WANG Wanying,LI Zhijian,LI Zehao, et al.Heterologous expression and characterization of Klebsiella sp.ene reductase gene[J].Food and Fermentation Industries,2025,51(14):65-73.
含氧单萜二氢香芹酮具有薄荷香气,不仅可以作为风味添加剂用于食品工业中,赋予食品特殊的风味,还可以作为手性构建基用于合成不同的生物活性分子[1]。研究指出二氢香芹酮具有较好的抑菌活性、驱虫性能、抗肿瘤以及抗炎等生物活性[2],已经被广泛地应用于医药、食品、农业、化妆品、烟草以及化工等领域。
目前,二氢香芹酮的主要来源是从植物中直接提取或通过化学方法合成,这些方式不仅消耗大量的人力物力,而且成本高、工艺过程复杂、环境不友好[3]。与之相比,生物催化是利用酶或者生物有机体作为催化剂对底物进行催化转化,具有反应条件温和、副产物少、专一性强、催化效率高、产物易于分离、环境友好等优点,受到了广泛的关注。烯还原酶能够利用NAD(P)H还原α, β-不饱和烯烃的碳碳双键,将香芹酮还原生成二氢香芹酮,是生物催化合成的重要酶类之一。在过去的研究中,科研工作者已经在真菌、细菌、酵母和植物中鉴定出许多的烯还原酶,比如Syn7942ER(蓝藻Synechococcus sp.PCC 7942)[4]、Ppo-Er1(多粘芽孢杆菌Paenibacillus polymyxa)[5]和MgER(季也蒙念珠菌Meyerozyma guilliermondii)[6]。虽然这些酶具有巨大的研究价值,但是目前用于应用研究的烯还原酶类别较少,稳定性和耐受性较差,缺少真正能用于大规模生产应用的酶。
本实验室在前期研究中筛选得到一株可降解柠檬烯的克雷伯杆菌O852(Klebsiella sp.O852),能够氧化柠檬烯生成二氢香芹酮。通过基因组测序,筛选鉴定出一个催化二氢香芹酮合成的烯还原酶基因O852_GE001833,命名为KlebER2[7]。因此,本研究拟以KlebER2为研究对象,构建重组表达载体pET-28a-KlebER2,将其导入大肠杆菌中进行克隆和异源表达,并对重组蛋白进行纯化以及酶学性质表征,研究其催化香芹酮合成二氢香芹酮的性能。本研究不仅深化了对烯还原酶的认识,也为改造可还原α, β-不饱和化合物的烯还原酶提供基础。
1.1.1 菌株和质粒
Klebsiella sp.O852为本课题组保存,表达载体pET-28a(+),以及Escherichia coli DH5α和E.coli BL21(DE3)分别用于基因的克隆和表达。
1.1.2 主要试剂
卡那霉素、5×蛋白上样缓冲液、IPTG、彩虹180广谱蛋白marker、BCA蛋白定量测定试剂盒、镍-琼脂糖凝胶6FF、层析柱均,北京索莱宝科技有限公司;香芹酮、二氢香芹酮,上海麦克林生化科技股份有限公司;还原型辅酶NADH和NADPH,上海源叶生物科技有限公司;其他相关试剂均为市售分析纯。
LB培养基(g/L):NaCl 10,蛋白胨10,酵母浸粉5,pH自然,121 ℃高压蒸汽灭菌30 min。
Agilent 7890A型气相色谱仪,美国Agilent公司;YX280/15高压蒸汽灭菌锅,上海三申医疗器械有限公司;SW-CJ-1D型洁净工作台,上海力辰邦西仪器科技有限公司;固相微萃取纤维头(50/30 μmDVB/CAR/PDMS),美国Supeleo公司;BSD-TS270振荡培养箱,上海博迅医疗生物仪器股份有限公司厂;722 s分光光度计,上海精密科学仪器有限公司;JY88-IIN超声波细胞破碎仪,宁波新芝生物科技股份有限公司;DZCZ-24DN型电泳仪,北京市六一机械厂;TGL-16B高速冷冻离心机,上海安亭科学仪器厂。
1.3.1 KlebER2生物信息学分析
生物信息学分析预测内容及网址见表1。
表1 生物信息学工具
Table 1 Bioinformatics tools
