长期过量的饮酒会导致肝脏损伤,引起酒精性肝病(alcoholic liver disease,ALD),ALD是肝脏类疾病死亡的主要原因之一[1]。据报道,氧化应激和炎症反应在ALD的发展中发挥着重要作用,具有抗氧化或抗炎活性的化合物能够显著改善ALD[2]。如玉米胚芽粉白蛋白肽[3]、黑豆衍生肽[4]、豆粕肽[5]、薏苡仁蛋白水解物[6]、槲皮素多酚[7]、姜黄多酚[8]、山萘酚[9]、莲藕多酚[10]等。此外,在体内酒精代谢过程中会产生活性氧(reactive oxygen species,ROS),ROS会对蛋白质、脂质和核酸等生物大分子物质造成损伤,破坏其正常的结构和功能。ROS还可能引起脂质过氧化并促进肝脏氧化应激,促发细胞凋亡与炎症,最终导致肝损伤[11]。目前,ALD的治疗主要包括药物干预和手术治疗。然而,化学药物的长期摄入可能会增加消化系统和肝脏的负担,且手术治疗一般仅用于重症肝病患者[12]。因此,开发天然产物或者食品衍生化合物作为功能性食品或营养保健品以预防ALD的研究迫在眉睫。

青稞酒糟(highland barley distiller’s grains,HBDG)是青稞酒生产过程中产生的一种有价值的副产品,含有丰富的蛋白质、黄酮类物质、纤维素以及脂肪[13]等。蛋白及其水解物作为HBDG主要成分之一,表现出多种生物学功能。例如碱溶酸沉加碱性蛋白酶酶解制备的HBDG多肽,在质量浓度为10 mg/mL时,对乙醇脱氢酶的激活程度最高,具有良好的醒酒效果。当HBDG多肽质量浓度为21 μg/L时,对DPPH自由基、羟自由基和超氧阴离子自由基的清除率较高,具有良好的抗氧化活性[14]。研究表明,膳食多酚可作为自由基清除剂或金属螯合剂,中断脂质自氧化链反应的传播阶段[15]。因此,多酚作为膳食补充剂可以缓解急性或慢性饮酒引起的氧化应激,改善脂质积累[16]。除此之外,WANG等[17]提取的多酚化合物通过抑制核因子-κB的活化来改善炎症,达到缓解酒精肝损伤的目的。相关体外研究发现,HBDG活性提取物能够有效清除DPPH自由基和ABTS阳离子自由基,表明其具有一定的抗氧化作用,在一定程度上能够改善氧化应激[18]。因此,HBDG活性提取物可能具有一定的解酒活性。然而,目前鲜有研究探讨HBDG多肽和HBDG多酚对酒精性肝损伤(alcoholic liver injury,ALI)小鼠的保护作用。在此基础上,本文通过行为学测试、生化指标检测和非靶向代谢组学分析评估HBDG多肽和HBDG多酚对酒精诱导的ALI小鼠的保肝作用,以期为HBDG活性提取物预防ALI提供理论依据,为HBDG的进一步开发利用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料和仪器

52 ℃白酒、HBDG粉(过80目筛),天佑德青稞酒股份有限公司(中国青海);碱性蛋白酶(200 U/mg),索莱宝科技有限公司(中国北京);超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)测试盒、乙醛脱氢酶(acetaldehyde dehydrogenase,ALDH)测试盒、甘油三酯(triglyceride,TG)测试盒、谷草转氨酶(aspartate aminotransferase,AST)测试盒、还原型谷胱甘肽(glutathione,GSH)测试盒、丙二醛(malondialdehyde,MDA)试剂盒,塞维尔生物科技有限公司(中国武汉);0.22 μm聚四氟乙烯滤膜,津腾实验设备有限公司(中国天津);15只雄性SPF级C57BL/6J小鼠购自中国农业科学院兰州兽医研究所实验动物中心[许可证号:SCXK(甘)2020-0002]实验方案经青海大学动物伦理委员会的批准(批准号SL-2021019)。

