硝酸盐氮
乙醇、有机酸等[3]。未经处理的酿酒污水如果直接排放将会导致水体富营养化、土质破坏等[4],破坏水生动植物、陆生动植物以及人类的生存环境,危害人体健康。因此,在排放之前,需要进行处理。BAI Song,YANG Ying,HE Jing, et al.Regulation of dissolved oxygen for brewing wastewater reuse and its microbial mechanisms[J].Food and Fermentation Industries,2025,51(14):210-217.
酒是世界上最普及的饮品之一[1]。我国酿酒行业历史悠久、年产量巨大。然而,酿酒是一个高度耗水的过程,例如每生产1 L啤酒就需要消耗3 L水[1]。在酿酒过程中,一部分用水被用于产酒,而另一部分则作为污水排放,包括设备清洗水、制冷水以及窖底水等[2]。这些酿酒污水含有多种污染物,包括氨氮硝酸盐氮乙醇、有机酸等[3]。未经处理的酿酒污水如果直接排放将会导致水体富营养化、土质破坏等[4],破坏水生动植物、陆生动植物以及人类的生存环境,危害人体健康。因此,在排放之前,需要进行处理。
然而,酿酒污水中富含高浓度有机物是潜在的资源,具有再利用的潜力。另一方面,生活污水中有机物浓度低,导致其在处理过程中异养微生物活性低,氮素去除率低[5]。外加碳源可以有效解决该问题,但是增加了额外的成本[6]。直接使用酿酒污水作为碳源[7],可以为生活污水提供充足电子供体,有利于强化脱氮;该方法也可以减少酿酒污水排放量,实现以废治废;相比于商业碳源,使用酿酒污水碳源可降低购买成本。溶解氧(dissolved oxygen,DO)是影响污水脱氮的关键因素之一[8]。DO过高会导致部分碳源被无效氧化,过低则会降低微生物活性。首先,需要研究酿酒污水用作碳源时对污水脱氮效果的影响;此外,DO对微生物群落组成、基因富集丰度的影响机制需要探明;更重要的是,需要设计酿酒污水再利用技术的应用模式。
基于此,本文使用酿酒污水作为碳源,将其用于低碳生活污水处理,强化异养脱氮过程,分析不同DO条件下污水处理效果;揭示微生物群落以及氮代谢基因对DO的响应;设计酿酒污水强化策略应用模式。
如图1所示,污水处理反应器采用移动床生物膜反应器(moving-bed biofilm reactor,MBBR),由有机玻璃制成。MBBR总共分为内外2层,内层为微生物脱氮层,外层为水浴恒温加热层。反应层有效体积为0.9 L。为确保微生物稳定富集,采用多孔隙聚氨酯作为载体,填充率约为25%。有机玻璃,北京景天伟艺装饰工程有限公司;聚氨酯,威县康沃新材料科技有限公司。
图1 污水处理反应器示意图
Fig.1 Schematic diagram of wastewater treatment reactor
LWP曝气泵,江苏兰环科技工程有限公司;EX-GB电子天平,上海仪展衡器有限公司;YY40A蠕动泵,上海翊源泵业有限公司;LJ-UV90紫外可见分光光度计,山东蓝景电子科技有限公司。
酿酒污水为泸州市某酿酒厂实际酿酒污水,污水浓度为总氮(total nitrogen, TN)908.7 
540.5 mg/L、化学需氧量(chemical oxygen demand,COD)67 425.5 
342.2 mg/L、TP 180.5 mg/L,pH值约为6.0;生活污水为模拟污水,根据文献采用自来水配制浓度[9],添加NH4Cl、NaNO3、C6H12O6,使浓度达到TN 16.5 
3.5 mg/L,pH值约为7.3。由于酿酒污水氮素浓度高,为确保有效补充碳源的同时不超过污水处理反应器耐受阈值,实验中将酿酒污水与生活污水按照1∶380(体积比)混合。混合后的污水按照5 mL/L比例添加微量元素,微量元素由50 mg/L FeCl3·6H2O, 30 mg/L H3BO4, 25 mg/L ZnSO4·7H2O, 25 mg/L MnCl2·7H2O, 6 mg/L CuSO4·5H2O, 15 mg/L NaMoO4, 10 mg/L NiCl2, 45 mg/L CoCl2·6H2O, 60 mg/L KI配制[10]。实验试剂均为分析纯,购自成都市科隆化学品有限公司。
1.3.1 实验方法
