渝东北地区农家和工厂腊肉挥发性风味物质及代谢物质差异分析

张继开1,沈丽华1,胡小易1,陈可意1,刘举1,刘奇1,赵峰1,2,肖国生1*

1(重庆三峡学院生物与食品工程学院,重庆,404120)2(重庆特色生物技术研究院有限公司,重庆,405400)

摘要该研究在感官评价分析基础上,结合顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用技术对渝东北地区农家和工厂腊肉中的挥发性风味物质进行了成分鉴定,并对其代谢产物进行了差异分析。结果显示,工厂腊肉感官评价较高,感官品质好。检测出558种挥发性物质,根据相对气味活度值(relative odor activity value, ROAV)法结果表明,ROAV≥1的挥发性风味物质共48种,其中十一烯醛、4-羟基丁酸、4-辛酮、苯乙酮、4-壬酮、γ-十内酯、甲基丙烯酸正丁酯、2,3-二甲基苯酚这6种物质为农家和工厂腊肉中的差异关键化合物。正交偏最小二乘判别分析结果显示,2-庚酮、2-羟基苯甲醛等20种物质是造成农家和工厂腊肉风味差异的主要原因。同时对其代谢物质进行分析,找到37种差异代谢物,其中11种代谢物上调,26种代谢物下调。该研究为明确渝东北挥发性风味物质差异分析提供理论依据,为渝东北地区腊肉进一步加工生产提供参考。

引用格式：张继开,沈丽华,胡小易,等.渝东北地区农家和工厂腊肉挥发性风味物质及代谢物质差异分析[J].食品与发酵工业,2025,51(14):298-305.

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第一作者：硕士研究生(肖国生教授为通信作者,E-mail:xgs03@sanxiau.edu.cn)

基金项目：重庆市技术创新与应用发展专项重点项目(cstc2021jscx-tpyzxX0004);重庆市开州区科技计划项目(KZKJ-2023-J-7)

腊肉作为中国传统肉制品之一,历史悠久、种类丰富,具有鲜明的地方特色。腊肉凭借其色泽美观、风味浓郁、便于贮藏、食用方便的特点[1],深受广大消费者青睐。我国腊肉以产地而论,种类多样,其中以四川腊肉、重庆腊肉、广式腊肉、湖南腊肉等较为出名。渝东北地区腊肉作为重庆腊肉的典型代表,以加食盐、白酒等简单辅料,运用传统腌制和烟熏工艺制作而成。因其风味浓郁,口味独特而深受人们喜爱。

风味指的是食品所引发的嗅觉和味觉的综合体验,而挥发性化合物则是决定肉制品风味特征的关键因素。挥发性风味物质主要包括醛、醇、酮、烃、酯、呋喃,以及含氮和含硫的化合物,它们是腊肉制作和贮藏过程中通过许多化学反应产生的,如脂质氧化、Strecker反应、美拉德反应和硫胺素降解等[2]。对发酵肉制品中挥发性风味物质的研究已有不少报道,如毛永强等[3]对陇西腊肉的风味物质检测,发现醛类、酮类、酯类物质对风味贡献最大;粟桂蓉等[4]对传统土家腊肉进行分析发现酚类、酯类和其他类物质为土家腊肉主要风味贡献物质;董亚云等[5]利用顶空固相微萃取结合全二维气相色谱-飞行时间质谱技术分析传统干腌腊肉挥发性风味物质,发现2,3-丁二酮、2-甲基丁醛、庚醛和2-辛烯醛对干腌腊肉的风味贡献最大。已有研究发现,不同地域腊肉关键性风味物质有所差别,具有明显的地域差异,使腌腊肉制品呈现出不同的风味特征。