XU-10N-60A/B真空冷冻干燥机,上海析牛莱伯仪器有限公司;J-15/15R系列高速离心机,贝克曼库尔特国际贸易(上海)有限公司;DF-101S磁力搅拌器,上海鹰迪仪器设备有限公司;SHB-IIG型台式循环水式多用真空泵,郑州长城科工贸有限公司;KZ-III-F高速组织研磨仪,武汉赛维尔生物科技有限公司;5305真空浓缩仪,德国Eppendorf公司;BE-2600混匀仪,海门市其林贝尔仪器制造有限公司;Vanquish液相色谱仪、Q Exactive Focus质谱仪,美国Thermo公司。

1.2 实验方法

1.2.1 HBDG多肽粗提物的制备

利用碱溶酸沉法[14]提取HBDG中的蛋白,取适量HBDG粉于醇(95%乙醇)碱(0.5 mol/L NaOH)混合液(1∶2,体积比)中,固液比1∶40(g∶mL),磁力搅拌390 min后离心取上清液。调节上清液pH=4.7,静置2 h后取沉淀,水洗使蛋白pH为中性后冷冻干燥,得到粗蛋白粉末。将HBDG蛋白溶于蒸馏水中(1∶30,g∶mL),调节pH为10,加入碱性蛋白酶(1∶25,g∶mL),水解240 min,放置90 ℃水浴锅中15 min,离心15 min(4 000 r/min,4 ℃),取上清液,冻干备用。

1.2.2 HBDG多酚粗提物制备

称取HBDG粉少许,将其添加到体积分数60%的乙醇水溶液中,料液比为1∶30(g∶mL),在55 ℃下超声波萃取50 min[19]。所得溶液使用循环水式多用真空泵对其进行抽滤,通过60 ℃旋转蒸发浓缩,使溶液体积减少1/3,所得溶液冻干备用。

1.2.3 实验动物分组与给药

15只雄性SPF级C57BL/6J小鼠(25～30 g,中国农业科学院兰州兽医研究所实验动物中心),适应性喂养1周后[温度保持在(22±1) ℃,湿度(50±5)%,并接受12 h的光/暗循环],将15只SPF小鼠随机分为5组(n=3),空白对照组(Control)、模型组(M)、海王金樽阳性组(Y,187.5 mg/mL)、HBDG多肽组(DT,100 mg/mL)、HBDG多酚组(DF,100 mg/mL)。各给药组小鼠根据体重按(10 mL/kg bw)灌胃受试药物,Control、M组灌胃超纯水,除Control组外的其他组小鼠在灌胃给药30 min后给予10 mL/kg bw白酒(52°天佑德白酒),Control给予等剂量的超纯水,连续14 d,期间观察小鼠的活动状态。参考赵婷婷等[20]的造模方法并稍加修改,建立小鼠ALI模型。

1.2.4 小鼠行为学测定

以小鼠“翻正反射”消失与恢复判断小鼠醉酒与醒酒状态。小鼠灌酒后,背向下放在笼上,若背向下的姿势连续30 s以上则认为翻正反射消失,即为醉酒,否则为醒酒。记录各组小鼠醉酒时间(灌完酒到翻正反射消失时间)、醒酒时间(翻正反射消失到恢复翻正反射时间)。

1.2.5 小鼠血清及肝组织采集和制备

在末次灌胃后禁食不禁水12 h,麻醉后摘眼球取血,在室温下静置1～2 h后[21],将血清在低温离心机中以3 000 r/min分离15 min,并将血清样品冷冻于-80 ℃。取肝组织后用生理盐水漂洗肝脏表面血渍,擦干称质量,以备后用。

1.2.6 组织病理学分析

将肝脏组织固定在4%(体积分数)多聚甲醛,经脱水、包埋、切片和苏木素-伊红(Hematoxylin-eosin,HE)染色处理,光学显微镜下观察肝组织的组织病理学变化。

