长双歧杆菌婴儿亚种CICC 6069T的益生特性研究及分子鉴定方法开发

李俊飞1,宋智泉1,何晓锐2,陈亚伟1,郭立峥1,于蕊1,刘佳彤2,葛媛媛1,蔡顺风2*,姚粟1*

1(中国食品发酵工业研究院有限公司,中国工业微生物菌种保藏管理中心,北京,100015)2(上海上药信谊微生态科技有限公司,上海,200072)

摘要益生菌的功能特性与安全性评价是其应用开发的重要基础。该研究聚焦长双歧杆菌婴儿亚种CICC 6069T,对其基因组特征、安全性、益生特性进行了系统研究,并且建立了其菌株水平的快速鉴定方法。全基因组分析揭示了该菌株丰富的碳水化合物和氨基酸代谢基因,以及抗氧化、母乳低聚糖(human milk oligosaccharides,HMOs)代谢、植酸代谢相关基因,展现出作为功能益生菌的巨大潜力。安全性评价表明,该菌株对常规抗生素敏感,无溶血活性,无急性毒性,可以作为益生菌安全使用。益生特性评价实验表明,该菌株有良好的黏附性、DPPH自由基清除能力、较强的植酸酶活力,能够有效促进肠道细胞对于铁元素的吸收,结合基因分析和体外实验验证了该菌株在促进矿物元素吸收的潜力。基于脂蛋白编码基因6069GL001191设计特异性引物,建立了高效的CICC 6069T菌株水平鉴定方法,为实现其知识产权保护和质量控制提供先进的技术支持。该研究从功能、安全性和知识产权保护等多个角度进行全方位探讨,为CICC 6069T在肠道健康调控领域的应用提供坚实的理论支撑,助力其在益生菌产业中的创新发展。

关键词全基因组测序;益生特性;安全性评价;长双歧杆菌婴儿亚种CICC 6069T;菌株鉴定

引用格式：李俊飞,宋智泉,何晓锐,等.长双歧杆菌婴儿亚种CICC 6069T的益生特性研究及分子鉴定方法开发[J].食品与发酵工业,2025,51(14):273-282.

LI Junfei,SONG Zhiquan,HE Xiaorui, et al.Study on probiotic properties of Bifidobacterium longum subsp.infantis CICC 6069T and development of molecular identification methods[J].Food and Fermentation Industries,2025,51(14):273-282.

第一作者：硕士研究生(姚粟正高级工程师和蔡顺风副研究员为共同通信作者,E-mail:milly@china-cicc.org;caishunfeng@sinepro.com.cn)

基金项目：中国食品发酵工业研究院有限公司强院工程项目(院强院23-发酵-206)

益生菌作为一类对宿主健康具有积极作用的微生物,近年来广泛应用于食品、医药和饲料领域,在调节肠道微生态、增强免疫功能以及预防疾病等方面展现出重要的价值[1-3]。其中,长双歧杆菌婴儿亚种(Bifidobacterium longum subsp.infantis)是婴幼儿肠道健康研究的重点菌株,能够高效利用母乳低聚糖(human milk oligosaccharides,HMOs),通过产生短链脂肪酸(如乙酸),促进肠道屏障功能的成熟,抑制炎症反应,并增强免疫功能[4],其独特的代谢能力和共生特性使其成为肠道微生态调节的重要益生菌之一。

长双歧杆菌婴儿亚种菌株已在临床研究中表现出改善肠道菌群平衡、减轻肠道炎症以及提高婴儿营养吸收等功能。研究表明,M-63菌株能够促进双歧杆菌主导型肠道微生物群的建立,并有效降低粪便pH和大便水样频率[5];EVC001菌株通过高效利用母乳低聚糖降低肠道pH,抑制病原菌,增强屏障功能和调节炎症,从而显著降低早产儿坏死性小肠结肠炎(necrotizing enterocolitis, NEC)的发病率与死亡率[6];FJSYZ1M3菌株则通过维持肠道屏障、调节炎性细胞因子和改变肠道菌群来缓解葡聚糖硫酸钠(dextran sulphate sodium, DSS)诱导的结肠炎[7]。CICC 6069T是一株具有显著益生特性的长双歧杆菌婴儿亚种,其在母乳喂养环境下表现出优越的肠道定植能力,并能够显著减少肠道致病菌的比例,在调节肠道微生态方面展现出重要潜力[8]。此外,CICC 6069T具备良好的耐酸耐胆盐能力、显著的黏附性[9]、抗氧化能力[10]以及抑制炎症[11]的潜力,对肠道稳态调控、抗病原菌及代谢调节方面具有突出优势。

本研究全面评估了CICC 6069T菌株的益生潜能及其应用前景,涵盖了基因组特征、安全性分析与功能评价等关键领域,以期深入揭示其潜在价值。在知识产权保护与产业化推进方面,本研究靶向菌株的特异性位点,创新性地设计了一种精准的菌株水平鉴定方法,可高效应用于CICC 6069T的研究及生产环节,为其质量控制提供有力保障。本研究旨在为CICC 6069T在肠道健康调控领域的应用提供理论基础和技术支持,助力其在益生菌产业中发挥重要作用。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

