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高脂血症(hyperlipidemia,HLP)由脂质代谢异常所引起,主要表现为血清总胆固醇(serum total cholesterol,TC)、低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein cholesterin,LDL-C)、总甘油三酯(total triglycerides,TG)水平升高及高密度脂蛋白胆固醇(high density lipoprotein cholesterol,HDL-C)水平降低[1]。常见的降脂药物,如奥利司他可有效抑制胰脂肪酶活力,干扰脂肪代谢,考来烯胺属于聚苯乙烯季铵型强碱性阴离子交换树脂,可与胆酸盐结合,促进胆固醇转化为胆汁酸,以此达到降血脂的目的[2],但长期服用可能会引发胰腺炎、腹痛、胃肠胀气等不良反应[3-4]。因此,为避免药物带来的副作用,开发出天然降血脂药物或安全性高的食源性降脂产品显得尤为重要。
已有多项研究证明,金花茶、红砖茶、普洱茶等茶叶具有降血脂效果,其效果主要取决于水提物中的活性物质[5-7]。与传统热泡茶相比,冷泡茶更能保留茶叶的芳香物质,减少营养损失,具有便利、安全性和营养价值高等特点[8]。冷水浸泡能最大程度提高茶的健康效益,但所需时间较长,已有研究通过物理、化学和生物方法进行改进,但成本较高[9]。电解水是通过电解装置对去离子水或蒸馏水进行电解,形成的具有特定酸碱性的水,其制备原料易得、成本低、安全环保[10-11],且具有独特的渗透溶解能力和抗氧化性。与纯水相比,碱性电解水能高效提取植物中的化学物质,显著增加总酚、总黄酮含量,提高抗氧化活性[12],有助于改善血脂水平。冬枣茶是一种未添加任何添加剂且不含咖啡因的天然绿色饮品,其原料主要是冬枣树的幼芽和嫩叶,富含茶多酚、游离氨基酸、维生素和锌等营养成分[13]。现已开发出以红枣枣芽为原料的红茶和绿茶,但对冬枣茶的研究和产品开发应用仍较少[14],其利用潜力尚未被充分挖掘。利用电解水冷泡冬枣茶,其茶汤成分是否具有降血脂作用亦尚未明确。
本文拟以不同pH值的电解水作为冷泡介质,利用其高渗透性对冬枣茶进行冷泡,筛选出活性成分较高的茶汤,并以去离子水为对照制备冷泡冬枣茶,通过体外评价法比较不同茶汤体外降血脂活性差异。通过模拟人体胃肠消化环境,以考来烯胺为阳性对照,比较不同茶汤与甘酸钠(sodium glycate,SGC)、牛磺胆酸钠(sodium taurocholate,STC)、胆酸钠(sodium cholate,SC)的结合能力。同时,以奥利司他为阳性对照,比较不同冷泡溶液对胰脂肪酶的体外抑制作用,并对其降血脂效果进行评价,为冬枣茶的产品开发提供参考。
原料:冬枣茶叶,产自四川省绵阳市,由企业惠供;试剂:去离子水,去离子水机制备;电解水,多功能富氢水机制备;硝酸铝、醋酸钾,重庆康坭商贸有限公司;无水乙醇,重庆市钛新化工有限公司;碳酸钠,重庆跃翔化工有限公司;福林酚(1 mol/L),重庆欣鼎科生物科技有限责任公司;芦丁标准品(纯度≥98%)、没食子酸标准品(纯度≥98%)、谷氨酸标准品(纯度≥98%),上海阿拉丁生化科技股份有限公司;pH 8.0磷酸缓冲液,重庆金喜鹊科技发展有限责任公司;水合茚三酮(纯度≥99%),成都赛尔文思生物科技有限公司;氯化亚锡(SnCl3·2H2O),上海笛柏生物科技有限公司。
胆酸钠(SC,≥95%)、牛磺胆酸钠(STC,≥95%)、甘氨胆酸钠(SGC,≥95%)、阳性对照品:考来烯胺、奥利司他,Macklin生化科技有限公司;胰酶(胰蛋白酶活力≥4 000 U/g,胰淀粉酶活力≥7 000 U/g,胰脂肪酶活力≥4 000 U/g)、胃蛋白酶(30 000 U/g)、胰脂肪酶(猪胰、50 000 U/g),源叶生物科技有限公司。