渝东北地区盛产腊肉,目前逐渐由农家个体生产为主转为工厂规模化化为主,但普通消费人群则认为农家口感和风味更好。目前有关渝东北地区农家和工厂腊肉的挥发性风味物质以及代谢物质是否存在明显差异尚未见报道。本研究在感官评价的基础上,采用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用技术(headspace solid-phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry,HS-SPME-GC-MS)检测渝东北地区农家和工厂生产的腊肉中的挥发性物质,结合相对气味活度值(relative odor activity value,ROAV)和变量重要性投影(variable importance in projection,VIP)值找出关键风味物质,利用非靶向代谢组学寻找腊肉中代谢物之间的差异,明确渝东北腊肉的特征挥发性物质,分析农家和工厂腊肉代谢物质之间的差异,为明确渝东北腊肉特征性挥发性风味物质,以及农家和工厂腊肉间风味是否存在差异提供理论依据,为渝东北地区腊肉进一步工厂化大规模生产提供科学参考。

1 材料与方法

1.1 实验样品

17个腊肉样品采自城口、奉节、巫溪和开州4个渝东北区县的农家和工厂,农家样品编号为NC,工厂样品编号为GC,将采集的腊肉样品装至无菌袋中,置于有冰袋的泡沫箱中运回实验室,-80 ℃冰箱贮存备用。

1.2 仪器与设备

Agilent 8890-7000D气相色谱-质谱联用仪、Agilent DB-5MS 30 m×0.25 mm×0.25 μm色谱柱、Agilent 120 μm DVB/CWR/PDMS萃取头、CTC Analytics AG SPME Arrow固相萃取装置、CTC Analytics AG Fiber Conditioning Station老化装置、DB-5MS毛细管柱,美国Agilent公司。

1.3 实验方法

1.3.1 感官评定方法

参照孔晓雪等[6]的方法,适当修改,选择10位无饮食偏好的人员,经过培训后组成感官评价小组。将样品分开煮熟,切成厚度为0.5 cm的切片,分别以外观色泽、气味、滋味、口感、整体接受度5项指标对渝东北地区腊肉样品进行感官评定,评分标准见表1。

1.3.2 挥发性风味物质检测

参照姚文生等[7]的方法,适当修改,采用HS-SPME-GC-MS对腊肉中的挥发性风味物质进行成分鉴定。

1.3.2.1 样品萃取

从-80 ℃冰箱中取出样品进行液氮研磨,涡旋混合均匀,每个样本称取0.2 g于顶空瓶中,分别加入0.2 g NaCl粉末,20 μL(10 μg/mL)内标溶液,放入全自动顶空固相微萃取中进行样本萃取。

萃取条件:在60 ℃恒温条件下,振荡5 min,将萃取头插入样品顶空瓶,顶空萃取15 min,于250 ℃下解析5 min,然后进行GC-MS分离鉴定,采样前萃取头要在250 ℃下老化5 min。

1.3.2.2 色谱质谱采集条件

色谱条件:采用DB-5MS毛细管柱,载气为高纯氦气(纯度不小于99.999%),恒流流速1.2 mL/min,进样口温度250 ℃,溶剂延迟3.5 min。程序升温条件:40 ℃保持3.5 min,以10 ℃/min升至100 ℃,再以7 ℃/min升至180 ℃,最后以25 ℃/min升至280 ℃并保持5 min。

质谱条件:电子轰击离子源(electron impact,EI),离子源温度230 ℃,四级杆温度150 ℃,质谱接口温度280 ℃,电子能量70 eV,扫描方式为选择离子检测模式,定性定量离子精准扫描。

1.3.2.3 风味物质的定性定量分析

基于多物种、文献、部分标品以及保留指数,自主建立数据库,按照匹配度>800进行定性分析。采用内标法进行半定量分析,风味物质含量计算如公式(1)所示:

式中:Xi,待测化合物i的含量,μg/g;Vs,加入内标物的体积,μL;Cs,内标物的质量浓度,μg/mL;M,待测样品的量,g;Is,内标物的峰面积;Ii,待测样品中化合物i的峰面积。

1.3.2.4 关键挥发性物质的确定

参照刘登勇等[8]的ROAV法对腊肉的风味贡献成分进行评价,ROAV>1,表明该化合物对样品风味有直接的贡献。其计算如公式(2)所示:

式中:ROAV,化合物的相对气味活度值;Ci,化合物的相对含量,μg/g;Ti,化合物的阈值,μg/g。

1.4 数据分析

用Mass Hunter软件处理质谱分析数据,并对风味物质进行定性定量分析,用SPSS 22.0软件进行数据统计分析,R 3.1.2软件进行无监督主成分分析(principal component analysis,PCA)、正交偏最小二乘法判别分析(orthogonal partial least squares discriminant analysis,OPLS-DA)和差异代谢物相关性分析。根据VIP≥1和差异倍数值(fold change,FC)≥2或≤0.5来筛选差异代谢物,用Gephi 0.9.2软件进行可视化分析。

2 结果与分析

2.1 农家和工厂腊肉感官评价结果

根据外观、气味、滋味、口感和接受度5项指标对渝东北地区农家和工厂腊肉进行感官评价,感官评分结果见图1。结果发现,多数工厂腊肉样品的5项感官指标得分比农家的高,工厂腊肉5项感官指标平均得分显著高于农家腊肉(P<0.05),说明工厂腊肉的外观、气味、滋味、口感和接受度5个方面都要优于农家腊肉。这可能是由于工厂腊肉有严格规范的统一原料处理、腌熏制作流程和贮存过程,而农家生产腊肉所用猪为自养,原料、生产工艺和贮存更具随意性和个性化。

2.2 农家和工厂腊肉挥发性风味物质的种类差异

从渝东北腊肉中共检测出558种风味物质,其中烃类物质和杂环化合物占比最多;其次是醇类物质、酮类物质、酯类物质、芳烃类物质和萜类物质;醛类物质、酸类物质、酚类物质、胺类物质、含氮化合物、含硫化合物、卤代烃、醚类和其他化合物占比较少(图2-a)。

农家和工厂腊肉主要风味物质种类占比相似,杂环类和烃类普遍存在于各样品之中,且占比最高,是渝东北农家和工厂腊肉的主要挥发性物质类别,其次是酯类、芳烃类、酮类、醛类和醇类。农家和工厂的挥发性物质在种类和占比上具有一定差异,虽然样品间差异较大,总体上看工厂腊肉的挥发性物质数量更多(图2-b)。从挥发性风味物质含量上来看,农家和工厂样品中酚类物质含量和芳烃类物质含量占比最多,农家样品间差异更大(图2-c),说明酚类物质和芳烃类物质是渝东北地区农家和工厂腊肉中主要风味物质,工厂腊肉更稳定。

为了进一步分析渝东北地区农家和工厂腊肉中挥发性风味物质含量差异,对腊肉样品进行热图聚类分析,样品中的挥发性化合物用颜色填充的方框表示,颜色强度标准化范围红色到绿色,表明化合物含量从高到低。渝东北地区农家和工厂腊肉挥发性风味物质的种类丰富,不同腊肉样品在化合物种类和含量上存在差异,总体来看工厂样品中的物质含量要高于农家样品(图2-d)。

2.3 农家和工厂腊肉关键风味物质分析

每种挥发性风味物质对腊肉整体香气特征的贡献取决于其浓度和气味阈值,一般认为ROAV>1(基于水中的阈值)的挥发性化合物被认为是对风味起主要贡献作用[9]。从渝东北腊肉中共检出48种挥发性物质的ROAV>1,其中农家腊肉检测出41种,工厂腊肉检出47种。在48种挥发性物质中,大多数醛类物质和酚类物质的ROAV值都非常高,其ROAV接近或超过100;而大多数醇类、酮类和酯类物质的ROAV在10以内。另外,分析还发现少数酸类、苯类、吲哚、吡嗪类物质,它们的ROAV低,对腊肉风味组成影响较小(图3)。结果表明,渝东北地区腊肉关键风味物质种类多样,醛类和酚类物质在风味形成中起到关键作用,其次是醇类、酮类和酯类物质。比较发现,农家和工厂腊肉关键风味物质相差8种,工厂腊肉未检测到十一烯醛和4-羟基丁酸,农家腊肉未检测到4-辛酮、苯乙酮、4-壬酮、γ-十内酯、甲基丙烯酸正丁酯、2,3-二甲基苯酚,集中在酸类物质,酮类物质和酯类物质(图3)。我们还观察到某些挥发性化合物的水平可能低于阈值ROAV<1,但由于其潜在的附加效应,如协同效应或掩蔽效应,它们对腊肉香气的潜在影响不应被忽视。

