红酸汤是中国贵州省西南部苗族的传统发酵制品,以其独特的酸、甜、鲜、辣而闻名,距今已有一千多年历史。经过长时间发展,目前最为流行的红酸汤一般采用红辣椒、番茄、糯米粉、白酒以及大蒜等原料厌氧发酵而成[1]。因其地域意义,在2013年被认定为贵州省地理标志保护产品。发酵的红酸汤含有多种有机酸、氨基酸、矿物质、辣椒素、番茄红素以及维生素等[2],是一种有助于增强免疫系统、促进消化、调节肠道菌群以及维持酸碱平衡的功能性食品[3]。目前,红酸汤已经发展到贵州省以外的地区,广泛应用于生产火锅调料以及酸汤鱼产品中。
色泽、香气和风味是食品的3个关键质量指标,而挥发性芳香化合物又显著影响着消费者对食品风味和质量的整体评价[4]。研究表明,发酵食品的风味与微生物群落密切相关,并且混合发酵、多菌株发酵比单一菌株发酵更有优势[5]。LIU等[6]使用副干酪乳酪杆菌和马克斯克鲁维酵母进行混合发酵,增加了白酸汤的酸度和香气,缩短了发酵周期。杜晓仪等[7]发现肠膜明串珠菌和鼠李糖乳酪杆菌不仅能够较好保留三华李果汁的活性成分和抗氧化水平,还可以提高其理化性能。乳酸菌和酵母菌是最常用的食品发酵微生物,其中不同的菌株之间通过相互作用可以增加产品的酸香、酯香和醇香。然而,利用红酸汤中的优势菌株速成强化发酵的研究却很少。
近年来,顶空固相微萃取-气相色谱-质谱(headspace-solid phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry,HS-SPME-GC-MS)联用技术逐渐被用于食品中挥发性代谢物研究,相对于传统的水蒸气蒸馏法-气相色谱-质谱联用,此方法具有不需要使用有机溶剂进行提取、样品用量少、响应程度高、简便易行、高效省时等特点[8]。
传统发酵生产红酸汤的方法存在发酵时间长、风味品质不稳定等问题,利用优势菌种混合发酵可以解决这些问题,并且有助于改善其品质和风味。因此,本文筛选了2株菌株,其中植物乳植杆菌Lp-1具有产酸特性,印迪卡有孢圆酵母G2-11具有产香特性,对其共同发酵红酸汤的理化性质、有机酸及挥发性香气成分的影响进行了研究,充分探讨对红酸汤进行混合发酵时,所呈现出的典型风格,为贵州红酸汤地方特色产品标准化生产提供了技术支持。
1 材料与方法
1.1 材料
番茄、红辣椒、大蒜、生姜、糯米粉、食盐、老白干白酒,重庆永辉超市。
植物乳植杆菌(Lactiplantibacillus plantarum) Lp-3、印迪卡有孢圆酵母(Torulaspora indica) G2-11菌株,由本实验室筛选。
麦芽汁培养基,杭州百思生物技术有限公司;蛋白胨、琼脂,山东拓普生物工程有限公司;酵母提取物、吐温-80(分析纯)、盐酸萘乙二胺,成都市科隆化学品有限公司;牛肉膏、对氨基苯磺酸、福林试剂、没食子酸、甲醛,上海麦克林生化科技有限公司;亚铁氰化钾,国药集团化学试剂有限公司;乙酸锌、NaNO2,天津市科密欧化学试剂有限公司;乙酸钠、K2HPO4、柠檬酸铵、MnSO4、葡萄糖、MgSO4、NaCl、硼砂(均为分析纯),重庆川东化工集团有限公司。
1.2 仪器与设备
HNYC-211B智能恒温培养振荡器,天津欧诺仪器股份有限公司;SJ-CJ-2FD超净工作台,苏州苏洁净化设备有限公司;ATY224电子天平,日本岛津公司;S210台式pH计,梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司;DW-HL100超低温冷冻冰箱,中科美菱低温科技股份有限公司;YXQ-LS-75Sii立式压力蒸汽灭菌器,上海博讯实业集团有限公司;725型紫外可见分光光度计,上海舜宇恒平科学仪器有限公司;13395H2X普通光学显微镜,德国徕卡公司;1220高效液相色谱仪、8860-5977B气质联用仪、DB-WAX毛细管柱(60 m×0.32 mm×0.25 μm),美国Agilent公司;DVB/CAR/PDMS三极萃取纤维头,美国Supelco公司。
