蒎烯、异丁醛、丙酮、乙酸乙酯、甲基乙基酮、异丁醇、戊醛、正丁醇、己醛、异戊醛、丙醇、乙醛。为了更直观地观察到不同减菌方式挥发性风味物质的变化趋势,利用特征风味物质的峰体积进行聚类热图分析(图6-c)。可以将样品分为3类,对照组和MW组为一类,M-S组为一类,SAEW组为一类。不同减菌方式下样品中挥发性风味物质含量差异变化明显,除乙醇、庚醛、乙醛、乙酸外,减菌处理后各特征物质含量较对照组增加,表明减菌处理可提高轻腌大黄鱼中挥发性风味物质的含量,M-S组中各特征风味物质含量更为丰富。
3 结论与讨论
研究对比了MW、SAEW以及M-S处理对轻腌大黄鱼品质和风味的影响。结果表明,菌落总数和腐败菌数均显著低于对照组(P<0.05),其中M-S组的菌落总数和对照组相比降低了3.00 lg CFU/g,并且能使产H2S细菌和假单胞菌数低于1 lg CFU/g。此外减菌处理后质构的数值均有所下降,但显著降低了TVB-N值以及脂质氧化,M-S组能更有效地抑制鱼肉的脂质氧化,同时M-S处理组能有效地维持其原有b*值;在滋味方面,减菌处理后降低了苦味值的同时也提高了鲜味值。通过GC-IMS从所有样品中鉴定出46种挥发性化合物,减菌处理降低了丙醇等产生不愉快气味的物质含量。OPLS-DA并结合VIP>1筛选出乙酸异丙酯、庚醛等潜在标记物质。聚类分析表明,SAEW组和M-S组产生更多的挥发性成分,使产品的风味更丰富。综上所述,M-S处理对轻腌大黄鱼的减菌效果最好,并且可以延缓鱼肉品质下降。单一杀菌技术在水产品减菌实际应用中具有局限性,本试验为MW和SAEW 2种技术联合应用于水产品杀菌保鲜提供理论基础。
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