2.4 农家和工厂腊肉PCA和OPLS-DA

PCA可以将主要信息保留在不相关的PC中,PC的累计贡献率越大,则可以更好地反映各个指标的信息[10]。OPLS-DA可以通过降维提供信息数据的可视化表示,是一种适用于建立物质表达量与样品类别间关系模型的有效判别分析方法[11]。

通过腊肉样品的GC-MS结果进行PCA,结果发现第一主成分(PC1)和第二主成分(PC2)的贡献率分别为50.05%和12.79%,总体贡献率达到了62.84%;工厂和农家腊肉主成分集中比较一致,工厂腊肉主成分更集中,而农家腊肉主成分更分散(图4-a)。OPLS-DA分析腊肉的关键标志香气化合物时发现,工厂腊肉关键标志香气物更集中,而农家腊肉关键标志香气化物更分散,农家和工厂地区的样品被分成了2个没有重合的部分,说明样品之间具有潜在的差异性(图4-b)。结果显示,工厂化生产的腊肉风味物质会更一致,而农家腊肉因为工艺和贮存条件多样性,风味物质会存在较大差异。根据VIP值进一步分析发现,共筛选出来221个VIP>1的物质(图4-c,红色点表示代谢物的VIP>1,绿点表示代谢物的VIP≤1),其中筛选出农家和工厂VIP值前20的差异物质,这20种化合物可用于区分工厂腊肉和农家腊肉(图4-d)。

2.5 农家和工厂腊肉差异代谢物分析

基于OPLS-DA结果,用VIP≥1和FC≥2或≤0.5相结合的方法从农家和工厂腊肉中共筛选出了37个差异代谢物质,其中11个代谢物上调,26个代谢物下调(图5-a)。对上调和下调倍数最大的前20个差异代谢物进行分析发现,农家和工厂对比中的上调物质有2-庚酮、苯乙二醛、4,5-二甲基八烷-2,6-二烯、1,5-庚二烯、3,3,5-三甲基-1,5-庚二烯、3-甲基-2(5H)-呋喃酮、烯丙基环己烷;下调物质有丙苯、4-羟基吡哒嗪、2,5-己二酮、十五酸甲酯、1,5,8-p-对薄荷三烯、2-丙烯基苯、1-丙酮、4-己烯-1-醇,乙酸、2-羟基苯甲醛、4-甲基-1-丙-2-基双环[3.1.0]己烷-3-醇、3,5-二甲基苯乙烯、4-乙炔基-1,2-二甲苯、α-甲基苯乙烯(图5-b)。

3 讨论

挥发性风味物质是腊肉风味的重要贡献者,种类数量直接关系到腊肉特征性风味,不同挥发性物质种类数量和浓度造就了不同地区和不同工艺的腊肉特征性风味。从渝东北腊肉中共检出558种风味物质,其中关键风味物质包括醛、酚、酮类等,这与尚永彪等[12]、朱建军等[13]研究的重庆农家腊肉、黔式腊肉结果相似。在川渝地区消费者存在一种普遍消费观念,认为农家腊肉要比工厂生产的腊肉更好吃。而我们发现,渝东北地区农家和工厂生产的腊肉主要风味物质种类占比相似,农家和工厂关键风味物质差异不大,工厂关键风味物质数量更多,这与蔡振林[14]研究的湖南农家和工厂腊肉的结果相反,原因可能与不同地域腊肉的加工方式、香辛料的添加以及保存条件有关。

醇类物质一般具有较高的阈值,对腊肉中的风味贡献可能较小,在本研究中1-辛烯-3-醇普遍存在于农家和工厂腊肉样品之中,可以提供蘑菇香和泥土香[15]。这种化合物的形成主要是来自亚油酸的自氧化,有助于形成腊肉制品的典型香气[16]。此外,同样检测到(Z)-2-辛基-1-醇、2-辛烯-1-醇、和(E)-辛烯醇等,但ROAV较低,对腊肉样品风味贡献小。1-辛烯-3-醇可以认为是渝东北农家和工厂腊肉醇类物质的主要贡献者。