本研究所用菌株长双歧杆菌婴儿亚种CICC 6069T(Bifidobacterium longum subsp.infantis,CICC 6069T),实验用对照菌以及菌株精准鉴定方法建立过程中包容性、排他性验证实验的菌株(表1)均来自中国工业微生物菌种保藏管理中心(China Center of Industrial Culture Collection,CICC)。Caco-2细胞系购于北京协和医院细胞资源库。

1.1.2 培养基与试剂

DPPH自由基清除能力检测试剂盒,北京索莱宝科技有限公司;硫酸亚铁、植酸钠、植酸酶活力检测试剂盒、人铁蛋白(Ferritin,FE)ELISA试剂盒,生工生物工程(上海)股份有限公司;BCA蛋白质分析试剂盒,碧云天生物技术有限公司;Gibco MEM基础培养基,赛默飞世尔中国;MRS培养基、胰蛋白酶黄豆琼脂(tryptone soy agar,TSA)培养基、LB培养基、强化梭菌培养基、M17培养基、哥伦比亚血琼脂培养基,北京陆桥技术股份有限公司;脑心浸液肉汤(brain-heart infusion broth,BHI),青岛海博生物;2×EasyTaq PCR SuperMix(+dye)、DL 2000Marker,北京全式金生物技术有限公司。

1.2 仪器与设备

GHP-9160隔水式培养箱,上海一恒科学仪器有限公司;ZWY-211B恒温培养振荡器,上海智城分析仪器制造有限公司;5424R小型台式冷冻离心机,德国Eppendorf公司;HG-50高压灭菌锅,日本HIRAYAMA公司;Labcycler Basic普通PCR仪,德国SensoQuest公司;Gel DoCqMEZ凝胶成像仪,美国Bio-Rad;WIX-EP300基础电泳仪,韦克斯科技(北京)有限公司;GridION测序仪,英国牛津纳米孔技术公司;MGISEQ 200RS测序仪,深圳华大智造科技股份有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 菌种活化、培养

从甘油管中吸取150 μL CICC 6069T接种到5 mL含有0.05%半胱氨酸盐酸盐的改良MRS液体培养基中,37 ℃厌氧培养24 h,活化3代,作为种子液备用。

安全性评价实验用对照菌:L.innocua接种到BHI培养基、S.aureus接种到TSA培养基,均37 ℃好氧培养48 h,活化2～3代后使用。

菌株精准鉴定方法开发所用双歧杆菌菌均接种至强化梭菌培养基上,37 ℃厌氧培养48 h,唾液链球菌嗜热亚种接种至M17培养基上,37 ℃好氧培养48 h,L.rhamnosus及L.plantarum接种至MRS培养基,37 ℃厌氧培养48 h,传2～3代后使用。

1.3.2 全基因组分析

1.3.2.1 基因组DNA的提取、测序和组装

使用Omega试剂盒提取DNA,CICC 6069T经溶菌酶去除细胞壁后,利用蛋白酶消化细胞。使用HiBind硅胶柱结合DNA,经过2次快速洗涤步骤,最终将DNA溶解在低盐缓冲液中。利用MGISEQ 200RS平台和GridION平台完成CICC 6069T的基因组测序,对获得的测序数据进行质控后利用生物信息学手段完成菌株的全基因组拼接与数据纠错,最终得到高质量的细菌基因组完成图。

1.3.2.2 基因预测与功能注释

利用Prodigal(版本:2.6.3)软件进行基因组预测,将预测的蛋白序列分别与eggNOG、RAST数据[12-13]库进行BLASTp比对(版本:2.2.28+),从而获得预测基因的注释信息。

数据库VFDB(https://www.mgc.ac.cn/VFs)、Virulence Finder(https://cge.food.dtu.dk/services/VirulenceFinder)主要用于识别和检测细菌基因组中的毒力基因,以评估其致病性;CARD(https://card.mcmaster.ca/)和ResFinder(http://genepi.food.dtu.dk/resfinder)是关于耐药基因及其产物和相关表现型的生物信息学数据库[14],涵盖了当前已发现的多数抗生素耐药基因。分别以序列相似性≥80%、序列覆盖度≥70%和序列相似性≥90%、序列覆盖度≥60%作为筛选标准。

1.3.3 安全性评价

1.3.3.1 菌株溶血性试验

在哥伦比亚血琼脂平板上将已活化好的CICC 6069T划线接种,37 ℃放置48 h,最后观察溶血现象是否在菌落周围出现,并拍照记录。阴性对照菌为L.innocua CICC 10417、阳性对照菌为S.aureus CICC 10473。