鼓风干燥箱DHG-9070,上海齐欣科学仪器有限公司;酶标仪011005,美国基因公司;Centrifuge5804R高速台式离心机,艾本德国际贸易有限公司;多功能富氢水机XK-A5C,广东鑫康科技有限公司。
1.3.1 冬枣茶成分含量测定
总酚含量的测定,参考GB/T 8313—2018《茶叶中茶多酚和儿茶素类含量的检测方法》;
总黄酮含量测定,参考SN/T 4592—2016《出口食品中总黄酮的测定》;
游离氨基酸含量测定,参考GB/T 8314—2013《茶 游离氨基酸总量测定》。
1.3.2 电解水的制备
使用多功能富氢水机,以去离子水为基础,制备饱和碳酸钾溶液作为电解质,并通过调节电解时间,制备出pH值约为5.0、6.0、7.0、8.0、9.0和10.0的电解水。
1.3.3 冷泡电解水pH值的选择
茶叶样品破碎,过80目筛,以筛下物作为待测样品。分别准确称取2 g待测样品于250 mL干燥锥形瓶中,根据预实验,固定料液比为1∶60(g∶mL),冷泡时间为30 min,以不同pH值(5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0)的电解水作为溶剂对冬枣茶进行冷泡,冷泡结束后过滤,滤液经6 000 r/min离心5 min。实验结果以冷泡茶汤总酚、总黄酮、游离氨基酸含量显示,比较不同pH值的碱性电解水对冬枣茶冷泡浸出效果的影响。
1.3.4 体外降血脂测定
1.3.4.1 样品处理
根据1.3.3节实验得到的结果,选择以pH 9.0的碱性电解水作为冷泡剂,以去离子水作为对照,并按照上述方法进行处理,重复冷泡4次,合并上清液定容至200 mL备用。并将样品溶液分别记为去离子水冷泡茶汤(deionized water,DW)、电解水冷泡茶汤(electrolytic water,EW)。
1.3.4.2 与胆酸盐的结合能力测定
a)制作胆酸盐标准曲线
参考TIAN等[15]方法,稍作改动。将浓度均为1 mmol/L的牛磺胆酸钠溶液、甘氨胆酸钠溶液、胆酸钠溶液(经0.1 mol/L、pH 6.3磷酸缓冲液配制)等体积混合为混合胆酸钠(mixed sodium cholate,MSC)溶液,吸取0、0.25、0.5、0.75、1.0、1.5 mL MSC加入上述磷酸缓冲液1.25 mL,用质量分数60%硫酸定容至5 mL混匀。于70 ℃水浴20 min后,立即冰水浴5 min,离心取上清液于微板,在波长387 nm处检测吸光度。以MSC浓度为横坐标,吸光度为纵坐标绘制标准曲线。
b)制备人工胃液
精密移取16.4 mL稀盐酸,缓慢注入800 mL蒸馏水混匀,再加入10 g胃蛋白酶, 用蒸馏水定容至1 000 mL混匀。
c)不同浓度冬枣茶茶汤结合胆酸盐的能力测定
将1.3.3节制备茶汤梯度稀释(质量浓度为12、10、8、6、4、2 mg/mL),各取1 mL加入1 mL人工胃液于37 ℃振荡1 h。用0.1 mol/L氢氧化钠溶液调节pH至6.3,加入4 mL胰酶(经上述磷酸缓冲液配制,10 mg/mL),37 ℃振荡30 min,再分别加入4 mL上述STC、SGC、SC溶液,37 ℃恒温振荡1 h,8 000 r/min离心20 min,取上清液按公式(1)测定胆酸盐结合量,以相同浓度梯度的考来烯胺作阳性对照:
胆酸盐结合量/(μmol/mL)=
(1)
1.3.4.3 胰脂肪酶抑制实验
a)制作油酸标准曲线
配制油酸正己烷溶液,浓度为0.5、1.5、2.5、3.5、4.5、5.5、6.5 μmol/mL。分别取5 mL于10 mL离心管,加入1 mL显色50 g/L醋酸铜,磁力搅拌3 min。8 000 r/min离心5 min,上清液用酶标仪于714 nm处测定吸光度。不加油酸作空白对照,以其浓度为横坐标、吸光值为纵坐标绘制标准曲线。
b)不同冬枣茶茶汤对胰脂肪酶抑制率测定