醛类物质主要由脂质氧化降解产生,因为其阈值低,具有较强的挥发性,通常有令人愉快的青草、麦芽和水果的味道和香气,是腊肉中的重要挥发性风味物质[17],影响食物的整体风味。例如农家和工厂腊肉中含量较高的己醛会提供绿色草香味[18],另一种壬醛也会提供柑橘和绿色的香气。其中十一烯醛是农家腊肉中特有的关键醛类物质,赋予其脂肪气息和清香气息。醛类物质在渝东北腊肉中关键风味物质中占比最大,种类最多,是渝东北地区腊肉中整体风味形成中的最重要的贡献者。

酚类化合物主要来源于腊肉的烟熏过程,是腊肉非常重要的风味物质,是烟熏风味的典型香气成分。通过与广式腊肉对比,赵冰等[19]发现广式腊肉中的酚类物质很少,这也说明酚类物质是经过烟熏过程后产生的,是烟熏腊肉中特有的物质。研究发现农家和工厂腊肉中都包括愈创木酚、苯酚、丁香酚、2-乙基-苯酚,这些酚类化合物大多具有烟熏特征,尤其是愈创木酚,它被描述为一种烟熏味,是烟熏腊肉中最主要的化合物[20]。在工厂腊肉中还检测出一种关键香气酚类物质(2,3-二甲基苯酚),原因可能是工厂腊肉烟熏时的温度更高,木质素的热解可以促进苯酚的产生。

酸类物质是通过醛氧化和碳水化合物代谢产生的,通过微生物作用对氨基酸的降解产生的4-羟基丁酸是渝东北腊肉中的主要酸类物质,但只在农家腊肉中检测出,原因可能是因为农家腊肉在制作过程中会添加一些白酒,以及在贮存过程中没有使用冷冻保存,使其微生物生长繁殖比较活跃。但是酸类物质的阈值很高,对腊肉的风味没有显著影响[21]。

酮类物质主要由不饱和脂肪酸的氧化和氨基酸的降解产生的,其呈味时间久,通常具有坚果及乳酪味。酮类物质因为拥有更高的阈值,对腊肉的风味起修饰作用[22]。但二氢-2-甲基-3(2H)-呋喃酮的ROAV很高,是渝东北地区农家和工厂腊肉关键风味是重要贡献物质。在工厂腊肉中还检测出的4-辛酮、苯乙酮以及4-壬酮。酯类物质的形成通常需要经过一个复杂的反应链,它们可能来自于微生物作用下醇类和羧酸类的酯化反应,对腊肉风味也有较大贡献,赋予腊肉特殊的水果香味[23]。γ-十内酯和甲基丙烯酸正丁酯是工厂腊肉中特有的关键化合物。

含硫含氮的杂环类化合物一般阈值低,香气非常强烈,这类化合物主要来源于美拉德反应以及氨基酸、硫胺素的热降解形成。在农家和工厂腊肉中都检测到吡嗪类物质,在非常少量的情况下对于肉的贡献是非常大的,会产生刺鼻的气味[24]。含氮化合物吲哚在低浓度时具有令人愉悦的香气,但在高浓度时具有令人不快的气味[25]。碳氢化合物(包括烷烃和芳香族化合物)虽然占比最高,但是因为其具有较高的阈值,对整体香气的贡献可能较小[26]。

通过PCA发现,农家和工厂腊肉大部分样品聚集在一起,说明农家和工厂腊肉样品风味极为相似,但是工厂样品更加集中,而农家样品更加分散。这可能与工厂腊肉有较为规范的腊肉加工工艺,严格的烟熏温度,烟熏时间和储存条件有关;而农家腊肉在原料选择处理、工艺制作和贮存方面更具有随意性和个性化,导致其产品风味具有差别。我们发现OPLS-DA可以有效区分农家和工厂腊肉样品,所有样品被分为了两大类,同时筛选出前20种用以区分农家腊肉和工厂腊肉的风味化合物,包括2-庚酮、2-羟基苯甲醛、4,5-二甲基-2,6-辛二烯、3-甲基-2(5H)-呋喃酮、甲基乙基环戊烯、2,5-己二酮等物质,由于以上20种关键物质含量的不同可能是造成渝东北农家和工厂腊肉风味差异的主要原因。