1.2.7 生化参数的测定

使用塞维尔生物科技有限公司(中国武汉)提供的试剂盒测量血清AST和TG水平以及肝脏组织ALDH、SOD活力、MDA含量和GSH含量。

1.2.8 肝脏的非靶向代谢组学分析

参考WANT等[22]的方法,在离心管中放入样品,组织提取液为体积分数75%的甲醇氯仿(甲醇∶氯仿=9∶1,体积比)混合水溶液,加入后于50 Hz研磨60 s,重复2次。超声波处理30 min后将其放置冰上30 min,4℃、12 000 r/min低温离心10 min取上清液,冷冻干燥。取200 μL 体积分数50%的乙腈配置2-氯-L-苯丙氨酸(4 mg/L),将样品溶解于配置好的溶液中。过滤液加入到检测瓶中,用于LC-MS检测。

色谱条件:使用ACQUITY UPLC® HSS T3(2.1×100 mm, 1.8 μm)色谱柱,流速0.3 mL/min,柱温40 ℃,进样量2 μL。流动相为0.1%甲酸乙腈(B2)和0.1%甲酸水(A2),以0～1 min,8%B2;1～8 min,8%～98%B2;8～10 min,98%B2;10～10.1 min,98%～8%B2;10.1～12 min,8%B2为正离子模式下梯度洗脱程序。流动相为乙腈(B3)和5 mmol/L甲酸铵水(A3),0～1 min,8%B3;1～8 min,8%～98%B3;8～10 min,98%B3;10～10.1 min,98%～8%B3;10.1～12 min,8%B3为负离子模式下梯度洗脱程序。质谱参数:电喷雾离子源(electrospray ionization,ESI),正负离子模式(ESI+、ESI-)分别采集数据。正、负离子喷雾电压分别为3.50 kV和-2.50 kV,鞘气40 Arb,辅助气10 Arb。毛细管温度325 ℃,分辨率70 000进行一级全扫描,一级离子扫描范围 100～1 000 m/z,并采用HCD进行二级裂解,碰撞能量30 eV,二级分辨率17 500。采用R XCMS软件包进行峰检测、峰过滤、峰对齐处理[23],参数设置有bw=2,ppm=15,peakwidth=c(5,30),mzwid=0.015,mzdiff=0.01,method=“centWave”,得到物质定量列表。代谢产物的多元统计分析、差异代谢产物分析及生物信息分析参照常规代谢组学数据分析方法[24]。

1.3 数据处理

利用SPSS 22.0分析数据,数据结果均表示为“平均值±标准差”。采用单因素方差分析进行统计分析,P<0.05认为显著。不同的字母表示不同组间显著差异。设定阈值变量投影重要性(variable importance in projection, VIP)>1.0且P<0.05,筛选出差异代谢物。

2 结果与分析

2.1 行为学测定

评价醉酒状态常见方法之一是翻正反射,观察记录醉酒小鼠的翻正反射恢复时间和翻正反射消失时间。研究表明,解酒口服液可以通过延长小鼠的醉酒时间,缩短醒酒时间的方法验证解酒效果[25]。由表1可知,M组小鼠摄入酒精后(24±1.53) min内翻正消失且醉酒率为100%。与Y组相比,DT组和DF组翻正消失时长较短,但是与M组相比,摄入HBDG多肽显著减少翻正恢复时长,从(190±12.34) min降低到(150±20.31) min(P<0.05)。除此之外,摄入HBDG多酚可显著增加小鼠的翻正消失时长,从(24±1.53) min提高到(35±2.52) min(P<0.05),并减少翻正恢复时长,从(190±12.34) min降低到(159±15.89) min。结果表明,HBDG活性提取物具有一定的醒酒效果。