网址预测内容 https://web.expasy.org/protparam/理化性质分析https://services.healthtech.dtu.dk/services/SignalP-4.1/信号肽预测https://web.expasy.org/protscale/亲疏水性分析https://services.healthtech.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/跨膜结构域预测https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa%20_sopma.html蛋白二级结构预测https://swissmodel.expasy.org/蛋白三级结构预测
1.3.2 重组质粒pET-28a-KlebER2构建
根据Primer 5软件设计引物,并委托上海生工生物有限公司合成,见表2。以Klebsiella sp.O852基因组为模板进行PCR扩增,将PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳,试剂盒回收获得目的基因片段。使用限制性内切酶NcoI和XhoI对上述目的基因片段和载体pET-28a(+)进行双酶切,并通过T4-DNA连接酶将酶切后的产物和载体进行连接,构建重组质粒pET-28a-KlebER2,将重组质粒转化至E.coli DH5α感受态中,菌落PCR后筛选阳性克隆子,并进行测序验证。
表2 引物设计
Table 2 Primer design
引物引物序列(5’-3’)Primer FTAACTTTAAGAAGGAGATATACCATGGGCATGAACAGCCTCTCACTTTTPrimer RGATCTCAGTGGTGGTGGTGGTGGT-GCTCGAGCTCTTTATGCTCCGTATAGAAGGGATA
1.3.3 重组蛋白诱导表达及优化
将上述验证成功的重组载体pET-28a-KlebER2导入E.coli BL21(DE3)中进行异源表达,获得重组菌株。将重组菌株活化,振荡培养后获得种子液。按1%的接种量,将种子液接种至含50 μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中,培养至OD600=0.5～0.7,添加0.5 mmol/L IPTG溶液进行诱导,在24 ℃、120 r/min的条件下诱导培养10 h。离心收集菌体,向菌体内加入适量的Tris-HCl缓冲液重悬,超声破碎后再次离心收集破碎后的上清液和沉淀。分别取未诱导和诱导后的菌体、以及诱导后经过超声破碎的上清液和沉淀,进行SDS-PAGE,分析KlebER2蛋白的可溶性表达。
为了提高KlebER2蛋白的表达量,通过单因素实验对诱导温度(16、20、24、28、32、36 ℃)、诱导时间(6、10、14、18、22、26 h)、IPTG浓度(0.2、0.4、0.6、0.8、1 mmol/L)和转速(100、120、140、160、180 r/min)进行优化,通过SDS-PAGE电泳表征,分析蛋白表达情况。
1.3.4 重组蛋白纯化
使用镍柱亲和层析对重组蛋白进行分离纯化。将超声破碎后离心得到的上清液用0.22 μm滤膜过滤后缓慢上样,分别用含20、40、60、80、250 mmol/L咪唑的Tris-HCl缓冲液进行阶段洗脱,分管收集各阶段的洗脱液,测定其蛋白浓度并进行SDS-PAGE电泳,检测蛋白的分子质量大小和纯度,选择电泳条带单一且符合相对分子质量的洗脱液进行透析浓缩,获得纯化后的酶。
1.3.5 酶活力的测定
酶活力的测定参照LI等[8]方法,反应总体系为1 mL,分别加入终浓度为25 μg/mL纯化后的酶、0.5 mmol/L NADH、6 mmol/L香芹酮,用所需pH的缓冲液补至1 mL。30 ℃下恒温振荡混匀10 h后,测定340 nm下吸光度的变化。一个酶活力单位(U)的定义:在上述条件下,每小时消耗1 mmol/L NADH所需的酶量。
1.3.6 KlebER2酶学性质研究
(1)最适温度和温度稳定性