腊肉在腌熏制和贮存过程中表面和肉内会发生一系列生理化学和微生物代谢反应,从而产生差异代谢物,这些物质是腊肉风味物质形成的基础。从农家和工厂腊肉中共筛选出了37个差异代谢物质,其中11个代谢物上调,26个代谢物下调。大部分差异物质主要是脂肪氧化过程产生的物质,主要是碳氢化合物、醛类和酯类物质,且集中为下调物质。可能与腊肉的加工和保存方式有关。农家腊肉在加工过程中的烟熏温度往往低于工厂腊肉,所以在制作过程中工厂腊肉中的脂肪氧化程度更高。但是在保存过程中,农家腊肉一般在室温环境挂置,受温度和环境影响大,而工厂一般在冷库中保存,有助于保持其品质不易发生变化,这些因素可能是引起代谢物差异形成的原因。这些差异代谢物也会参与到腊肉风味的形成过程中,对农家和工厂的腊肉的风味形成也会发挥重要的作用。

4 结论

通过对渝东北农家和工厂腊肉进行感官评价分析,发现在外观、气味、滋味、口感和接受度指标上都具有显著性差异,且工厂腊肉感官评价要高。采用HS-SPME-GC-MS方法从渝东北腊肉中共筛选出了558种挥发性风味物质,种类丰富,其中杂环类、烃类物质含量较高。农家和工厂腊肉主要风味物质种类占比和多数关键香气挥发性物质组成较为相似,以醛类物质和酚类物质为主,在酸类物质,酮类物质和酯类物质上存在差异。PCA显示,工厂腊肉风味物质更具一致性,而农家腊肉风味物质更具多样性,同时筛选出前20种VIP>1的关键物质,用以区分农家腊肉和工厂腊肉。进一步筛选出了37种差异代谢物质,其中11个代谢物上调,26个代谢物下调。研究结果为明确渝东北腊肉主体香味成分提供理论依据,为渝东北特色腊肉的进一步发展提供参考。

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Difference analysis of volatile flavor substances and metabolites between farm and factory cured meat in northeast Chongqing

ZHANG Jikai1, SHEN Lihua1, HU Xiaoyi1, CHEN Keyi1, LIU Ju1, LIU Qi1, ZHAO Feng1,2, XIAO Guosheng1*

1(College of Biology and Food Engineering, Chongqing Three Gorges University, Chongqing 404120, China)2(Chongqing Characteristic Biotechnology Research Institute Co.Ltd., Chongqing 405400, China)

ABSTRACT The cured meat in Northeast China is favored by people because of its rich flavor and unique taste.At present, there are mainly two production methods, farm and factory, but it is not clear whether the flavor substances and metabolic substances of these two production methods are different.Based on sensory evaluation and analysis, combined headspace solid-phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry (HS-SPME-GC-MS) was used to identify the volatile flavor compounds in farm and factory cured meat in northeast Chongqing and analyze the differences of their metabolites.Results showed that the meat had high sensory evaluation and good sensory quality.558 volatile substances were detected.According to the relative odor activity value (ROAV), 48 volatile flavor substances with ROAV≥1 were detected.Among them, undecenal, 4-hydroxybutyric acid, 4-octanone, acetophenone, 4-nonone, γ-decenolide, n-butyl methacrylate, and 2, 3-dimethylphenol were the key compounds of difference between farm and factory cured meat.The orthogonal partial least squares discriminant analysis (OPLS-DA) showed that 20 substances, including 2-heptanone and 2-hydroxybenzaldehyde, were the main reasons for the flavor difference between farm and factory cured meat.At the same time, 37 different metabolites were found, of which 11 metabolites were up-regulated and 26 metabolites were down-regulated.This study provided a theoretical basis for the analysis of volatile flavor substance differences in northeast Chongqing and a reference for further processing and production of cured meat in northeast Chongqing.

Key words cured meat; volatile flavor substance; metabolic substances; difference analysis