1.3.3.2 抗菌药物敏感性

参考EFSA 5206—2018《饲料添加剂或生产发酵制品的微生物特性指南》第2.2.1节“抗菌药物敏感性要求”,采用琼脂稀释法测定CICC 6069T菌株对8种抗菌药物(氨苄西林、万古霉素、庆大霉素、链霉素、红霉素、克林霉素、四环素和氯霉素)的最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC)。菌株培养至对数生长期后,离心收集菌体并用PBS悬浮,调整浓度至约1×106CFU/mL。将抗菌药物梯度溶液与菌悬液混合,于37 ℃、厌氧条件下培养24 h,观察生长情况。通过比浊法记录MIC值,并与EFSA推荐的临界值比较,评估菌株的耐药性。

1.3.3.3 动物致病性

参考《保健食品原料用菌种安全性检验与评价技术指导原则(2020年版)》附录A要求,选取健康昆明种小鼠,雌雄各半,体重18～22 g,随机分为试验组和对照组,每组10只。试验组小鼠经腹腔注射CICC 6069T的量不少于1×107 CFU/mL,对照组注射等量无菌生理盐水。连续观察21 d,记录小鼠的健康状况、行为、体重变化和死亡率。若实验组未出现中毒症状或死亡,且与对照组无显著差异,可判定菌株无致病性。

1.3.4 益生特性评价

1.3.4.1 菌株表面活性评价

取培养24 h的CICC 6069T菌悬液于4 ℃、6 000 r/min离心10 min,收集菌体,用等体积PBS缓冲液洗涤菌体3～5次。

用PBS缓冲液重悬菌泥,重新调整菌悬液的OD600值为1.000,记作A0;取2 mL调整浓度后的菌液加入400 μL氯仿,振荡30 s,停顿10 s后再振荡30 s,静置5 min后取水相测定其在600 nm处吸光度值,记为A1,疏水率计算如公式(1)所示[13]:

用PBS缓冲液重悬菌泥,调整菌体浓度约108 CFU/mL,测得菌液600 nm处吸光值,记为A0。取4 mL调整浓度后的菌悬液,振荡10 s,室温静置。每隔1 h取0.1 mL上清液加至有3.9 mL的PBS缓冲液的试管中,振荡10 s,并测定该菌悬液在600 nm处的吸光值,记为At,共取5次,每个时间点做3个重复,通过吸光度差值变化评估菌株自聚集性[15],计算如公式(2)所示:

1.3.4.2 抗氧化能力

以CICC 6141作为阳性对照菌,采用DPPH自由基清除能力检测试剂盒评估CICC 6069T的抗氧化能力。DPPH自由基是一种具有单电子的稳定自由基,在517 nm处有最大吸收,其醇溶液呈紫色。当有自由基清除剂存在时,DPPH自由基会与其单电子配对,导致吸收逐渐减弱,褪色程度可反映自由基清除效果,可用于检测自由基清除情况及物质的抗氧化能力[16]。使用DPPH自由基清除能力检测试剂盒测定样品的DPPH自由基清除能力,将样品与DPPH溶液混合,避光反应一定时间后,在515 nm处测定吸光度。通过吸光度的下降程度,计算样品清除DPPH自由基的能力。

1.3.4.3 植酸酶活力测定

以菌株CICC 6073为阳性对照,采用植酸酶活力检测试剂盒测定CICC 6069T和CICC 22728的植酸酶活力。将菌体离心取上清液作为待测样品,配制测定管和对照管,于37 ℃反应30 min后在95 ℃水浴终止反应,加入显色剂混匀,37 ℃静置15 min离心取上清液,在700 nm处测定吸光值,计算酶活力并比较菌株的活性差异。

1.3.4.4 细胞水平CICC 6069T调控铁吸收功能评价

将Caco-2细胞置于T75培养瓶内,在5%(体积分数)CO2、37 ℃、MEM完全培养基中进行培养,隔天更换液。当Caco-2细胞增殖和融合超过80%以上时,用0.25% EDTA-胰酶进行消化,将0.5 mL 105个20～50代的Caco-2细胞接种于含有适量MEM培养基24孔Transwell板上,将0.5 mL新鲜培养液加入基底室中,并将细胞置于培养箱中连续培养12～21 d形成单层细胞,使用细胞电阻仪测定单层细胞电阻值大于220 Ω/cm2,即可用来进行铁吸收试验。

向培养孔中加入50 μmol/L FeSO4浓度和0.5 mL培养液,并置于37 ℃、5%CO2的恒温培养箱中连续培养0.5～5 h,每个试样3个重复,设置阳性对照组、试验组、空白对照组。收集空白组孔内全部溶液,用于铁定量。其余含细胞各孔,依次用冲洗液-除铁液-冲洗液清洗后吸出,加入500 μL细胞裂解液超纯水,刮下细胞,收集孔内全部溶液,于4 ℃超声粉碎后,利用BCA蛋白质分析试剂盒和FE ELISA试剂盒测定Caco-2细胞裂解上清液总蛋白和铁蛋白含量。