1.3 试验方法
1.3.1 发酵剂的制备
将植物乳植杆菌按3%接种量接种于MRS液体培养基中,35 ℃摇瓶培养18 h。将印迪卡有孢圆酵母按2%接种量接种于麦芽汁培养基中,30 ℃、150 r/min摇瓶培养24 h。随后将上述培养物分别采用冷冻离心机4 ℃、7 000 r/min离心10 min,并重新悬浮于8.5 g/L的无菌生理盐水中,得到浓度为108 CFU/mL的菌悬液,备用。
1.3.2 红酸汤样品制备
将洗净的番茄(50%)、新鲜的红辣椒(28%)、盐(4%)、大蒜(2%)、生姜(4%)、糯米粉(3%)(均为质量分数)等配料混合均匀,95 ℃灭菌15 min,然后用2种发酵方式发酵:使用植物乳植杆菌Lp-1(7%,质量分数)与印迪卡有孢圆酵母G2-11(0.1%,质量分数)混合发酵(复合发酵);传统自然发酵,加入糊精(3%,质量分数)(自然发酵)。在33 ℃环境中密封发酵5 d。在发酵的第0、1、2、3、4、5天采集样品。
1.3.3 pH值和总酸测定
用pH计测定样品的pH值[9]。总酸含量按照GB/T 12456—2021《食品安全国家标准 食品中总酸的测定(含第1号修改单)》中滴定法进行测定。
1.3.4 氨基酸态氮含量的测定
按照GB 5009.235—2016《食品安全国家标准 食品中氨基酸态氮的测定》进行测定。
1.3.5 亚硝酸盐含量的测定
参照GB 5009.33—2016《食品安全国家标准 食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定》进行测定但略有修改[10]。
1.3.6 有机酸含量的测定
参照文献[11]的方法,但略有修改,使用HPLC测定有机酸。称取5 g样品于25 mL容量瓶中,加纯水定容至刻度线,混合均匀后,室温放置10 min,使用0.45 μm水系微孔滤膜对上述上清液进行过滤后,装瓶,采用C18有机色谱柱(4.6 mm×250 mm, 5 μm),柱温40 ℃,检测波长210 nm,进样体积10 μL,流速0.8 mL/min。
1.3.7 香气成分分析
称取1 g红酸汤样品放入20 mL顶空瓶中,置于磁力搅拌器中15 min(80 ℃,500 r/min)。随后用注射器自动抽取200 μL顶空样品,并将其注入以N2为载气的GC进样器中,进样口温度240 ℃,升温程序:初始温度40 ℃,保持2 min,以5 ℃/min升温到220 ℃,保持28 min;载气(He)恒压24.8 psi;SPME手动进样。MS条件:电子电离源;电子能量70 eV;传输线温度280 ℃;离子源温度230 ℃,四级杆温度150 ℃;质量扫描范围29～400 u。
1.3.8 感官评价
对发酵后的红酸汤样品进行了消费者可接受性测试,感官评定主要参照肖欣欣[12]的方法 (采取十分制),评分强度0～10 (0:无;1～2:非常弱;3～4:普通;5～6:较好;7～8:好;9～10:很好)。
1.3.9 统计分析
每个样本均进行3次平行,利用Excel 2010对样本所得数据进行整理计算,采用SPSS 27.0软件进行实验数据统计分析处理。
2 结果与分析
2.1 红酸汤发酵过程中pH与总酸变化
在所有的理化指标中,pH是评价微生物生长状态与代谢产物积累的重要参数[13],这对发酵食品的质量有着重要影响。经过5 d的发酵,复合发酵接种组与自然发酵组pH值分别从(4.20±0.03)降低到(3.16±0.05)和(3.56±0.09)(图1-a),乳酸菌可以将物料中的糖类物质转化为乳酸和其他有机酸,从而降低酸汤样品中的pH。此外,值得注意的是,自然发酵的红酸汤中的pH始终高于复合发酵组,复合发酵组的pH呈现出比自然发酵组更快速的下降趋势,这可能是因为复合组添加了直投式菌种,2株接种的微生物在红酸汤原料中快速繁殖,加速了发酵的进程,而自然发酵组只能利用附着于原材料中的天然菌株进行发酵,所以发酵进程相对缓慢。因此,复合接种发酵能使红酸汤的发酵进程明显加快,其发酵周期也随之缩短,从而显著提升红酸汤的发酵效率。
