大豆是一种全球可用且具有成本效益的食品,富含优质蛋白质、膳食纤维和大豆异黄酮等功能性成分,因此,大豆作为开发植物基酸奶的原料具有巨大的潜力[1]。与未发酵的酸奶相比,植物基酸奶具有卓越的感官品质,包括增强的风味和口感,以及显著的健康益处,如抗高脂血症、抗氧化和抗糖尿病特性等[2]。大豆蛋白可以通过将 pH 值调节到其等电点附近来使其凝胶化,减少阻止蛋白质聚集的静电排斥力。然而,大豆蛋白溶液的酸化通常会导致形成具有多孔结构的弱凝胶,从而导致大豆酸奶中出现相分离和不良的质地特性[3]。因此,植物基酸奶的稳定性是食品科学工作者们一直想努力解决的一个重要问题。
乳酸菌发酵不仅可以减少豆类植物的抗营养因子,如单宁、皂苷、植酸、胰蛋白酶抑制剂等[4],而且大部分的乳酸菌株能够合成影响产品流变性质的胞外多糖,良好地改善产品的黏弹性和质地,可成为食品添加剂的替代品。植物乳杆菌属、乳杆菌属、乳球菌属、明串珠菌属、片球菌属、链球菌属、魏氏菌属等不同种属的细菌均能够合成各种胞外多糖。尤其魏氏菌属菌株高产胞外多糖,且以产葡聚糖为主。魏氏菌属菌株合成葡聚糖蔗糖酶并分泌到胞外,催化蔗糖水解为葡萄糖和果糖,随后聚合葡萄糖形成葡聚糖[5]。胞外多糖可以与酸奶中的蛋白质相互作用形成二元混合凝胶,调节酸奶凝胶的结构,提高酸奶的稳定性和口感[6]。此外,多糖的类型会改变其与蛋白质的相互作用,从而影响多糖-蛋白质凝胶的质量[7]。当多糖掺入蛋白质中时,它们可以形成相互渗透、偶联或相分离的凝胶网络,从而改变蛋白质-多糖凝胶的物理化学性质。蛋白质和多糖之间的共价键、氢键、静电相互作用、疏水相互作用以及范德华力在维持凝胶系统中起着重要作用[8]。
最近研究表明,魏氏菌属因其在发酵食品中表现出良好的稳定性而受到广泛关注。LIU等[9]利用融合魏斯氏菌发酵藜麦酸奶,改善了产品的质地、流变特性和储存稳定性;HUANG等[10]将分离筛选出的融合魏斯氏菌发酵豆奶,使得酸豆奶的持水性和黏度显著增加;JIAN等[11]用融合魏斯氏菌的原位葡聚糖生产开发植物基奶酪,发现最大限度地提高了产品的硬度和黏弹性。随着大众对健康问题的越加重视,植物乳及其发酵制品越来越受到关注,但其乳清易析出和稀薄的口感令消费者不满意。虽然食品胶体等添加剂的加入在一定程度上改善了产品的口感和稳定性,但这与大众对具有较少添加剂的天然和健康产品的日益需求相矛盾。
前期的研究中筛选分离出1株融合魏斯氏菌SY628,研究发现其具有高产胞外多糖的特性。因此,本研究旨在通过发酵手段实现生产零添加稳定剂的植物基大豆酸奶,响应市场需求。本文分析了融合魏斯氏菌SY628发酵不同豆浆蛋白浓度凝固型大豆酸奶的质构、持水力、粒径分布、流变学特性、分子间作用力和微观结构,探讨了形成稳定凝胶结构的浅层次原因。本研究将有助于开发稳定的“清洁标签”凝固型大豆酸奶,并为融合魏斯氏菌在发酵食品中的广泛应用奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料和试剂
非转基因东北大豆,采购于湖南邵阳农产品交易市场。融合魏斯氏菌(Weissella confusa)SY628来自邵阳学院豆制品加工与安全控制湖南省重点实验室;乙醇、NaCl、KH2PO4、NaOH等均为分析纯,国药集团化学试剂有限公司。
1.2 仪器设备
高浓精磨机,正达精研制造有限公司;TA1质构仪,英国Lloyd公司;UDK139 凯氏定氮仪,北京市盈盛恒泰科技有限公司;DHR-2旋转流变仪,美国TA公司;WJL-628激光粒度,上海仪电物理光学仪器有限公司;T-8 紫外分光光度计,南京菲勒仪器有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 凝固型大豆酸奶的制备