采用聚氨酯作为载体,接种污水处理厂二沉池的污泥进行接种挂膜,污泥质量浓度约为5.9 g/L。实验期间,温度条件为28 ℃,水力停留时间为12 h。采用曝气泵控制DO,初始DO为5 mg/L,然后依次逐渐降低至4、3、2 mg/L。实验期间,每天取出水水样,测定其中NH4+-N、NO 3-N、TN、COD浓度变化,分析各阶段污水处理性能。各个阶段结束后,分别取混合生物膜,放置于-80℃低温保藏,用于高通量测序分析。
1.3.2 水质分析方法
水样测试前经0.45 μm滤膜过滤,测定步骤参考《水和废水监测分析方法》(第四版)[11]:TN浓度采用碱性过硫酸钾分光光度法测定
浓度使用纳氏试剂分光光度法测定、COD通过重铬酸钾快速测定法测定
采用酚二磺酸光度法测定。
1.3.3 微生物测序及分析方法
对不同DO阶段的生物膜样本提取DNA,提取试剂盒为北京天根生化科技有限公司的Mobio PowerOil DNA提取试剂盒。通过该试剂盒提取DNA后进行16S rRNA高通量测序。采用16S rRNA基因V3+V4区域的引物对338F(ACTCCTACGGGAGGCAGCAG)和806R(GGACTACHVGGGTWTCTAAT)进行PCR扩增。PCR反应体积为20 μL,包含4 μL的5×FastPfu缓冲液、2 μL的2.5 μmol/L脱氧核糖核苷三磷酸、2份0.8 μL的正/反向引物(5 μmol/L)、0.2 μL的牛血清白蛋白、0.4 μL的 Fast Pfu DNA聚合酶和10 ng的模板DNA。采用ABIGenaAmp®9700系统(Applied Biosystems,美国)进行PCR扩增:初始温度设置95 ℃,变性3 min,进行27个循环,每个循环包括95 ℃下变性30 s、55 ℃下退火30 s和72 ℃下延伸45 s。最后,在72 ℃下进行10 min的最终延伸,然后冷却至10 ℃完成反应。PCR扩增反应完成后将产物进行纯化,在TBS-380(Turner Biosystems,美国)上测定V3+V4区域PCR产物数量,然后进行测序。测序完成后,采用Trimomatic和FLASH软件处理测序数据,保留长度小于50个碱基的序列以及尾部质量值低于20的碱基,再将相似性阈值为97%的序列归为一类为操作分类单元(operational taxonomic unit,OTU)。使用usearch_global分析OTU丰度。采用KEGG数据库对所得测序数据进行预测注释,获得功能基因及丰度数据。
水质数据图由OriginPro 2021绘制。微生物数据图由美吉平台(https://cloud.majorbio.com/)绘制。
将酿酒污水与生活污水混合后,进水中
浓度分别为18.84、13.79、297.05、4.39 mg/L。图2为不同DO条件下的污染物出水浓度与去除率情况,为分析混合污水处理效果,采用GB 18918—2002《城镇污水处理厂污染物排放标准》一级A标(TN 15 
5 mg/L、COD 50 mg/L)作为依据[12]。如图2-a所示,在DO 5 mg/L条件下,初始出水存在波动,稳定后的
浓度为0 mg/L,实现全部去除。如图2-b和图2-c所示,稳定后的
质量浓度约为3.16 mg/L,去除率仅为77.08%, TN出水质量浓度3.44 mg/L。高DO有助于富集异养微生物[13],加速有机物消耗,稳定后的COD质量浓度为16.46 mg/L。WANG等[14]考察DO浓度对有机物污水处理效果的影响,表明DO驱动碳源代谢功能富集也将促进有机物去除。因此,此条件下的污水处理效果满足排放标准。DO 4 mg/L条件下,
出水质量浓度保持稳定,实现了100%的去除率。DO浓度降低后构建了更适合反硝化的环境,
出水质量浓度降低到2.48 mg/L、去除率提高到82.01%。TN出水质量浓度随之降低至2.76 mg/L。但是DO浓度降低,使得COD质量浓度上升到27.82 mg/L。这主要是因为高DO条件下会导致部分碳源无效氧化[15],DO浓度降低会导致上一阶段被氧化碳源被保留,从而提高出水COD浓度。此外,异养菌属也会消耗有机物[16],其丰度降低可能也是出水有机物浓度升高原因之一。DO 3 mg/L条件下,出水浓度出现波动,去除率降低至77.67%,但是TN出水质量浓度并未受到较大影响,仅为2.92 mg/L,去除率达到84.50%。COD浓度变化趋势则相反,上升到39.08 mg/L,去除率降低至86.86%,说明此时虽然可以满足排放标准,但是需要控制出水有机物浓度以避免达到阈值。当降低至DO 2 mg/L时,虽然TN出水质量浓度增加至2.82 mg/L,低于阈值15 mg/L。然而此时COD质量浓度为53.2 mg/L,超过排放阈值。