2.2 肝脏组织的病理变化分析

各组小鼠肝组织病理切片如图1所示,M组中肝细胞与Control组相比胞质疏松淡染,出现点状的肝细胞坏死现象(黑色箭头),核溶解,伴有点状的淋巴细胞与粒细胞浸润(红色箭头);DF组中有炎性细胞浸润现象,但是相比较M组肝索排列较整齐,说明HBDG在一定程度上可以改善ALI小鼠酒精肝损伤,但是效果不显著。与M相比,DT组的肝细胞排列相对整齐,炎性细胞浸润和脂肪空泡化等情况均有显著改善;这表明HBDG多肽可以改善由于饮酒造成的肝损伤。

2.3 血清及肝脏组织的生化指标分析

AST和TG是最常见的肝损伤标志物,当过量饮酒引起肝细胞损伤时细胞膜的通透性增加,使得血清AST和TG水平升高[26]。如图2-a、图2-b所示,M组中的AST含量和TG含量与Control组相比均显著上升(P<0.05),这与漆正方等[27]的结果趋势一致,表示造模成功。相反,与M组相比,HBDG多肽和HBDG多酚处理组小鼠AST和TG含量显著降低(P<0.05)。其中DT组中AST、TG含量分别降低了30.83%、44.35%。DF组中AST、TG含量分别降低了29.08%、33.87%。本次实验研究与冯杨梦晓等[28]的结果趋势一致,说明HBDG多肽和HBDG多酚可以改善肝细胞损伤。

肝脏酶含量变化如图2-c～图2-f所示,与Control组相比,M组中SOD活力显著下降(P<0.05),表明ALI小鼠肝脏中的氧化应激水平显著升高,进一步证明了模型建立成功。相反,与模型组相比,多肽组和多酚组中SOD活力和GSH含量显著上升,表明HBDG多肽和HBDG多酚处理都能够显著提高机体的抗氧化能力(P<0.05)。ALDH氧化系统是肝脏中主要的酒精代谢途径,超过90%的饮酒通过乙醇脱氢酶和ALDH介导的氧化途径代谢。在这种主要的氧化途径中,乙醇首先被乙醇脱氢酶氧化成醛,然后是ALDH介导的醛代谢为乙酸盐[29]。与Control组相比,M组中肝脏ALDH活力的显著升高(P<0.05),是小鼠摄入酒精后对酒精刺激的适应性反应。而HBDG多肽和HBDG多酚处理组的ALDH活性升高程度显著高于模型组(P<0.01)。主要原因是HBDG提取物处理后ALI小鼠ALDH活力进一步增强。说明HBDG多肽和HBDG多酚处理使ALI小鼠酒精代谢能力增强,从而达到缓解肝损伤的目的,且DT组对ALDH活性的提高显著高于DF组(P<0.05)。与此同时,MDA含量与肝脏细胞膜的脂质过氧化程度密切相关,是反映机体潜在抗氧化能力的重要参数[1]。M组中肝脏MDA含量相比Control组显著上升(P<0.05),说明摄入酒精使M组的脂质过氧化程度加重。DT组和DF组中肝脏MDA含量相比M组显著下降(P<0.05),意味着HBDG多肽和HBDG多酚有很强的抗氧化能力,能够有效清除肝脏中的ROS,减少氧化应激,维持因酒精暴露而破坏的氧化还原平衡,改善脂质过氧化现象。

2.4 小鼠肝脏非靶代谢组学分析

肝脏是体内生物合成和生物转化的关键器官[30],为了研究HBDG多肽和HBDG多酚对ALI小鼠肝脏代谢产物的影响,使用非靶向代谢组学分析小鼠肝脏的代谢产物。基于ESI+或ESI-模式下的PLS-DA评分图结果发现(图3),不同组别样本明显分离且距离较远,说明不同分组肝脏代谢存在显著差异。M组与Control组肝脏代谢物存在明显分离,表明过量饮酒明显影响肝脏代谢。M组与DT组和DF组之间存在明显的分离,表明M与DT组和DF组肝脏代谢差异较大。