采用铜皂法[16]。准确称取0.1 g脂肪酶溶于2 mL 磷酸缓冲溶液(pH 6.8,0.1 mol/L),振荡均匀,得到酶溶液,37 ℃恒温孵育备用。
以橄榄油为反应底物,取1 mL与3 mL 0.1 mol/L磷酸盐缓冲溶液混匀。将1 mL样品与1 mL酶溶液混匀,加入上述溶液于37 ℃恒温反应10 min后,立即加入8 mL甲苯萃取。溶液于6 000 r/min离心10 min,取5 mL上清液于10 mL离心管中,加入1 mL显色5%醋酸铜,按照1.3.4.3节(a)方法进行后续操作,测定吸光度值。以不加脂肪酶为实验空白组,不加样品只加酶作对照组,只有反应底物作对照组空白。脂肪酶抑制率的计算如公式(2)所示:
脂肪酶抑制率
(2)
各项实验进行3次重复操作。数据为“平均值±标准差”,用SPSS和Excel软件进行处理数据。用Origin 2021制作Michaelis-Menten方程。
不同pH的电解水对应的氧化还原电位(oxidation-reduction potential,ORP)值不同,酸性电解水的ORP值远高于碱性电解水。碱性电解水的pH值通常高于8,ORP值低于-200 mV。随着pH值的升高,ORP值会下降,抗氧化能力增强,有助于改善氧化应激,从而辅助降血脂[8]。此外,ORP值与多酚类物质的提取呈极显著负相关[17-18]。夏瑞等[19]利用不同碱性电解水冷泡绿茶茶汤,得到活性成分溶出量均高于瓶装饮用天然水冷泡绿茶。
由图1可知,当料液比为1∶60(g∶mL),时间为30 min,按照1.3.3节规定的冷泡电解水pH范围,分别冷泡冬枣茶,所得冷泡茶总酚含量由高到低为(pH值):7.0>9.0>6.0>8.0>5.0>10.0,其中pH 7.0比pH 10.0高28.6%。总黄酮含量由高到低为(pH值):9.0>8.0>10.0>6.0>7.0>5.0,其中pH 9.0比pH 5.0高53.64%。结果表明,中性和微碱性溶液对提高冬枣茶冷泡茶汤总酚和总黄酮含量具有显著效果,这可能与酚类物质的酚羟基可溶于碱性溶液以及部分黄酮表现出弱碱性有关[20]。游离氨基酸总量由高到低为(pH值):5.0>8.0>7.0>6.0>9.0>10.0,其中pH 5.0比pH 10.0高65.44%,这一结果可能与冬枣中酸性氨基酸含量较高有关[21],表明酸性环境有助于冬枣茶中游离氨基酸的溶出。
图1 冷泡电解水pH值对茶汤成分含量的影响
Fig.1 Effect of pH value of cold bubble electrolyzed water on composition content of tea soup
黄酮和多酚物质可通过与胆酸盐结合及减少氧化应激,直接影响脂质代谢,而游离氨基酸主要通过调节激素分泌,间接影响脂质代谢,且总黄酮和总酚含量与降血脂效果之间存在显著正相关性[22]。在电解水pH值为9.0的条件下,总酚和总黄酮的含量分别达到26.03%和15.07%,游离氨基酸含量为3.77%。这一结果显著高于陈元杰等[23]利用75%乙醇提取的7种茶的总多酚(9.80%～22.84%)和总黄酮(0.90%～4.67%)含量,表明pH 9.0的碱性电解水对冬枣茶中的黄酮和多酚的溶出效果显著。
综上所述,为探究具有较高降血脂效果的冷泡茶茶汤,选择ORP值较低且具有较强抗氧化性质的pH 9.0的碱性电解水作为其中一种冷泡溶液进行后续研究。
2.2.1 胆酸盐标准曲线
由图2可知,MSC标准曲线方程为y=5.086x+0.122 2,R2=0.999 3,表明回归方程对观测数据拟合度较高。
图2 MSC含量标准曲线
Fig.2 Standard curve of mixed bile acid salt content
2.2.2 不同冬枣茶茶汤与胆酸盐结合的能力