1.3.5 菌株精准鉴定方法建立

针对CICC 6069T基因组上的保守编码蛋白的核酸序列及其特有SNP位点信息,使用Primer Premier 6设计包含SNP位点的引物,并利用NCBI引物工具Primer-BLAST在细菌(Bacteria<taxid:2>)基因组范围内验证引物的特异性,允许每条引物有不多于4个碱基的错配,扩增片段长度不超过2 000 bp,将在长双歧杆菌“种”水平上具有特异性的引物合成实物用于后续实验。

在37 ℃厌氧环境下进行CICC 6069T的培养、传代,获得第1代(CICC 6069T-1代)、第3代(CICC 6069T-3代)、第5代(CICC 6069T-5代)、第8代(CICC 6069T-8代)、第10代(CICC 6069T-10代)共5个不同代次菌株,用以验证CICC 6069T特异的SNP位点在不同代CICC 6069T菌株株内的遗传稳定性。为了进一步验证引物的包容性和排他性,收集长双歧杆菌同种不同株的实物菌株共14株,双歧杆菌属的不同种实物菌株共5株,以及不同科的实物菌株2株用于验证引物的特异性。PCR反应体系为50 μL总体积:DNA模板2 μL,引物(10 μmol/L)1 μL×2,2×PCR Taq mix 25 μL,ddH2O 21 μL;PCR扩增条件为95 ℃ 5 min;95 ℃ 30 s,58 ℃ 30 s,72 ℃ 35 s,35个循环;72 ℃ 10 min。将PCR产物进行1.5%的琼脂糖凝胶电泳,扩增片段长度均符合理论设计长度的PCR产物通过测序比较序列信息。

1.4 数据统计与分析

统计分析与作图采用GraphPad Prism 9软件进行,所有数据采用“平均值±标准差”表示,组间比较使用独立样本t检验,以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 全基因组分析

2.1.1 基因组的组装情况

研究发现,CICC 6069T的基因组由单一的圆形染色体组成,长度为2 832 748 bp(图1),没有质粒,GC含量为59.88%,包含2 547个预测的编码序列(coding sequences, CDSs)和92个结构RNA(8个rRNA和84个tRNA)。

2.1.2 基因的功能注释

基于数据库对预测到的编码基因进行了功能分析。通过eggNOG数据库功能注释揭示,CICC 6069T基因组中碳水化合物(9.68%)与氨基酸(9.05%)转运代谢相关基因丰度显著,提示其具备高效糖代谢与氮源利用能力(附图1,https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.042360,下同)。通过RAST数据库来预测不同基因的功能,重建代谢网络[17],注释到20%的基因(附图2)。蛋白质代谢(23.29%)、氨基酸及其衍生物代谢(21.46%)、碳水化合物代谢(13.05%)构成比最高的核心功能模块。特别地,在胁迫应答调控基因类下注释到关于渗透调节的渗透诱导蛋白,并预测到氧化应激调节的谷胱甘肽氧化还原循环相关酶。这些基因的存在表明,CICC 6069T在高渗透压和氧化胁迫环境下可能具有较强的适应性和抗氧化潜力,有利于其在复杂环境中的生存和发挥益生功能。

作为长双歧杆菌婴儿亚种的模式菌株,CICC 6069T代谢母乳低聚糖的分子机制已有较为全面的解析。CICC 6069T具备对HMOs具有高特异性的糖苷酶、磷酸化酶和转运蛋白基因簇体系,能够代谢绝大多数HMOs[18-19]。基于蛋白结构域检测发现了10个组氨酸磷酸酶家族(histidine phosphatase superfamily)的基因,其中9个属于家族内第一分支(clade-1),广泛参与胞内糖代谢;而1个基因(6069GL1659)具有结构域IPR000560,属于家族内第二分支(clade-2),该基因可能具有催化植酸(肌醇六磷酸)水解的功能。尽管在CICC 6069T基因组上没有检测到常见的植酸酶EC 3.1.3.26和EC 3.1.3.8但其可能通过新的植酸酶催化植酸降解,提高机体的钙、铁、锌等矿物元素的生物可利用性。这一发现与前文报道一致[20],是CICC 6069T有别于其他长双歧杆菌的潜在功能,对开发协同促进矿物元素生物利用的益生菌剂具有重要指导意义。

基因组分析结果显示,CICC 6069T在糖类代谢、氨基酸代谢和抗氧化调控方面展现出较强的潜力,这为其在肠道环境中的稳定定植及益生作用提供了遗传基础。此外,该菌株携带多种功能基因,能够参与植酸降解、HMOs代谢及矿物质吸收,为其作为功能性益生菌的应用提供了理论支持。

2.2 安全性评价

2.2.1 耐药与毒力基因分析

基于VFDB和Virulence Finder数据库比对分析,在CICC 6069T基因组上均未检测到毒力相关基因。但通过将CICC 6069T的基因组序列与CARD数据库比对,检测到2种抗生素耐药相关基因,分别是Bifidobacterium adolescentis rpoB mutants conferring resistance to rifampicin(以下简称rpoB)与利福霉素类抗生素耐药相关;Mycobacterium tuberculosis rpsL mutations conferring resistance to streptomycin(以下简称rpsL),与氨基糖苷类抗生素耐药相关。