2.4.1 HBDG多肽对ALI小鼠肝脏代谢组学分析

脂质代谢功能障碍和脂肪积累是ALI的初期的典型症状[31]。为了研究HBDG肽干预对ALD小鼠肝脏代谢的影响,通过比较DT处理组和M组之间的肝脏差异代谢产物,在正离子和负离子模式下,成功鉴定了20种潜在的差异代谢物(表2)(VIP>1,P<0.05),其中18种肝脏代谢产物(包括前列腺素F2α、石胆酸、S-乳酰谷胱甘肽和二十二碳五烯酸等)在DT干预下显著上调,2种代谢物[包括(R)-(-)-3-羟基丁酸和α-酮异戊酸]显著下调(图4-a)。据报道,二十二碳五烯酸是一种长链的n-3多不饱和脂肪酸具有抗血小板聚集、抗炎和改善血脂增生的作用[32]。

为了全面了解DT干预诱导的肝脏代谢组变化,进行了基于KEGG分析的代谢途径富集(图4-b)。在HBDG肽干预下筛选到的关键代谢途径有花生四烯酸代谢、卵巢类固醇生成和丙酮酸代谢。推测HBDG肽改善小鼠酒精肝损伤的代谢途径可能是通过干预花生四烯酸代谢途径上调前列腺素F2α等(表3)。研究表明,前列腺素F2α参与花生四烯酸的代谢,具有调节宿主免疫应答、调节血管张力、降低肾脏炎症[33]的作用。而在HBDG多肽的干预下前列腺素F2α上调,使得机体在降低肾脏炎症方面的作用增强。

此外,还确定了代谢物和富集的KEGG途径之间的相关性网络(图4-c)。花生四烯酸代谢、神经配体-受体相互作用信号通路和丙酮酸代谢途径通过共享代谢产物连接。

2.4.2 HBDG多酚对ALI小鼠肝脏代谢组学分析

模型组和多酚组小鼠肝脏代谢物水平如表4(VIP>1,P<0.05),鉴定出了25种潜在的差异代谢物,其中23种肝脏代谢产物(磷酸吡哆醛、脱硫生物素、芥酸、七叶苷、芒柄花素和硫胺素等)在DF处理下显著上调,2种肝脏代谢物(己二酸半醛和α-酮异戊酸)显著下调(图5)。

对DF处理下的KEGG的代谢途径富集分析可知(图5-b),HBDG多酚干预改变了亚油酸代谢、生物素代谢、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸降解以及维生素的消化和吸收等代谢途径。检测到与亚油酸代谢相关的代谢产物有13-OxoODE和8(R)-Hydroperoxylinoleic acid(表5)。相对于模型组,在HBDG多酚组中13-OxoODE和8(R)-Hydroperoxylinoleic acid上调,说明HBDG多酚治疗可能通过影响脂质代谢相关的途径来改善ALI,与YUN等[34]研究一致。除此之外,硫胺素参与硫胺素代谢通路(表5),而硫胺素的硫醇形式能够与ROS相互作用[35],这表明HBDG多酚干预提高了机体的抗氧化能力,减轻了肝脏氧化应激。总的来说,这些结果证实了HBDG多酚对可以通过影响脂质代谢和氧化应激来缓解ALI。代谢物和富集的KEGG途径之间的相关性网络见图5-c。硫胺素代谢和维生素的消化和吸收途径通过共享代谢产物连接。共有两种代谢产物富集在生物素代谢过程中,分别是8-氨基-7-氧代壬酸酯和脱硫生物素。

3 结论

综上所述,本研究初步表明,HBDG肽和HBDG多酚可以通过加速酒精代谢、提高抗氧化能力有效改善ALI现象。除此之外,通过肝脏代谢组学探索了HBDG活性提取物干预ALI过程中可能的保护机制,发现HBDG提取物可以通过调节代谢产物缓解ALI。但是,研究还存在一定的局限性,尽管通过实验证明HBDG提取物对酒精引起的肝损伤具有保护作用,但它是一种复杂的混合物,其功能成分仍需进一步确认,还需要进一步的研究来验证HBDG活性提取物对肝脏保护的确切机制。