将整个反应体系分别置于不同温度(20、30、40、50、60 ℃)下进行反应,确定KlebER2的最适反应温度。
将纯化后的酶分别置于不同温度下孵育3 h,随后在最适反应温度下进行反应,研究KlebER2的热稳定性,以未孵育的酶活力为100%进行计算。
(2)最适pH和pH稳定性
用不同pH(4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0)的缓冲液补至1 mL体系,在最适温度下反应,确定KlebER2的最适pH。
将纯化后的酶分别置于不同pH的缓冲液中孵育3 h,随后在最适反应温度和pH的条件下反应,研究KlebER2的pH稳定性,以未孵育的酶活力为100%进行计算。
(3)金属离子和有机溶剂
分别在反应体系中添加终浓度为1 mmol/L金属离子(K+、Fe2+、Ca2+、Mg2+、Cu2+、Mn2+、Ba2+)和20%有机溶剂(甲醇、丙三醇、正丁醇、乙酸乙酯、二氯甲烷、正己烷、二甲基亚砜),研究金属离子和有机溶剂对KlebER2酶活力的影响,以不添加金属离子或有机溶剂的酶活力为100%进行计算。
(4)底物特异性
以香芹酮、柠檬醛、马来酰亚胺、β-紫罗酮、茶香酮、2-环庚烯-1-酮、2-环已烯-1-酮、2-环戊烯-1-酮、反式-2-已烯醛、反式-β-硝基苯乙烯、4,4-二甲基-1-环已烯-1-酮、α-甲基肉桂醛作为底物进行反应,研究KlebER2的底物特异性。
(5)辅酶偏好性
分别使用NADH和NADPH进行反应,研究KlebER2的辅酶偏好性。
1.3.7 KlebER2生物催化香芹酮合成二氢香芹酮
催化反应总体系与酶活测定体系相同,采用固相微萃取/气相色谱-质谱连用仪(solid-phase microextraction/gas chromatography- mass spectrometry,SPME/GC-MS)测定转化产物[8],实验重复3次。使用计算机谱和二氢香芹酮标准品进行定性分析,使用外标法进行二氢香芹酮定量分析。
使用Image J对SDS-PAGE电泳条带的灰度值进行分析,使用SPSS 24.0对数据进行单因素方差分析,采用邓肯法进行显著性分析(P<0.05,P<0.01),使用GraphPad Prism 8.0和Origin 2024进行数据分析和绘图。所有数据均为3次实验重复所得。
使用ProtParam在线工具分析KlebER2的理化性质,结果表明KlebER2由369个氨基酸组成,分子质量40.57 kDa,等电点6.21,脂肪族指数82.87;KlebER2不含跨膜结构,无信号肽。二级结构结果显示,该蛋白的二级结构主要以无规则卷曲为主,占比52.20%,其次为α螺旋、延伸链(图1-a)。以黄素还原酶V3PMM0.1.A的蛋白序列为基础进行三级结构建模预测(图1-b),并利用Ramachandran Plot评价该蛋白三维结构的合理性(图1-c)。结果表明,95.64%的氨基酸残基位于支持区域,说明该蛋白三维结构合理。
a-KlebER2蛋白二级结构预测;b-KlebER2蛋白三级结构模型;c-KlebER2蛋白Ramachandran Plot模型
图1 KlebER2蛋白结构预测
Fig.1 Prediction of the structure of KlebER2
以Klebsiella sp.O852基因组为模板扩增目的基因KlebER2,琼脂糖凝胶电泳结果显示扩增条带大小与目的基因片段大小(1 110 bp)相符(图2-a)。随后,将克隆成功的目的基因片段与载体pET-28a(+)连接,构建重组质粒pET-28a-KlebER2,并转化至E.coli BL21(DE3) 感受态细胞,获得重组菌株,进行菌落PCR验证(图2-b)。
a-基因KlebER2 PCR扩增;b-菌落PCR凝胶电泳图
图2 基因扩增及菌落PCR凝胶电泳图
Fig.2 Gene amplification and colony PCR gel electropherograms