大豆浸泡后分批进行磨浆、煮浆、过60目筛,采用糖度计(豆浆专用)测量豆浆浓度,用凯氏定氮法测量蛋白质浓度,绘制糖度豆浆浓度-蛋白质浓度曲线。利用该曲线,根据豆浆浓度计算调配后的豆浆蛋白质浓度;根据预实验的结果和市面酸奶蛋白质含量,调配豆浆蛋白质量分数为2.5%(SY2.5)、3.0%(SY3.0)、3.5%(SY3.5)3个梯度,随后固定加入9%的碳源(蔗糖),罐装后在85 ℃下灭菌20 min,冷却至45 ℃以下,以W.confusa SY628作为发酵剂,按3%进行接种,发酵温度为35 ℃,发酵8 h形成凝乳,发酵后放入冰箱冷藏后熟24 h即可得到成品。
1.3.2 大豆酸奶理化指标
参照 GB 5009.5—2016《食品安全国家标准 食品中蛋白质的测定》测定蛋白质含量;参照 GB 5009.6—2016《食品安全国家标准 食品中脂肪的测定》测定脂肪含量;参照GB 5009.88—2023《食品安全国家标准 食品中膳食纤维的测定》测定膳食纤维含量;参照GB 5009.237—2016《食品安全国家标准 食品pH值的测定》测定 pH 值;参照 GB 5009.239—2016《食品安全国家标准 食品酸度的测定》测酸度;多糖含量的测定参照BOUROUIS等[3]的方法。
1.3.3 质构分析
采用P35圆柱形探头,TPA模式测试,预载应力0.05 N,压缩百分比0.4,压缩速度和提升速度分别为60 mm/min和50 mm/min。
1.3.4 持水性分析
大豆酸奶的持水性采用离心法进行测定。空离心管 (50 mL)的质量记为m1。将大豆酸奶(20 g)放入上述离心管中,记录质量为 m2,将离心管中的样品在10 000×g、4 ℃离心 20 min。除去上清液,记录质量为m3。持水性按公式(1)计算:
持水性
(1)
1.3.5 流变学特性
根据XIE等[12]的方法,使用旋转流变仪测定大豆酸奶的流变特性。测试在1%应变的线性黏弹性区进行,同时保持温度为25 ℃。频率范围为0.1～10 Hz,剪切速率从0增大到500 s-1。
1.3.6 粒度分析
参照ZHANG等[13]的方法进行分析。
1.3.7 表面疏水性
采用ZHANG等[13]的溴酚蓝(bromophenol blue,BPB)结合法测量大豆酸奶的表面疏水性,并进行了一些修改。将1 mL大豆酸奶干粉悬浮液(10 mg/mL)加入200 μL BPB(1 g/L),超声波处理30 min。摇匀后,5 000×g离心10 min,将上清液稀释10倍,在595 nm处测定吸光度。空白样品用10 mmol/L PBS(pH 7.0)代替1 mL大豆酸奶冻干粉悬浮液。表面疏水性以结合BPB的量(μg)表示,按公式(2)计算:
表面疏水性/(μg bound BPB)=(空白吸光度-上清液吸光度)/空白吸光度×200
(2)
1.3.8 分子间作用力
参照GAO等[14]的方法进行分析。
1.3.9 活菌数
参照 GB 4789.2—2022《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》进行测定,计数单位为 lg CFU/mL。
1.3.10 微观结构
参照GAO等[14] 的方法,采用扫描电镜分析大豆酸奶的微观结构。
1.4 数据统计分析
所有测量均在3个独立的重复中进行,最终结果表示为多个样本的“平均数±标准偏差”。使用SPSS 21软件对数据进行统计学分析,P<0.05 为有统计学意义,用Origin 2021软件进行绘图。
2 结果与讨论
2.1 凝固型大豆酸奶主要营养成分分析