a-pH值;b-总酸
图1 红酸汤发酵过程中pH值和总酸变化
Fig.1 Changes of pH value and total acid content in the red sour soup fermentation
注:不同小写字母表示组间显著差异(P<0.05)(下同)。
总酸是发酵蔬菜酸味的重要指标[14],主要与微生物对淀粉分解和有机酸代谢有关。如图1-b所示,总酸含量随着发酵时间的增加而不断升高,相对而言,接种了混合菌种的复合发酵组其总酸含量变化更加明显,有着比自然发酵中组更大的酸性物质生成量,为(21.80±1.01) g/kg,而自然发酵为(13.10±0.10) mg/kg,总酸的积累主要来源于乳酸的积累,说明接种发酵可以加快红酸汤中乳酸的产生速率。
2.2 红酸汤发酵过程中氨基酸态氮含量变化
氨基酸态氮也是衡量红酸汤品质的一个重要指标,它直接关系到红酸汤的鲜味强度与营养价值[15]。在红酸汤的发酵过程中,微生物可以将粗蛋白水解成各种氨基酸来赋予红酸汤较好的风味。自然发酵组在发酵初期其氨基酸态氮含量比复合发酵组高,而到发酵后期明显减少,复合发酵组则不断增加(图2)。这可能是因为自然发酵红酸汤在早期的时候,其微生物数量少且生长缓慢,所以导致对溶解到红酸汤中的氨基酸态氮利用率低,而接种组由于前期菌种密度较高,所以在发酵早期优势菌群就已经建立,可以很大程度地利用溶解的氨基酸及小分子多肽来合成细胞相关成分。随着发酵的不断进行,接种组可以不断分解原料中的粗蛋白产生氨基酸态氮,导致其比自然发酵拥有更好的鲜味。
图2 红酸汤发酵过程中氨基酸态氮变化
Fig.2 Changes of amino acid nitrogen in the red sour soup fermentation
2.3 红酸汤发酵过程中亚硝酸盐含量变化
发酵蔬菜或盐渍蔬菜中亚硝酸盐的形成和积累通常会引起食品安全问题。如图3所示,自然发酵组的亚硝酸盐含量在发酵过程中先增加,在第4天达到了最高值即“亚硝峰现象”,这可能是因为自然发酵组中杂菌分泌的硝酸还原酶具有将原料中的硝酸盐还原为亚硝酸盐的能力,发酵5 d后其亚硝酸盐含量为(0.31±0.02) mg/kg。复合发酵组则一直呈现下降的趋势,发酵5 d后其亚硝酸盐含量为(0.03±0.01) mg/kg,这可能是因为在自然发酵过程中有机酸逐渐增多使得环境pH下降,从而导致亚硝酸盐不断降解。而接种组则因为前期菌种密度大,产酸能力强,所以能迅速降低环境中的pH,促进亚硝酸盐降解。
图3 红酸汤发酵过程中亚硝酸盐含量变化
Fig.3 Changes of nitrite in the red sour soup fermentation
2.4 不同红酸汤发酵样品中有机酸分布
有机酸是影响发酵产品风味的主要原因,其组成和含量在很大程度上决定了产品最终的酸度[16]。不仅如此,有机酸还是发酵食品天然的防腐剂。如表1所示,其中复合发酵组的酒石酸、苹果酸、乳酸与乙酸均明显高于自然发酵组,而自然发酵组的柠檬酸和丁二酸高于接种组。新鲜的番茄酸味主要来源于柠檬酸的刺激酸味,经过混合菌种发酵后,会转化为更加柔和的乳酸,苹果酸会给人一种愉悦、爽快的感觉,此外,接种组略多的酒石酸对红酸汤的特征风味也起着不可或缺的作用。
表1 不同发酵模式红酸汤中有机酸含量对比 单位:g/kg