如图3所示,通过比对条带1和2可知,在分子质量为35～48 kDa处有一条明显的蛋白条带,在经过IPTG诱导之后该条带明显变粗,与KlebER2的分子质量(40.57 kDa)一致,说明KlebER2蛋白在大肠杆菌中成功表达。比对条带3和条带4可知,超声破碎之后的上清液中也存在KlebER2蛋白,但含量较低,大部分的蛋白都在沉淀当中,形成包涵体。因此,需要进一步进行优化实验以提高蛋白的可溶性表达。
M:蛋白Marker;泳道1～4依次是:未诱导的菌体、诱导后的菌体、诱导后经过超声破碎的上清液和沉淀。
图3 KlebER2蛋白可溶性表达的SDS-PAGE图
Fig.3 SDS-PAGE analysis of soluble expression of KlebER2 protein
2.3.1 诱导温度优化
由图4可以明显看出,KlebER2蛋白的表达量随温度的升高呈现先升后降的趋势,当温度为20 ℃时,蛋白的表达量达到最大。诱导温度过高,一方面会影响质粒的稳定性,从而影响蛋白的表达,另一方面会导致蛋白不正确折叠、聚集,形成包涵体,并且高温可能会使蛋白失去活性[9];低温诱导能够减慢蛋白质合成的速率,影响多肽折叠的动力学,从而使得正确折叠的蛋白数量增加,减少包涵体的形成[10]。上述结果表明KlebER2的最适诱导温度为20 ℃。
M:蛋白Marker;泳道1～6依次是:16、20、24、28、32、36 ℃诱导的上清液。a-KlebER2温度优化SDS-PAGE电泳图;b-KlebER2温度优化SDS-PAGE电泳图灰度值
图4 诱导温度优化
Fig.4 Optimization of induction temperature
注:不同字母代表数据存在显著性差异(P<0.05),相同字母代表数据差异不显著(下同)。
2.3.2 诱导时间优化
如图5所示,KlebER2蛋白的表达随着诱导时间的延长先升高后降低,诱导时间为22 h时,蛋白的表达量达到最大值,随着诱导时间的继续延长,KlebER2蛋白的表达量下降,这可能是因为诱导时间过短,重组蛋白积累量较少,表达量较低;当诱导时间过长时,培养基中营养物质减少,目的蛋白在表达的同时被降解,此外诱导时间过长,细菌会出现溶菌现象,也会使蛋白表达量降低[11]。因此,选择诱导时间为22 h进行后续实验。
M:蛋白Marker;泳道1～6依次是:诱导6、10、14、18、22、26 h的上清液。a-KlebER2时间优化SDS-PAGE电泳图;b-KlebER2时间优化SDS-PAGE电泳图灰度值
图5 诱导时间优化
Fig.5 Optimization of induction time
2.3.3 IPTG浓度优化
由图6可知,IPTG浓度对KlebER2蛋白的表达影响较小。当IPTG浓度为0.8 mmol/L时,KlebER2蛋白的表达量达到最大值,之后随着IPTG浓度的增加,KlebER2蛋白的表达量下降。IPTG浓度过低可能导致诱导剂的量不足以与阻遏蛋白结合,从而使蛋白表达量降低,浓度过高又可能会使蛋白表达过快,从而形成包涵体[12]。此外IPTG具有毒性,浓度过高也会影响菌体的生长,添加适量的IPTG既能降低菌体细胞的代谢负荷,也能提高蛋白的表达水平[13]。因此,IPTG的最佳浓度为0.8 mmol/L。
M:蛋白Marker;泳道1～6依次是:IPTG浓度为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L诱导所获得的上清液。a-KlebER2 IPTG浓度优化SDS-PAGE电泳图;b-KlebER2 IPTG浓度优化SDS-PAGE电泳图灰度值
图6 IPTG浓度优化
Fig.6 Optimization of IPTG concentration
2.3.4 诱导转速优化
如图7所示,当诱导转速为100 r/min时,KlebER2蛋白的表达量达到最大值。随着转速的继续增加,蛋白的表达量下降,这可能是由于转速增加,对细胞的机械损伤以及蛋白所受到的剪切力增加,不利于蛋白的正确折叠,从而导致KlebER2表达量降低[14]。因此,KlebER2的最佳诱导转速为100 r/min。