基于本地基因组数据库中1 305株B.longum基因组序列进行分析,发现注释到rpoB耐药基因的菌株占比为99%(1292/1305),注释到rpsL耐药基因的菌株占比为99.6%(1300/1305)。因此,rpoB和rpsL耐药基因在长双歧杆菌物种中广泛存在,可能为该物种的固有耐药基因。进一步评价了rpoB和rpsL耐药基因的横向转移风险分析,结果表明,2个耐药基因均在CICC 6069T基因组的染色体上,且在基因上下游附件未检测到插入序列元件、转座子或整合子,发生横向转移的风险相对较低。因此,rpoB和rpsL耐药基因在B.longum物种中广泛存在且发生横向转移的风险相对较低,CICC 6069T菌株不构成抗微生物耐药性风险。

2.2.2 药物敏感性分析

药物敏感性结果如表2所示,CICC 6069T对氨苄西林、万古霉素、庆大霉素、红霉素、克林霉素、四环素、氯霉素敏感,对链霉素耐药。链霉素属于氨基糖苷类抗生素,这一结果与基因层面的耐药分析结果一致。尽管观察到对链霉素的耐药表型,但没有发现可转移的耐药基因,这表明该益生菌不构成抗微生物耐药性或异质性耐药性的风险,可以安全应用于益生菌相关生物制品中。

2.2.3 溶血性实验

在溶血性实验中,CICC 6069T菌株的菌落周围未出现明显的溶血圈,表明该菌株没有溶血活性(图2)。这一结果意味着CICC 6069T菌株不会对红细胞造成破坏,不会作为病原体引起溶血反应,这对于确保CICC 6069T生物制品的安全性和稳定性是一个积极的特征。

2.2.4 小鼠经口急性毒性评价

小鼠经口急性毒性评价主要通过测定半数致死剂量(LD50)来评估受试物的急性毒性,是评估生物制剂在短期内造成健康损害效应的重要方法。在CICC 6069T菌悬液的急性毒性研究中,剂量为10.0 g/kg体重情况下,14 d内雌、雄小鼠生长发育正常,死亡率为0%(表3)。这一结果表明,CICC 6069T菌悬液在对雌、雄小鼠进行的急性经口毒性测试中表现出了较高的安全阈值,其LD50>10.0 g/kg体重,属于实际无毒级别,对小鼠无急性毒性作用。

2.3 益生特性评价

2.3.1 菌株表面活性评估

基于疏水率和自聚集性,对CICC 6069T黏附性进行了初步评价。结果显示,CICC 6069T疏水率为(43.65±0.16)%;通过监测菌株每小时的吸光度差值变化评估菌种自聚集性,结果显示CICC 6069T在1 h的自聚集率就达到了97%左右,1～5 h之间自聚集率维持在约97%,在5 h的自聚集率为(97.04±0.21)%。

依据细菌对于自聚集能力和表面疏水性的划分标准,自聚集率在16%～35%为低自聚集能力,在36%～50%为中等自聚集能力,在51%以上为高自聚集能力;疏水率在0%～29%以下为非疏水,在30%～59%为中度疏水,在60%～100%为高度疏水[21]。依据该标准可判定CICC 6069T具有中等疏水性与高自聚集性,表明CICC 6069T菌株黏附性良好,是其在肠道微环境中的稳定定植及持续发挥功能的重要前提。通过肠道黏附定植,CICC 6069T可以调节肠道菌群,抑制有害病原菌的定植,维持肠道微生态平衡,从而增强肠道屏障功能。

2.3.2 抗氧化能力测定

本研究通过测定DPPH自由基清除率,对CICC 6069T的抗氧化能力进行了评估,并与阳性对照菌株CICC 6141(即L.rhamnosus LGG)进行了比较(图3)。CICC 6141菌株已被广泛研究,并表现出显著的抗氧化特性,是益生菌抗氧化性能评价常用的阳性对照菌。DPPH自由基是一种很稳定的氮中心的自由基,是抗氧化能力的重要指标之一。经检测,CICC 6069T和CICC 6141的DPPH自由基清除率分别为(77.45±0.61)%和(75.92±0.61)%,两者之间差异不显著(P>0.05),表明CICC 6069T菌株在DPPH自由基清除方面表现良好,具有一定的抗氧化能力。这一特性有助于减轻体内的氧化应激,保护细胞免受自由基引起的损伤。通过减少自由基的积累,CICC 6069T可能在抗衰老、改善免疫功能以及预防由氧化引发的慢性疾病方面发挥积极作用。因此,CICC 6069T在食品和保健品中作为抗氧化剂的添加剂,有助于提高抗氧化防御,改善整体健康,延缓衰老过程,降低慢性疾病的风险。