Table 1 Comparison of organic acid content in red sour soup in different fermentation modes
样品酒石酸苹果酸乳酸乙酸柠檬酸丁二酸富马酸自然发酵2.133±0.280h7.427±0.630e14.984±0.848c0.182±0.006i10.934±0.816d6.661±0.061efND复合发酵4.611±0.168g20.114±0.969b24.155±0.757a0.692±0.063i5.901±0.840f2.134±0.055hND
注:不同小写字母表示组间显著差异(P<0.05);ND表示未检出。
2.5 不同红酸汤发酵样品中挥发性化合物分析
为了进一步确定不同发酵模式酸汤中挥发性化合物的差异,采用HS-SPME-GC-MS技术检测了混菌接种发酵与自然发酵香气成分,结果见图4、图5。
a-自然发酵组;b-复合发酵组
图4 红酸汤中挥发性成分的总离子流色谱图
Fig.4 Total ion current of volatile components in red sour soup
图5 不同红酸汤中挥发性风味物质相对含量
Fig.5 Relative content of volatile flavor compounds in different red sour soup
从自然发酵红酸汤中共检测出76种香气成分,相对含量为67.779%,其中醛类、萜烯类、醇类、酯类、酮类、酸类、酚类、醚类及其他类香气成分的相对含量为2.801%、1.183%、34.895%、4.988%、5.699%、2.884%、2.703%、4.463%;从混菌发酵后的红酸汤中检测出97种香气成分,相对含量为88.028%,其中醛类、萜烯类、醇类、酯类、酮类、酸类、酚类、醚类及其他类香气成分的相对含量为11.289%、43.851%、19.220%、3.651%、1.551%、0.950%、1.098%、5.343%、1.075%。
醛类物质主要由不饱和脂肪酸通过酶和微生物氧化以及施特雷克尔降解反应产生[17],醛类物质通常具有使人愉快的青草与水果香味,因其风味阈值较低,从而可以显著影响食品的口感、品质和市场竞争力。本研究在自然发酵红酸汤中检测出10种醛类化合物,其含量为2.801%;接种发酵红酸汤检出7种醛类化合物,其含量为11.289%,经过接种复合发酵后,样品中的(Z)-3,7-二甲基辛-2,6-二烯醛与柠檬醛的含量比自然发酵高很多,相对含量分别为3.928%与6.336%,这使得红酸汤具有浓郁的柠檬香气。
萜烯类化合物主要呈现出花香、果香和木香[18],自然发酵红酸汤中萜烯类化合物明显减少,共检测出5种,含量为1.183%,接种发酵共检测出33种,含量为43.851%,为第一大类化合物,其中相对含量在1%以上的有6种,这可能与微生物的作用有关。其中接种发酵较高含量的姜烯(10.567%)呈现出甜香,α-姜黄烯(14.513%)呈现出清新的柠檬果香,β-红没药烯(6.194%)具有温暖的木香、柑橘香、花香、果香、青香和甜润的香脂香气,α-法呢烯(3.178%)则具有柑橘香气。
醇类物质是微生物通过艾利希途径将氨基酸作为底物转氨脱羧再由醇脱氢酶还原而成[19]。醇类化合物可以使红酸汤香气饱满浓郁,也是主要呈现清香和青鲜香气的酯类化合物形成的先决条件。醇类物质均为2种发酵模式下的红酸汤中的第二大类化合物,自然发酵红酸汤中醇类物质含量为8.163%,含量在1%以上的有2种,接种发酵红酸汤中醇类化合物含量为19.220%,含量在1%以上的有7种,其中都检测到的异戊醇和苯乙醇是酵母菌发酵的特有产物,除了本身具有花香外,还是其他易挥发性化合物的溶剂,这对红酸汤的风味具有重要的双重修饰功能。值得注意的是香叶醇阈值极低,具有甜味、水果味和玫瑰花香,且只在接种发酵红酸汤中有检出,含量较高,为4.765%。此外,阈值低的醇类还有芳樟醇,具有令人愉快的铃兰花香气,这在2种发酵模式的红酸汤中均有检出,但接种发酵含量为1.033%,自然发酵仅为0.337%。香叶醇和芳樟醇由于其较低的阈值成为了接种发酵红酸汤中主要的香气来源,这2种物质是植物中几乎不自带的化合物,主要来源于糖苷的裂解[20]。