图2 不同DO条件下污水处理效果
Fig.2 Wastewater treatment efficiency under different DO conditions
因此,通过调节DO浓度可以发现,3～5 mg/L条件下可以满足GB 18918—2002《城镇污水处理厂污染物排放标准》一级A标排放标准,但是DO 2 mg/L时,由于出水COD浓度高,无法达标。由于维持高DO浓度需要持续高强度曝气,相比与DO 4～5 mg/L,DO 3 mg/L是更具经济效益的参数。对于应用前景,如表1所示,酿酒污水碳源与合成碳源聚己内酯相比,可省却高昂购置成本;与低成本碳源葡萄糖、乙酸钠相比,脱氮效果更加稳定、成本更低;与天然碳源丝瓜络、玉米芯相比,脱氮潜力优势显著。
表1 代表性碳源强化生活污水脱氮效果
Table 1 Enhanced nitrogen removal from domestic wastewater through representative carbon source addition
碳源类型氮素质量浓度/(mg/L)氮素去除率/%碳源应用特点聚己内酯[17]22～30.096脱氮效果高,成本高葡萄糖[18]2086.9脱氮效果较高,成本相对较低乙酸钠[19]1372.36脱氮效果较高,成本相对较低丝瓜络[20]24.2～31.269.8成本低,但使用后产生污泥玉米芯[21]21.5～29.681成本低,但使用后产生污泥
为考察微生物群落对DO浓度变化的影响,在属水平上进行样本间差异性分析。如图3-a所示,聚类分析中低浓度样本DO 2 mg/L与其他3个DO浓度样本存在差异,表明该样本菌群受到DO影响较大,菌群结构已发生显著变化。此外,图3-b的主成分分析(principal component analysis,PCA)显示,DO 4～5 mg/L条件下的样本可以归为一类,而DO 2 mg/L与其他样本存在较大的差异,这与聚类分析结果一致。此外,分析了不同样本中的微生物群落数量差异(图3-c)。DO 5、4、3、2 mg/L的菌属数量分别为369、407、301、257,说明厌氧条件下的微生物群落多样性更低。
a-聚类分析;b-PCA;c-Venn图
图3 不同DO条件下微生物群落的差异分析
Fig.3 Analysis of differences in microbial communities under different DO conditions
这主要是因为环境选择压力,选择了厌氧菌属特异性富集,成为高丰度优势菌属,对整体微生物群落进行驱动重塑[22]。但是具体的功能微生物需要进一步鉴定。LIANG等[23]发现,通过增加DO浓度,微生物群落多样性更丰富,促进了氮素去除。因此,DO浓度变化会降低菌属数量,从而造成差异,并且在DO 2 mg/L差异性最为显著。
进一步剖析不同DO条件下的菌属组成结构,鉴定关键功能菌属。如图4-a所示,DO 5 mg/L条件下的优势菌属为球衣菌属(Sphaerotilus)(12.39%)、脱硫叶菌属(Desulfobulbus)(7.91%)、互营单胞菌属(Syntrophomonas)(7.35%)、脱氯单胞菌属(Dechloromonas)(5.93%)、氢嗜菌属(Hydrogenophaga)(3.12%)、未分类的慢生微菌科(norank_Lentimicrobiaceae)(2.63%)、亮杆菌属(Leucobacter)(2.59%)、绿硫菌属(Chlorobium)(2.58%)。其中,Sphaerotilus被报道为严格好氧异养脱氮菌属[24-25],是主要的有机物去除菌属。Desulfobulbus[26]、Dechloromonas[27]、Hydrogenophaga[28]被报道为脱氮菌属。