一些植物的活性成分,如黄酮、多酚、三萜等化合物可与部分胆酸盐结合,结合后会激发肝脏将胆固醇转化为新的胆酸盐,以补偿结合过程中减少的胆酸盐,从而降低血液中的胆固醇水平,达到降血脂的效果[24]。因此,肠道内胆酸盐的含量变化可以作为评估降血脂效果的一个指标。本文选择胆酸钠、甘氨胆酸钠和牛磺胆酸钠作为考察对象,因为它们所具有的不同结构和亲水性能够全面反映植物活性成分与胆盐的结合特性,且容易获得[25]。由图3可知,使用2种不同溶剂冷泡冬枣茶,其茶汤均对胆酸盐具有一定的结合能力,且随茶汤浓度的增加而增强。根据图示,茶汤与胆酸钠、甘氨胆酸钠、牛磺胆酸钠的结合能力强弱排序为:pH 9.0 EW>DW;对胆酸盐结合量大小排序为:胆酸钠>甘氨胆酸钠>牛磺胆酸钠,与胡凯等[26]研究结果一致。
A-胆酸钠;B-甘氨胆酸钠;C-牛磺胆酸钠
图3 不同冬枣茶茶汤与胆酸盐的结合能力
Fig.3 The binding ability of different winter jujube tea soups with bile salts
图3-A为不同茶汤与胆酸钠结合能力的比较。结果表明,在相同剂量下,EW与胆酸钠结合能力显著高于DW。其中,不同浓度的EW与胆酸钠的结合能力比DW高12.79%～17.07%。二者对胆酸钠结合能力的差异呈现出先减小后增大的趋势。
图3-B为不同茶汤与甘氨胆酸钠结合能力的比较。结果表明,EW和DW与甘氨胆酸钠的结合能力随浓度增加表现出相似的变化趋势,不同浓度的EW与甘氨胆酸钠的结合能力比DW高9.61%～16.02%。
图3-C为不同茶汤与牛磺胆酸钠结合能力的比较。结果表明,EW和DW与牛磺胆酸钠结合能力差异不显著(P>0.05),不同浓度的EW与胆酸钠的结合能力比DW高3.45%～8.37%。
综上所述,pH 9.0的碱性电解水冷泡冬枣茶茶汤中的活性成分与胆酸盐的结合能力优于去离子水,这一结果表明,利用碱性电解水制备的茶汤具有显著优势,因其胆酸盐结合能力更高,能够更有效地调节胆固醇代谢,促进脂肪的消化与吸收。
考来烯胺是一种临床医学中用于降血脂的化学物质,可与胆酸盐相结合,本次体外降血脂实验将其作为阳性对照,以评估冬枣茶茶汤与胆酸盐的结合效果,推测其降血脂的潜力[27]。实验选取质量浓度为12 mg/mL的DW和EW与相同浓度的考来烯胺进行比较,计算2种茶汤与胆酸盐的的结合量相对于同剂量考来烯胺的吸附率。
由表3可知,考来烯胺与3种胆酸盐结合量基本相等。在同等条件下,2种冬枣茶汤结合胆酸钠的能力是考来烯胺的27.09%～30.70%,结合甘氨胆酸钠的能力是考来烯胺的23.80%～28.04%,结合牛磺胆酸钠的能力是考来烯胺的19.77%～21.57%。胡凯等[26]的研究表明,与考来烯胺相比,以下物质与胆酸钠、甘氨胆酸钠、牛磺胆酸钠结合量分别为:绿茶(42%、46.5%、38.4%)、铁观音(42.6%、41.7%、35.2%)、六堡茶(25.5%、35.0%、29.9%)、普洱茶(24.9%、30.0%、29.5%)、滇红茶(22.7%、32.9%、29.6%)。
表3 不同冬枣茶茶汤与胆酸盐的结合量相对于同剂量考来烯胺的吸附率 单位:%
Table 3 The adsorption rate of different combinations of winter jujube tea soup and sodium gallate relative to the same dose of Colchicine
项目胆酸钠甘氨胆酸钠牛磺胆酸钠DW27.09±0.02623.80±0.05719.77±0.023EW30.70±0.03428.04±0.04121.57±0.05考来烯胺结合量/(μmol/mL)12.21±0.5012.59±0.3912.24±0.23
上述结果说明,2种冬枣茶茶汤具有一定的胆酸盐结合能力,但结合效果低于部分市售茶叶。与去离子水冷泡冬枣茶汤相比,pH 9.0的电解水冷泡冬枣茶汤在结合胆酸盐的能力上存在明显优势,表明其具有更为显著的降血脂效果。
2.3.1 油酸标准曲线