对采用不同豆浆蛋白质量分数2.5%、3.0%、3.5%制备的凝固型大豆酸奶SY2.5、SY3.0和SY3.5进行了主要营养成分分析,如表1所示。随着原料豆浆蛋白含量的增加,成品大豆酸奶的蛋白质含量由(5.22±0.24) g/100 g增加到了(7.37±0.06) g/100 g,多糖含量由(1.92±0.1) g/100 g增加到了(2.48±0.16) g/100 g、总膳食纤维含量由(5.25±0.14) g/100 g增加到了(8.33±0.15) g/100 g;与之相反,脂肪含量呈下降的趋势。这与VICENT[15]研究香蕉粉对大豆酸奶的营养成分的影响结果一致。多糖和蛋白质大分子结合,影响水性胶体的基本性质,并起到填充材料的作用。由于SY3.5样品中的蛋白质、多糖含量显著高于SY3.0和SY2.5,能够包裹更多的脂肪在基质中,从而导致脂肪含量检出数据(1.52±0.10) g/100 g分别小于SY2.5的(7.50±0.14) g/100 g和SY3.0的(3.47±0.06) g/10 g样品。脂肪的存在可以抑制酸奶凝胶网络结构的形成,而蛋白质的存在可以促进它们的形成,从后续的研究结果可知,SY3.5形成了更致密的凝胶结构。
表1 不同豆浆蛋白浓度大豆酸奶的营养成分 单位:g/100 g
Table 1 Nutritional composition of soybean yogurt with different soy milk protein concentrations
样品蛋白质脂肪含量多糖含量总膳食纤维SY2.55.22±0.24c7.50±0.14a1.92±0.10c5.25±0.14cSY3.06.58±0.09b3.47±0.06b2.10±0.04b6.78±0.50bSY3.57.37±0.06a1.52±0.10c2.48±0.16a8.33±0.15a
注:同列不同字母表示差异显著(P<0.05)(下同)。
2.2 凝固型大豆酸奶质构和持水性分析
质地特性是酸奶质量的重要指标。如表2所示,随着蛋白质浓度的增大,样品的凝聚力、弹性、硬度、咀嚼性和韧性都呈显著增大趋势(P<0.05);持水性从(95.97±0.42)%增加到(99.64±0.15)%,均大大高于使用其他发酵剂发酵的植物酸奶。LI等[16]通过对比不同菌株发酵大豆酸奶,研究发现嗜酸乳杆菌 N4 在网络结构中保留更多的水,持水力为52%左右。SY2.5、SY3.0、SY3.5样品中多糖和蛋白质含量的差异是影响大豆酸奶的质地和持水性的主要原因。本研究结果显示大豆酸奶表现出较高的质地属性,一方面归因于益生菌增殖和代谢活动过程中细胞外多糖的产生,增强了酸奶的稳定性,并与其他成分相互作用,增加酸奶基质内蛋白质底物的刚性[17]。另一方面归因于大豆蛋白聚集,从而有助于形成更强的 3D 凝胶网络,同时大豆蛋白和多糖形成的微凝胶导致这种3D 凝胶网络能够包含更小、更均匀的孔,从而增强了其整体稳定性[3]。
表2 不同豆浆蛋白浓度大豆酸奶的质构和持水性
Table 2 Texture and water-holding capacity of soybean yogurt at different soy milk protein concentrations
样品凝聚力/mm弹性/mm硬度/g咀嚼性/g韧性/g持水性/%SY2.51.58±0.004c0.89±0.49c6.77±0.04c2.03±0.14c6.77±0.001c95.97±0.42bSY3.02.44±0.100b1.43±0.22b8.98±0.06b6.19±0.17b7.43±0.001b97.13±0.81bSY3.53.74±0.003a2.28±0.26a11.62±0.03a11.65±0.11a11.84±0.001a99.64±0.15a
2.3 凝固型大豆酸奶流变学特性分析