2.3.3 植酸酶活力测定

本研究测定了CICC 6069T、CICC 6073和于CICC 22728等3株益生菌的植酸酶活力(图4)。CICC 6073因其在促进铁吸收方面的积极作用[22]被选为植酸酶活力测定及铁吸收能力评价的阳性对照菌。结果显示,CICC 6069T的植酸酶活力为(93.77±7.02) mU/mL,与对照菌株CICC 6073的植酸酶活力[(94.50±11.51) mU/mL]相比无显著性差异(P>0.05),两者均显著高于CICC 22728的植酸酶活力[(56.57±5.09) mU/mL]。植酸酶是一类能够催化植酸及其盐类水解为肌醇与磷酸(盐)的酶,CICC 6069T具有较高的植酸酶活力,可以在肠道中释放被植酸螯合的矿物质(如钙、铁、锌等),进而不同程度上提高磷、钠和钙等矿物质的利用率、蛋白质消化率以及氨基酸和葡萄糖的肠道吸收率。

2.3.4 细胞水平CICC 6069T调控铁吸收功能分析

CICC 6069T铁吸收功能结果如图5所示,在FeSO4浓度为50 μmol/mL条件下,阳性对照组植物乳植杆菌CICC 6073和CICC 6069T铁蛋白/细胞蛋白的值分别为(6.46±0.28) ng/mg和(5.40±0.33) ng/mg,对肠上皮细胞对亚铁离子的吸收均显示出促进作用,两者之间相比无显著性差异(P>0.05),相比之下,CICC 22728菌株与空白对照组的铁吸收能力较弱,铁蛋白/细胞蛋白的值分别为(1.08±0.14) ng/mg和(1.21±0.06) ng/mg。结果表明,CICC 6069T能够有效促进肠上皮细胞对亚铁离子的吸收,与商业化辅助铁吸收功效显著的益生菌CICC 6073相当[23],而显著优于CICC 22728菌株。这一特性表明,CICC 6069T可能在促进机体矿物质吸收和营养利用方面发挥作用,可应用于改善铁缺乏相关疾病方面的研究与实践,是开发兼具营养强化与肠道健康调控功能的理想候选益生菌。

2.4 CICC 6069T“株”水平快速鉴定方法建立

2.4.1 引物的设计及验证

本研究通过基因组分析获得了一条脂蛋白编码基因6069GL001191,其第400位的碱基为多态性位点,CICC 6069T的碱基为A,其余长双歧杆菌的碱基为G。基于该基因及其CICC 6069T特有SNP位点设计了一对引物LhF/LhR,如表4所示。该引物在NCBI的基因组参考序列(Reference Sequence Database,Refseq)数据库和非冗余蛋白质序列(Non-Redundant Protein Sequence Database,NR)数据库中均只在B.longum物种上存在结果,表明该引物组在B.longum“种”水平上具有特异性。

通过传代培养获得了CICC 6069T-1(第1代)、CICC 6069T-3(第3代)、CICC 6069T-5(第5代)、CICC 6069T-8(第8代)、CICC 6069T-10(第10代)等5批菌株,利用引物LhF/LhR对其基因组DNA进行了扩增,扩增片段长度均符合理论设计长度(约110 bp),结果如图6所示。PCR扩增产物经过测序分析发现,5批菌株扩增片段长度一致、核酸序列100%匹配,与基因6069GL001191预测的PCR产物序列完全一致。这表明基于该SNP位点在株内遗传稳定,可以作为CICC 6069T菌株鉴定的有效参考。

为了验证引物能够快速、精准地鉴定菌株CICC 6069T,从长双歧杆菌婴儿亚种内不同菌株间、长双歧杆菌不同亚种间、双歧杆菌不同种间以及不同科间等多个层次收集了包括CICC 6069T在内的21株实物菌株用于实验验证(图6)。结果表明,不同传代的CICC 6069T及其他6株长双歧杆菌婴儿亚种的PCR扩增产物无非特异性扩增条带,目的条带单一、明亮且符合理论设计长度(110 bp);7株长双歧杆菌其他亚种(长亚种、猪粪亚种、猪亚种)除了有目标扩增产物外,同时出现了非特异性条带;双歧杆菌同属不同种的5株菌以及不同科2株菌则无条带或有非特异性扩增条带,均没有目的条带产生。因此,该引物在长双歧杆菌婴儿亚种上的包容性良好,且能有效区分其他物种。进一步对长双歧杆菌婴儿亚种的目的条带进行测序后,得到的PCR产物长度为110 bp,CICC 6069T产物65号位点碱基为A,其他长双歧杆菌菌株在该位点的碱基为G(表5),可以有效区分CICC 6069T和其他近缘菌株。综上,本研究开发的特异性引物在长双歧杆菌“种”水平上扩增效率良好,且结合菌株特异位点能够在“株”水平上精准鉴定CICC 6069T。与前人采用形态学、生理生化、基质辅助激光解析电离飞行时间质谱鉴定技术和全基因组测序技术建立菌株鉴定的方法相比[24],本研究基于遗传稳定的SNP位点开发了一种更为快速、精准的CICC 6069T鉴定方法,在菌株鉴定的特异性和应用便捷性方面具有显著优势。该方法具有高效、稳定、可操作性强的特点,为CICC 6069T的工业化应用及质量控制提供了可靠的技术支持。