M:蛋白Marker;泳道1～6依次是:诱导转速为100、120、140、160、180 r/min的上清液。a-KlebER2转速优化SDS-PAGE电泳图;b-KlebER2转速优化SDS-PAGE电泳图灰度值
图7 转速优化
Fig.7 Optimization of rotary speed
由图8可知,在浓度为60、80 mmol/L咪唑缓冲液的作用下,均有一条明显且单一的蛋白条带被洗脱,分子质量为35～48 kDa,与预期一致(40.57 kDa),认为是该条带为KlebER2蛋白条带。相比于60 mmol/L咪唑缓冲液的纯化效果,80 mmol/L咪唑缓冲液纯化后的蛋白含量明显增加,表明80 mmol/L咪唑是KlebER2蛋白洗脱的最佳浓度。经计算,1 L发酵液收集的菌体经纯化后能获得23 mg纯酶,酶活力为0.056 U/mg。
M:蛋白Marker;泳道1:粗酶液;泳道2～6依次是:20、40、60、80、250 mmol/L咪唑浓度下的洗脱液。a-KlebER2蛋白纯化SDS-PAGE电泳;b-KlebER2纯化蛋白镍柱洗脱曲线
图8 重组蛋白纯化
Fig.8 Purification of recombinant protein
2.5.1 最适温度和温度稳定性
温度是影响酶活力的一个重要因素,温度过低会影响酶反应速率,酶活力较低,随着温度的升高,底物分子热运动加快,分子碰撞的机会增加,酶活力增加,但温度过高会破坏酶蛋白的结构,导致酶活力降低或失活。如图9-a所示,KlebER2的酶活力随着反应温度的增加呈先升后降的趋势,在30 ℃达到最高值。当反应温度达到40 ℃时,酶活力骤降,这可能是由于温度过高导致酶活力降低[15]。因此KlebER2最适反应温度为30 ℃,这和之前文献所报道的烯还原酶EaER2、PvER1和PvER2最适反应温度相同[16]。
a-最适温度;b-温度稳定性
图9 最适温度和温度稳定性
Fig.9 Optimal temperature and temperature stability
温度稳定性结果如图9-b所示,KlebER2的酶活力随着温度的升高而降低,在孵育温度为20 ℃时,相对酶活力达90%以上,40 ℃孵育后相对酶活力仅剩10%左右,50 ℃孵育后酶基本失活。以上结果表明KlebER2对温度较为敏感,这在一定程度上限制其应用。
2.5.2 最适pH和pH稳定性
pH的改变会使酶的基团发生变化,空间结构发生改变,从而影响酶与底物之间的结合与解离,进而影响酶的催化功能,当酶处于过酸或过碱的环境时,都会造成酶的不可逆的失活[17]。如图10-a所示,KlebER2蛋白的最适反应pH为6.0。在pH 4.0～5.0时,酶活力较低;当pH>6.0时,KlebER2酶活力降低;当pH为10.0时,酶几乎完全失活,这表明KlebER2可能具有严格的pH依赖性,只在很窄的pH范围内起作用,在使用过程中必须严格控制反应系统的pH值[9]。
a-最适pH;b-pH稳定性
图10 最适pH和pH稳定性
Fig.10 Optimal pH and pH stability
KlebER2的pH稳定结果如图10-b所示,KlebER2仅在pH值为6.0～7.0时能够保持较高的酶活力,在其余pH下丧失了大量酶活力,表明KlebER2对pH的耐受性较差。
2.5.3 金属离子和有机溶剂
金属离子可以与酶结合改变酶的构象或者破坏酶的催化活性中心结构,从而影响酶的活力[17]。由图11-a可知,Mg2+、Mn2+以及Ba2+均对KlebER2起促进作用,其中Mn2+的促进作用最为明显,相对酶活力达137%。Ca2+、K+、Fe2+以及Cu2+对KlebER2均有不同程度的抑制,这可能是这些离子影响KlebER2的活性中心结构所致。
a-金属离子;b-有机溶剂
图11 金属离子和有机溶剂
Fig.11 Metal ions and organic solvents
注:P*<0.05为显著,P**<0.01为极显著,下同。