如图1所示,SY2.5、SY3.0、SY3.5样品的储能模量(G′)均高于损耗模量(G″),如图1-a、图1-b所示,这是凝胶网络的典型特征,表明融合魏斯氏菌产生的多糖可以在大豆酸奶环境下形成连续的聚合物网络,表现出黏弹性固体行为,样品从黏弹性液体到稳定黏弹性固态的转变。可能是由于酸奶培养物产生的胞外多糖通过与蛋白质相互作用起到质化剂的作用,从而增加了蛋白质网络的刚性[18]。SY3.5表现出最高的储能模量(546.30±0.10) Pa和损耗模量(124.10±0.05) Pa,表明建立了更强的蛋白质-多糖相互作用。HUANG等[19]的研究表明,含有胞外多糖的酸奶与凝胶结构的蛋白质之间的相互作用具有更高的储能模量,这与本文的研究结果相一致。蛋白质含量高的凝胶网络交联更强,导致结构更坚固,储能模量值更高[20]。同时,较高的蛋白质含量增加了凝胶网络中的颗粒数量和蛋白质分子中的分支,导致凝胶结构的G′更高[21]。如图1-c所示,SY2.5、SY3.0、SY3.5三类样品的损耗正切值均<1,表示3类样品均具有弹性的固体样行为,这与其他的豆类蛋白酸奶的流变特性研究结果一致[22]。如图1-d所示,3类样品的表观黏度与剪切速率呈负相关,SY3.5的黏度显著高于SY3.0和SY2.5,SY3.5的黏度从(407.03±0.02) Pa·s下降至(2.31±0.15) Pa·s,3类大豆酸奶均具有剪切稀化行为。随着剪切速率的增加,蛋白质网络和微凝胶的变形、解缠和/或解聚,减少了大豆酸奶中的摩擦损失,从而降低了它们的黏度。
a-储能模量;b-损耗模量;c-损耗正切;d-剪切速率
图1 不同豆浆蛋白浓度大豆酸奶的流变特性
Fig.1 Rheological properties of soybean yogurt at different soy milk protein concentrations
注:玫红色线为SY2.5;橙色线为SY3.0;绿色线为SY3.5。
2.4 凝固型大豆酸奶粒度分布
粒径分布可以直观反映出聚集体的大小和蛋白聚集的程度。如图2所示,SY2.5、SY3.0、SY3.5三类样品的粒径分布均呈现双峰,并出现蓝移现象。
图2 不同豆浆蛋白浓度大豆酸奶的粒径分布
Fig.2 Particle size distribution of soybean yogurt with different soy milk protein concentrations
第一阶段的峰值粒径分布在11～27 μm,此阶段多糖-蛋白质的分子间相互作用较弱,粒径分布较为分散,导致蛋白质聚集的程度降低;第二阶段的峰值粒径分布在42～114 μm,随着粒度的增大,出现团聚峰,峰值更大。SY3.5呈现较大和较宽的峰值,这可能是随着颗粒分布变得越来越均匀,使得暴露的蛋白质具有聚集倾向的序列,其多糖可以通过共价键相互作用吸附到蛋白质上,能够桥接多个蛋白质分子进一步聚集成更大的蛋白质-多糖复合物[23]。基于上述结果,推测3类样品中的大豆多糖分子与水竞争并导致蛋白质聚集增加。
2.5 表面疏水性
表面疏水性反映了蛋白质分子表面疏水基团的数量,也与蛋白质的结构相关[24]。如图3所示,高蛋白浓度豆浆发酵的大豆酸奶SY3.5表面疏水性最低(189.0±0.05) μg bound BPB,这可能是由于该样品中的多糖含量高(表1),黏度更大,形成聚集体覆盖了蛋白分子表面的疏水基团。但与SY3.0样品的表面疏水性(194.53±0.02) μg bound BPB没有显著性差异;SY2.5样品的表面疏水性最大(198.83±0.20) μg bound BPB,与SY3.5和SY3.0的表面疏水性存在显著性差异(P<0.05),可能是因为SY2.5样品中的蛋白质分子暴露出更多的疏水基团。
图3 不同豆浆蛋白浓度大豆酸奶的表面疏水性
Fig.3 Surface hydrophobicity of soybean yogurt with different soy milk protein concentrations
2.6 分子间作用力