3 结论

本研究全面解析了长双歧杆菌婴儿亚种CICC 6069T的分子特征和益生特性。全基因组分析揭示了其显著的代谢潜力与环境适应性;安全性评估证实了该菌株是无毒、无溶血且对抗生素敏感的安全菌株,应用无风险;体外实验表明,其在黏附性、抗氧化性、植酸酶活性和促进铁元素吸收等方面性能良好,具备转化为益生菌的潜力,可应用于调节肠道菌群、促进HMOs代谢、增强机体矿物元素吸收等。特别地,在基因、酶活力、细胞多维层面系统验证了该菌株促进铁元素吸收的创新价值。同时,针对菌株水平识别的行业共性难题,创新性构建基于特异性基因和SNP位点开发的精准鉴定方法,为该菌株的快速识别和产权保护提供了技术支持,是其未来标准化生产应用的有力保障。综上,CICC 6069T具有良好的益生潜力,在功能性食品与肠道健康调控领域应用前景广阔。

[1] 曾婧贤. 益生菌功能性食品的研究进展[J].食品安全导刊, 2023(26):190-192.ZENG J X.Research progress of probiotic functional foods[J].China Food Safety Magazine, 2023(26):190-192.

[2] 岳稳, 李焰, 曹宜, 等.益生菌在畜禽生产中的应用进展[J].福建畜牧兽医, 2024, 46(2):39-41.YUE W, LI Y, CAO Y, et al.Application progress of probiotics in livestock and poultry production[J].Fujian Journal of Animal Husbandry and Veterinary Medicine, 2024, 46(2):39-41.

[3] 孙倩, 华子瑜.益生菌在新生儿疾病中的应用进展[J].中国实用儿科杂志, 2024, 39(1):21-24.SUN Q, HUA Z Y.Progress in the application of probiotics in neonatal diseases[J].Chinese Journal of Practical Pediatrics, 2024, 39(1):21-24.

[4] CHICHLOWSKI M, SHAH N, WAMPLER J L, et al.Bifidobacterium longum subspecies infantis (B.infantis) in pediatric nutrition:Current state of knowledge[J].Nutrients, 2020, 12(6):1581.

[5] HIRAKU A, NAKATA S, MURATA M, et al.Early probiotic supplementation of healthy term infants with Bifidobacterium longum subsp. infantis M-63 is safe and leads to the development of Bifidobacterium-predominant gut microbiota:A double-blind, placebo-controlled trial[J].Nutrients, 2023, 15(6):1402.

[6] TOBIAS J, OLYAEI A, LARAWAY B, et al.Bifidobacterium longum subsp. infantis EVC001 administration is associated with a significant reduction in the incidence of necrotizing enterocolitis in very low birth weight infants[J].The Journal of Pediatrics, 2022, 244:64-71.e2.

[7] LI M J, DING J H, STANTON C, et al.Bifidobacterium longum subsp.infantis FJSYZ1M3 ameliorates DSS-induced colitis by maintaining the intestinal barrier, regulating inflammatory cytokines, and modifying gut microbiota[J].Food &Function, 2023, 14(1):354-368.

[8] SELA D A, GARRIDO D, LERNO L, et al.Bifidobacterium longum subsp.infantis ATCC 15697 α-fucosidases are active on fucosylated human milk oligosaccharides[J].Applied and Environmental Microbiology, 2012, 78(3):795-803.

[9] QUINN E M, KILCOYNE M, WALSH D, et al.A whey fraction rich in immunoglobulin G combined with Bifidobacterium longum subsp.infantis ATCC 15697 exhibits synergistic effects against Campylobacter jejuni[J].International Journal of Molecular Sciences, 2020, 21(13):4632.

[10] LIU C F, PAN T M.In vitro effects of lactic acid bacteria on cancer cell viability and antioxidant activity[J].Journal of Food and Drug Analysis, 2010, 18(2):77-86.

[11] VAN BEST N, TREPELS-KOTTEK S, SAVELKOUL P, et al.Influence of probiotic supplementation on the developing microbiota in human preterm neonates[J].Gut Microbes, 2020, 12(1):1-16.

[12] CANTALAPIEDRA C P, HERN width=11,height=14,dpi=110

NDEZ-PLAZA A, LETUNIC I, et al.eggNOG-mapper v2:Functional annotation, orthology assignments, and domain prediction at the metagenomic scale[J].Molecular Biology and Evolution, 2021, 38(12):5825-5829.

[13] AZIZ R K, BARTELS D, BEST A A, et al.The RAST Server:Rapid annotations using subsystems technology[J].BMC Genomics, 2008, 9:75.

[14] HENDRIKSEN R S, BORTOLAIA V, TATE H, et al.Using genomics to track global antimicrobial resistance[J].Frontiers in Public Health, 2019, 7:242.