酯类物质可以产生令人愉快的甜香与水果风味[21],在本研究中,酯是自然发酵红酸汤中的第一大类化合物,共检出26种,含量为34.895%,而接种发酵中共检测出6种,含量为3.651%。自然发酵中一些酯的含量显著高于接种发酵样品,主要包括十六烷酸丙酯、棕榈酸乙酯、反-9,12-十八碳二烯酸丙酯、柳酸甲酯和亚油酸乙酯,这些酯会呈现微弱蜡香、冬青油、果香和奶油香气的混合香气[22],这赋予了自然发酵红酸汤丰富的甜水果风味。
酚类、醚类及其他化合物也是贡献发酵红酸汤的特征香气的重要挥发性成分。酚类物质在自然发酵中共检测出4种,相对含量为2.884%,其中相对含量在1%以上的为丁香酚,其可以散发比较强烈的丁香香气;在复合发酵中共检测出3种酚类物质,相对含量为1.098%。醚类物质自然发酵中共检测出1种,为对丙烯基茴香醚,相对含量2.703%,具有大茴香样的香气;接种发酵中共检测出10种,相对含量为5.343%,其中相对含量在在1%以上的有2种,以二烯丙基二硫醚含量最高,其次为烯丙基 1-丙烯二硫醚,其都具有大蒜香气。此外,值得注意的是,呋喃化合物主要由氨基酸和还原糖之间的美拉德反应以及氨基酸和硫胺素之间的热解反应产生,并且具有强烈的肉味[23]。本研究仅在自然发酵红酸汤中检测到2-正戊基呋喃。
综上所述,自然发酵红酸汤中共检测出76种香气化合物,其中主要香气化合物为酯类、醇类、酸类物质,主要呈现清香、甜香和微弱酸香气,这与LI等[24]对凯里自然发酵红酸汤的风味特征研究结果类似。接种发酵红酸汤中共检测出97种香气化合物,远远大于自然发酵红酸汤,可以使得红酸汤香气更为丰富,其主要香气化合物为萜烯类、醇类与醛类物质,使得红酸汤呈现出花香、果香、木香、青草香和清香香气,对比自然发酵红酸汤香气更加浓厚。LIN等[25]发现乳杆菌发酵后的红酸汤香气成分主要为酯类、萜烯类和醇类物质,可以使红酸汤香味更浓厚协调。WANG等[26]选用植物乳植杆菌与产朊假丝酵母混合发酵红酸汤后,其香气化合物主要为烃类和醇类物质,可以使酸汤香气更为柔和。
2.6 红酸汤感官品质评价
对自然发酵与复合发酵的2组样品进行感官分析,评价其感官品质。如图6所示,复合发酵红酸汤与自然发酵红酸汤产品色泽描述分数十分相近,均呈鲜红有白、黄色颗粒,但其具有明显成熟番茄辣椒发酵的柔和、酸鲜和辛辣滋味,其酸度、滋味、形态、鲜香香味、辛辣香味和复合香味方面都要优于自然发酵组。此外,其涩味和腐败气味的描述评分都要远低于自然发酵。综上所述,复合发酵可以明显改善自然发酵红酸汤风味贫乏及苦涩和腐败气味的缺点。
图6 不同红酸汤感官品质评价
Fig.6 Sensory quality evaluation of different red sour soup
3 结论
本文使用复合发酵技术充分利用红酸汤原料中各组分,促进糖类、有机酸与氨基酸态氮等风味物质的释放,增加产物的酸鲜底蕴。实验证明,利用植物乳植杆菌与印迪卡有孢圆酵母复合发酵效果明显高于自然发酵的效果,与自然发酵相比,接种混合发酵可以有效提升红酸汤理化性质,快速降低pH与亚硝酸盐含量,增加总酸与氨基酸态氮含量,同时显著提高乳酸与苹果酸2种有机酸含量,丰富红酸汤香气成分,其感官评价分数也更高。混合发酵的红酸汤表现出更强的风味协调性,汤底更浓厚,品质更优。该研究为贵州地方特色产品红酸汤的标准化生产奠定了基础。
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