有机溶剂常用于生物催化反应,以增加底物的溶解度,对生物催化反应有重要影响[18]。然而,在某些溶液或试剂中,酶分子结构的化学键可能发生改变,导致活性基团被破坏,从而影响酶的活力[19]。由图11-b可知,KlebER2受有机溶剂影响较大,除丙三醇外,其余有机溶剂均对KlebER2有明显的抑制作用。
2.5.4 底物特异性
如图12所示,KlebER2对多种α-β不饱和双键化合物都具有催化作用[20],在2-环戊烯-1-酮、反式-2-己烯醛、4,4-二甲基-1-环己烯-1-酮为底物的反应体系中,KlebER2的酶活力较高,即对环烯类化合物有良好的催化能力,这与来源于Synechococcus sp.的烯还原酶Syn7942ER的底物特异性相似[4]。其次,KlebER2对香芹酮、柠檬醛、马来酰亚胺、β-紫罗酮、茶香酮以及α-甲基肉桂醛也具有一定的催化作用,对2-环庚烯-1-酮、反式-β-硝基苯乙烯则几乎没有催化能力。
图12 底物特异性
Fig.12 Substrate specificity
2.5.5 辅酶偏好性
烯还原酶能够还原α, β-不饱和烯烃的碳碳双键,同时将NAD(P)H氧化为NAD(P)+,不同的烯还原酶可能具有不同的辅酶偏好性。在本实验中,以香芹酮为底物时,KlebER2更偏好NADH,对NADH的酶活力是NADPH的22倍(图13)。这与来源于无色杆菌(Achromobacter sp.)的烯还原酶Achr-OYE4的辅酶偏好性一致[21]。大多数烯还原酶是偏好NADPH[22],NADPH价格远高于NADH,因此,KlebER2偏好NADH的性质为其工业化应用奠定了良好基础。
图13 辅酶偏好性
Fig.13 Coenzyme preference
二氢香芹酮不仅是一种天然香料,还是一种重要的手性中间体,可用于合成多种活性化合物,常通过烯还原酶催化还原香芹酮的方法合成[20]。为了验证该酶是否具有还原香芹酮生成二氢香芹酮的能力,设置生物催化反应体系为1 mL,由50 mmol/L磷酸盐缓冲液(pH 6.0)、25 μg/mL纯化后的酶、0.5 mmol/L NADH和6 mmol/L香芹酮组成,在30 ℃反应10 h后,使用SPME/GC-MS对转化产物进行测定。结果如图14所示,二氢香芹酮保留时间在27 min左右,对照组在该处并没有明显的峰出现,而实验组在该处出现了明显的峰,说明KlebER2能够催化香芹酮合成二氢香芹酮,具有香芹酮还原酶活力,并且转化率达到50%以上。
a-生物催化GC-MS图;b-转化率
图14 KlebER2生物催化香芹酮合成二氢香芹酮
Fig.14 KlebER2 Catalyzes the transformation of carvone into dihydrocarvone
本研究对Klebsiella sp.O852来源的烯还原酶基因KlebER2进行克隆和异源表达,获得重组KlebER2蛋白,并对重组蛋白表达的条件进行优化,即37 ℃培养菌体浓度OD600值至0.5时,用0.8 mmol/L的IPTG在20 ℃、100 r/min的条件下诱导22 h,可实现蛋白的高表达;使用镍柱亲和层析对诱导后的蛋白进行分离纯化,以80 mmol/L咪唑缓冲液纯化蛋白能在保证蛋白纯度的情况下最大程度的收集KlebER2蛋白;KlebER2的酶学性质研究结果表明,其最适反应温度和pH分别为30 ℃和6.0,该酶对温度和pH较为敏感,在40 ℃孵育3 h后相对酶活力仅剩10%左右,在pH<6.0或pH>7.0的条件下,酶基本失活,这在一定程度上限制其应用,在以后研究中可通过蛋白质工程和固定化技术对KlebER2的稳定性进行改造,以满足工业化生产的需求;此外,Mn2+、Mg2+、Ba2+以及丙三醇对KlebER2表现出明显的促进作用,并且KlebER2对多种不饱和烯烃化合物都具有催化作用,使其应用更为广泛;偏好NADH的特性使其在今后的工业生产中具有明显的经济优势;最后对KlebER2催化香芹酮生成二氢香芹酮进行研究,转化率达50%以上。本研究明晰了烯还原酶KlebER2的性能,为二氢香芹酮的工业化生产奠定基础。
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