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Protective effect of active extract of highland barley distiller’s grains on alcoholic liver injury in mice

FENG Xiaohuan1, LUO Yihao1*, FENG Shengbao2, SUN Wancheng1, LI Shanwen2

1(College of Agriculture and Animal Husbandry, Qinghai University, Xining 810016, China)2(Qinghai Huzhu Tianyoude Barley Wine Co.Ltd., Haidong 810700, China)

ABSTRACT To investigate the effects of different highland barley distiller’s grains (HBDG) active extracts on mice with alcoholic liver injury (ALI), HBDG polypeptides and HBDG polyphenols were extracted from HBDG powder, and ALI C57BL/6 J mice model was established through continuous astringent administration of 52° Tianyoude liquor for 14 days.The time of disappearance and recovery of intoxicated mice were observed and recorded;the morphopathological changes of liver were monitored by HE staining;serum and liver biochemical indices were measured by assay kit;and changes in liver metabolites were detected based on non-target metabolomics.Results showed that HBDG peptide and HBDG polyphenols intervention significantly reduced wake-up time (P<0.05) and improved inflammatory cell infiltration and lipid vacuolization caused by prolonged drinking.Compared with the control group, serum aspartate aminotransferase (AST) and triglyceride (TG) were significantly reduced (30.83%,44.35%) (P<0.05), while hepatic acetaldehyde dehydrogenase (ALDH) and superoxide dismutase (SOD) were remarkably increased (56.23%,49.96%) (P<0.05) in the HBDG peptide group.At this time, AST and TG of HBDG polyphenol experimental group were remarkably decreased (29.08%,33.87%) (P<0.05), and hepatic ALDH and SOD increased (12.80%,11.21%).In addition, ALDH and SOD levels were significantly improved (29.08%,33.87%) (P<0.05) in the experimental group compared with the HBDG polyphenol.Subsequently, the capacity of HBDG peptides to degrade alcohol and act as antioxidants surpassed that of HBDG polyphenols, showing a notable disparity (P<0.05).Analysis of liver metabolomics revealed that HBDG polypeptides could improve alcohol-induced liver damage by interfering with the arachidonic acid metabolic pathway to up-regulate the content of hepatic metabolites like prostaglandin F2α.Additionally, HBDG polyphenol might ameliorate alcohol-related liver by interfering with the linoleic acid metabolic to up-regulate 13-OxoODE and 8(R)-Hydroperoxylinoleic acid and impact thiamine metabolism to increase thiamine content, thereby alleviating alcohol-related liver harm.In summary, the use of HBDG peptides and HBDG polyphenols proved beneficial in enhancing ALI through the hastening of alcohol metabolism, bolstering antioxidant abilities, and controlling liver metabolic routes, with HBDG peptides outperforming HBDG polyphenols.The results can provide a theoretical basis for the study of new anti-alcohol and liver protection products.

Key words highland barley distiller’s grains;polypeptide;polyphenol;alcoholic liver injury;hepatoprotective effect

DOI：10.13995/j.cnki.11-1802/ts.040771

引用格式：冯晓焕,罗毅皓,冯声宝,等.青稞酒糟活性提取物对酒精性肝损伤小鼠的保护作用[J].食品与发酵工业,2025,51(13):92-100.FENG Xiaohuan, LUO Yihao, FENG Shengbao, et al.Protective effect of active extract of highland barley distiller’s grains on alcoholic liver injury in mice[J].Food and Fermentation Industries,2025,51(13):92-100.

第一作者：硕士研究生(罗毅皓副教授为通信作者,E-mail:291649347@qq.com)

收稿日期：2024-08-16,改回日期:2024-09-11