互营菌属Syntrophomonas具有构建协同代谢群体的功能[29],其富集表明这些菌属协同促进氮素去除。DO 4 mg/L条件下,主要优势菌属为Hydrogenophaga(10.27%)、Dechloromonas(9.45%)、未分类的丛毛单胞菌科(unclassified_Comamonadaceae)(6.30%)、Sphaerotilus(5.66%)、Desulfobulbus(4.43%)、Acidovorax(3.61%)、Leucobacter(2.73%)。此时,Hydrogenophaga取代Sphaerotilus成为主要脱氮菌属,在Dechloromonas与unclassified_Comamonadaceae[30]协同作用下去除氮素。有机物降解主要依赖于Sphaerotilus、unclassified_Comamonadaceae,但是丰度的降低也导致了出水有机物浓度的增加。DO 3 mg/L条件下,主要优势菌属为动胶菌属(Zoogloea)(12.62%)、Hydrogenophaga(10.20%)、unclassified_Comamonadaceae(6.18%)、食酸菌属(Acidovorax)(4.66%)、Desulfobulbus(2.80%)、甲基营养菌属(Methyloversatilis)(2.27%)、蛭弧菌属(Bdellovibrio)(2.12%)、Chlorobium(2.03%)。Zoogloea被报道为可以分泌胞外聚合物构建厌氧-好氧菌胶团[31],因而在DO进一步降低的条件下占据主导地位,成为主要的脱氮菌属。此时异养菌属Methyloversatilis实现富集[32],但是丰度降低导致COD出水浓度进一步增加。DO 2 mg/L条件下,主要优势菌属为Zoogloea(11.67%)、norank_Lentimicrobiaceae(5.87%)、Dechlorobacter(4.56%)、Acidovorax(4.41%)、Dechloromonas(3.92%)、Thauera(2.66%)。Zoogloea菌属依旧发挥主要脱氮作用,而有机物去除主要由norank_Lentimicrobiaceae实现[33]。可见,虽然厌氧菌属随之富集,但是污染物去除性能也随之降低。进一步通过共线性网络揭示了不同样本中的公共菌属(图4-b)。Acidovorax是4种DO条件下稳定富集的菌属,适应性较广泛;DO 2～3 mg/L条件下的特异性富集的菌属是Zoogloea,更适合缺氧环境;DO 3～5 mg/L条件下的特异性富集的菌属是Hydrogenophaga、unclassified_Comamonadaceae、Bdellovibrio、Desulfobulbus,更适合好氧环境。
a-菌属组成;b-菌属共线性网络
图4 不同DO条件下微生物群落结构分析
Fig.4 Analysis of microbial community structure under different DO conditions
总之,Sphaerotilus、Hydrogenophaga、Zoogloea为主要污染物去除菌属。DO可以通过驱动共生富集的好氧菌属协同削减,从而显著改变微生物群落结构。此外,建议根据菌属适应范围选择DO参数以促进特定菌属富集,这有助于提高反应器特定处理性能。
进一步揭示不同DO条件下的基因富集丰度,确定基因响应特征。针对氮素去除,本文主要考察了涉及氮代谢途径的关键基因。如图5-a所示,基于文献报道,将好氧硝化、异养反硝化、固氮过程的关键基因分别标记[34-35]。如图5-b所示,对于硝化基因,编码氨单加氧酶的amoA、amoB、amoC以及编码羟胺脱氢酶的hao在DO 5、4、3、2 mg/L条件下的总丰度分别为0.003‰、0.002‰、0.002‰、0.001‰。随着DO浓度降低,硝化基因丰度持续降低,这与硝化性能一致。这主要是因为好氧脱氮菌属丰度持续降低,被厌氧菌属取代。其中,amoA、amoB、amoC基因丰度变化与DO浓度趋势一致,说明受到的影响显著,是主导去除的关键基因。
a-氮循环途径及对应关键基因;b-不同DO条件下氮代谢基因富集丰度
图5 不同DO条件下的基因富集特征