由图4可知,油酸标准曲线方程为y=0.169 7x-0.041 8,R2=0.994 7,表明回归方程对观测数据拟合度较高。
图4 油酸标准曲线
Fig.4 Oleic acid standard curve
2.3.2 不同冬枣茶茶汤对胰脂肪酶抑制率
脂肪酶的主要功能是分解食物中的脂肪,将其转化为单酰甘油和游离脂肪酸,这会导致血脂浓度的升高。因此,通过抑制脂肪酶的活力,可以减少脂肪的消化和吸收,从而达到降低血脂的效果[24]。
奥利司他是一种胃肠道脂肪酶抑制剂,常与低热量饮食结合用于治疗肥胖症。其作用机理是通过抑制脂质代谢酶,阻止三酰基甘油水解为可吸收脂肪酸和硝酸甘油酯,或直接去除体内的三酰基甘油,以此减少机体摄入热量,抑制肥胖。奥利司他还可以单独或与其他药物联合用于抗肿瘤治疗[28]。
由图5可知,EW、DW对胰脂肪酶均有一定的抑制作用,但都低于奥利司他。2种茶汤对胰脂肪酶的抑制率随浓度增加而逐渐增强,抑制程度为EW>DW,且二者存在显著差异(P<0.05),当质量浓度为12 mg/mL时,EW比DW高13.26%,且2种冬枣茶对胰脂肪酶的抑制率分别是同剂量奥利司他的79.52%、68.98%。说明与去离子水相比,pH 9.0的电解水能更好地激发冬枣茶茶汤对胰脂肪酶的抑制能力。陶国枢等[29]研究发现,碱性电解水能有效减少小鼠体内胆固醇、甘油三酯含量。龚受基等[30]研究表明,不同pH的环境对脂肪酶的抑制率具有很大影响。与本研究结果一致,进一步支持了pH 9.0电解水在提升冬枣茶功能性方面的潜力。
图5 不同冬枣茶茶汤对胰脂肪酶的抑制率
Fig.5 Inhibition rate of pancreatic lipase by different winter jujube tea soups
从表4可以看出,阳性对照药品与不同冬枣茶茶汤的浓度对胰脂肪酶抑制作用线性相关,且拟合度良好。奥利司他作为一个临床上已被广泛使用的脂肪酶抑制剂,其IC50值显著低于EW和DW,这表明奥利司他对脂肪酶的抑制效果明显优于后两者。在冬枣茶汤中,其IC50值高低顺序为DW>EW,说明EW冷泡茶汤对脂肪酶的抑制效果更好。此外,EW与DW之间差异极显著(P<0.01),进一步证明EW冷泡茶汤在脂肪酶抑制方面的潜力,显示出EW冷泡茶汤具有作为辅助或替代治疗的可能性。
表4 不同冬枣茶茶汤和奥利司他对脂肪酶抑制作用(IC50)比较
Table 4 Comparison of the inhibitory effects of different winter jujube tea soups and acarbose on lipase(IC50)
样品线性回归方程IC50/(μg/mL)DWY=4.261X+4.032(R2=0.978 1)11.19EWY=4.620X+10.94(R2=0.974 3)7.855奥利司他Y=5.331X+20.49(R2=0.972 5)4.684
本研究探讨了不同pH的碱性电解水对冬枣茶冷泡效果的影响。结果显示,pH值为9.0的碱性电解水能显著提高冬枣茶汤中的总酚含量、总黄酮含量及游离氨基酸含量。通过对不同溶液冷泡的冬枣茶茶汤进行分析,评估了其与胆酸钠、甘氨胆酸钠、牛磺胆酸钠3种胆酸盐的结合能力及其体外抑制脂肪酶的能力。结果表明,与去离子水相比,使用pH 9.0电解水冷泡冬枣茶在增强茶汤与胆酸盐的结合能力方面表现出显著优势,其效果达到同剂量考来烯胺的30.70%。此外,pH 9.0电解水冷泡冬枣茶也显著提高了茶汤体外抑制脂肪酶的能力,达到同剂量奥利司他的79.52%。
综上所述,冬枣茶茶汤在体外实验中显示出具有辅助降血脂的潜力,尤其在使用pH 9.0电解水冷泡时,其降血脂效果更加显著。这一结果为未来深入探究冬枣茶的作用机制,如体内降血脂实验,提供了有力的实验基础,为开发冬枣茶相关的功能性饮品提供了理论支持。
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