[15] 加勒哈斯别克·塞力克,孙昕,阿曼古丽·杰木斯,等.新疆传统发酵乳品中益生菌的益生特性[J].中国微生态学杂志, 2019, 31(5): 502-508.GALHASBEK·Selik, SUN X, AMANGULI·Jemus, et al. Probiotic characteristics of probiotics in Xinjiang traditional fermented dairy products[J]. Chinese Journal of Microecology, 2019, 31(5): 502-508.

[16] 房盟盟, 梁栋, 马康, 等.基于DPPH自由基清除能力的牡丹籽油体外抗氧化功效[J].林业科技通讯, 2024(7):56-58.FANG M M, LIANG D, MA K, et al.Antioxidant effect of peony seed oil based on DPPH free radical scavenging ability in vitro[J].Forest Science and Technology, 2024(7):56-58.

[17] CHEN X Y, ZHANG Y D, ZHANG Z W, et al.PGAweb:A web server for bacterial pan-genome analysis[J].Frontiers in Microbiology, 2018, 9:1910.

[18] KITAOKA M.Bifidobacterial enzymes involved in the metabolism of human milk oligosaccharides[J].Advances in Nutrition, 2012, 3(3):422S-429S.

[19] ZABEL B E, GERDES S, EVANS K C, et al.Strain-specific strategies of 2′-fucosyllactose, 3-fucosyllactose, and difucosyllactose assimilation by Bifidobacterium longum subsp. infantis Bi-26 and ATCC 15697[J].Scientific Reports, 2020, 10(1):15919.

[20] TAMAYO-RAMOS J A, SANZ-PENELLA J M, YEBRA M J, et al.Novel phytases from Bifidobacterium pseudocatenulatum ATCC 27919 and Bifidobacterium longum subsp.infantis ATCC 15697[J].Applied and Environmental Microbiology, 2012, 78(14):5013-5015.

[21] NIEDERLE M V, BOSCH J, ALE C E, et al.Skin-associated lactic acid bacteria from North American bullfrogs as potential control agents of Batrachochytrium dendrobatidis[J].PLoS One, 2019, 14(9):e0223020.

[22] NORDSTRÖM E A, TEIXEIRA C, MONTELIUS C, et al.Lactiplantibacillus plantarum 299v (LP299V®):Three decades of research[J].Beneficial Microbes, 2021, 12(5):441-465.

[23] AXLING U, ÖNNING G, NISKANEN T M, et al.The effect of Lactiplantibacillus plantarum 299v together with a low dose of iron on iron status in healthy pregnant women:A randomized clinical trial[J].Acta Obstetricia et Gynecologica Scandinavica, 2021, 100(9):1602-1610.

[24] 刘冲, 马霞, 于学健, 等.一株分离自母乳的长双歧杆菌婴儿亚种YLGB-1496的菌株鉴定[J].食品与发酵工业, 2023,49(19):67-74.LIU C, MA X, YU X J, et al.Strain identification of Bifidobacterium longum subsp. infantis YLGB-1496 isolated from breast milk[J].Food and Fermentation Industries, 2023,49(19):67-74.

Study on probiotic properties of Bifidobacterium longum subsp.infantis CICC 6069T and development of molecular identification methods

LI Junfei1, SONG Zhiquan1, HE Xiaorui2, CHEN Yawei1, GUO Lizheng1, YU Rui1, LIU Jiatong2, GE Yuanyuan1, CAI Shunfeng2*, YAO Su1*

1(China National Research Institute of Food &Fermentation Industries, China Center of Industrial Culture Collection, Beijing 100015, China)2(Shanghai Pharma Sine Micro Ecological Technology Co.Ltd., Shanghai 200072, China)

ABSTRACT Assessing the functional characteristics and safety of probiotics is essential for their application.This study systematically investigated the genomic features, safety, and probiotic properties of Bifidobacterium longum subsp.infantis CICC 6069T and established a rapid strain-level identification method.Whole-genome analysis revealed abundant genes related to carbohydrate and amino acid metabolism, as well as those associated with antioxidant activity, human milk oligosaccharides (HMOs) metabolism, and phytic acid degradation, highlighting its potential as a functional probiotic.Safety evaluation showed that this strain is sensitive to common antibiotics, exhibits no hemolytic activity, and has no acute toxicity, confirming its suitability for probiotic use.Probiotic property assessments demonstrated strong adhesion ability, high DPPH free radical scavenging activity, and significant phytase activity.It effectively promoted iron absorption in intestinal cells, with genomic and in vitro analyses supporting its potential for enhancing mineral uptake.A strain-specific identification method was developed using primers targeting the lipoprotein-encoding gene 6069GL001191, providing an advanced tool for intellectual property protection and quality control.This study comprehensively explored the functionality, safety, and industrial applications of the strain, offering a solid theoretical foundation for its use in gut health regulation and innovation in the probiotic industry.

Key words whole-genome sequencing; probiotic properties; security assessment; Bifidobacterium longum subsp.infantis CICC 6069T; strain identification