Fig.5 Gene enrichment characteristics under different DO conditions
对于反硝化基因,编码亚硝酸还原酶的nirK和nirS、编码一氧化氮还原酶的norB和norC、编码一氧化二氮还原酶的nosZ。在DO 5、4、3、2 mg/L条件下的总丰度分别为0.774‰、0.876‰、0.671‰、1.185‰。DO的削减有助于反硝化菌属富集,也使得反硝化基因富集。但是菌属演替过程一些携带反硝化基因的菌属被取代,因而丰度存在波动。nirK、nosZ富集丰度受DO浓度影响显著,是主要限制性基因。需要注意的是,固氮过程也导致生成一些
该过程由nifD、nifH、nifK调控。在DO 5、4、3、2 mg/L条件下的总丰度分别为0.575‰、0.560‰、0.435‰、0.658‰,表明 DO 2 mg/L条件下氮素去除效果低的原因之一是因为固氮作用强化。
因此,DO主要通过调控amoA、amoB、amoC、nirK、nosZ实现对氮素去除效果的影响。同时,作为反应器运行建议,需要将DO控制在3～4 mg/L避免固氮基因富集,不利于污水氮素去除。
酿酒厂的污水如果自行处理,既耗费成本又浪费资源,而可持续的一种处理方式是再利用。为了推动酿酒污水再利用技术的应用,本文设计了技术的应用模式。如图6所示,有2种方式利用。一是酿酒污水自酿酒厂排放出来后由运输车运送至城镇生活污水处理厂,用作污水处理厂中深度处理工艺中的碳源;二是将酿酒污水直接按照比例投加进酿酒厂的生活污水处理设备用作碳源。以甲醇碳源为例,价格为2 530元/t,碳源投加成本为0.65元/m3[36]。以安徽省无为市城东污水处理厂为例,处理规模为33 300 m3/d[37],应用酿酒污水再利用技术后,每日约节省污水处理费用21 645元。以四川省某浓香型白酒污水厂为例,其生活污水排放量2 300 m3/d[38],每日约节省污水处理费用1 495元。基于该策略,可以同步减少酿酒污水、生活污水处理资金投入。随着碳达峰与碳中和计划的提出,降本增效、节能降碳是工业发展主要趋势,采用再利用技术有助于酿酒工业与污水处理工业提高盈利。
图6 酿酒污水再利用技术模式
Fig.6 Technological models for the reuse of brewing wastewater
对于后续研究,需要探究碳源准确投加、精准测算降本增效数值等,其核心是拓展人工智能技术的应用。我国在污水智慧处理领域研究热度已经处于世界前列,神经网络模型被逐渐用于评估和预测污水处理效果,部分污水处理厂已经应用自动化控制系统[39]。例如LI等[40]自主研发了一种基于智能优化的污水处理厂综合控制框架,通过集成数据模型、智能决策、动态优化和控制,实现了污水处理厂全过程动态监管,能耗大幅度降低。因此,随着污水资源化技术智能化发展,碳源释放的精确控制和在线监测愈发受到关注,可以进一步提高资源化效率,推动酿酒工业与污水处理工业转型升级、可持续发展。
本研究考察了DO浓度对酿酒污水再利用技术强化脱氮效果,并且系统性的揭示微生物响应机制、基因富集特征、应用模式,得到以下结论:
a)按照1∶380的体积比将酿酒污水与生活污水混合,可以在DO 3～5 mg/L条件下实现污水处理,满足GB 18918—2002《城镇污水处理厂污染物排放标准》一级A排放标准。
b)DO 3～5 mg/L条件下的菌群结构相似,但是在DO 2 mg/L条件下菌群结构出现显著差异,菌属数量削减。菌属水平上,DO 3～5 mg/L条件下主要的脱氮菌属为Sphaerotilus、Hydrogenophaga、Zoogloea。DO可以通过驱动共生富集的好氧菌属协同削减,从而显著改变微生物群落结构,影响氮素去除性能。基因水平上,DO主要通过调控amoA、amoB、amoC、nirK、nosZ实现对氮素去除效果的影响。
c)酿酒污水可用作城镇生活污水处理厂或者酿酒厂自身生活污水处理设备的碳源,有助于实现降本增效、节能降碳。后续还应进一步研发酿酒污水、废物联合处理处置技术以及配套应用策略,特别是需要提高智慧管理水平,构建完善的再利用技术体系。
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