大豆酸奶凝胶的形成及其质地特性主要取决于分子间相互作用,包括离子键、氢键、疏水相互作用和二硫键,由图4可知,随着蛋白浓度的增加,二硫键先下降后升高,起到主导地位,其次是疏水相互作用,而氢键和离子键相对较低,这表明二硫键是导致大豆酸奶形成凝胶的主要分子力。SY2.5的二硫键显著高于SY3.0和SY3.5(P<0.05),表现出还原的状态,阻碍蛋白质网络的连接[2],从图5外观结构来看,SY2.5的质地比SY3.0、SY3.5柔软。蛋白质分子的构象相对较为舒展,巯基暴露较高,导致二硫键的形成,因此蛋白质-多糖之间的二硫键赋予了大豆酸奶特殊的结构。
图4 不同豆浆蛋白浓度大豆酸奶分子间作用力的构成
Fig.4 Composition of intermolecular forces in soybean yogurt with different soy milk protein concentrations
a-外观;b-微观形态
图5 不同豆浆蛋白浓度大豆酸奶的外观和微观形态
Fig.5 Appearance and scanning electron microscopy of soybean yogurt with different soy milk protein concentrations
2.7 凝固型大豆酸奶外观及微观结构
如图5-a所示,所有大豆酸奶都未观察到明显的乳清析出现象,均具有光滑的外观,高蛋白浓度SY3.5呈现出更为浓稠、紧密的质地,色泽更近于豆浆的颜色,而低蛋白浓度SY2.5质地更细腻、柔软,弹性更好。
大豆酸奶的微观结构如图5-b所示,3类大豆酸奶样品的表面均具有光滑的层状结构,制成的凝胶在凝胶化时都表现出聚集的蛋白质网络,蛋白质簇比较密集,彼此都很接近。SY2.5的系统分散更均匀,SY3.0大豆酸奶致密平整并伴有微小气孔;SY3.5大豆酸奶的凝胶出现裂痕,导致形态比较松弛。研究发现在发酵样品中观察到成分的连续和聚合性能,聚集可能归因于黏附在蛋白质和表面的多糖,这导致形成了稳定和黏稠的网络[9]。简而言之,多糖与蛋白质结合可以改善凝胶结构的形成。
2.8 凝固型大豆酸奶储藏期pH、酸度、活菌数、持水力的变化
对不同豆浆蛋白浓度(SY2.5、SY3.0、SY3.5)的大豆酸奶在储藏期(0、7、14、21、28 d)的pH、酸度、活菌数、持水性变化进行了分析,结果见表3。储藏0～28 d,各组pH均显著降低(P<0.05),储藏0 d,SY2.5的pH值为(6.20±0.02)、SY3.0为(5.71±0.01)、SY3.5为(5.42±0.06),随着储藏时间的延长,3类凝固型大豆酸奶的pH均呈逐渐下降的趋势,这可能是W.confusa SY628增加了有机酸的产生;总酸度储藏28 d,SY2.5的TTA为(66.72±0.02) °T、SY3.0为(68.05±0.42) °T、SY3.5为(70.04±0.50) °T,总酸度随储藏时间的推移而不断增加,且蛋白浓度越高,总酸度越高,这是因为高蛋白浓度豆浆和W.confusa SY628结合能提供更多的营养物质,使储藏过程中蛋白质分解慢,导致酸度显著高于SY3.0和SY2.5;活菌数在储藏过程中先升高后下降,储藏第7天活菌数处于生长期,14 d进入衰退期,但菌落数都高于106CFU/mL,符合国际标准中的乳制品要求。储藏0～28 d持水性呈缓慢下降的趋势,说明W.confusa SY628产生的多糖能够利用豆浆中的蛋白形成网络紧密的凝胶结构。
表3 不同豆浆蛋白浓度大豆酸奶储藏期间的理化特性
Table 3 Physicochemical properties of soybean yogurt during storage at different soy
milk protein concentrations
储藏期样品0 d7 d14 d21 d28 dpHSY2.56.20±0.02a5.33±0.14a4.62±0.35a4.37±0.05a4.11±0.05aSY3.05.71±0.01b4.98±0.05b4.53±0.15b4.21±0.01b3.95±0.16bSY3.55.42±0.06c4.64±0.05c4.24±0.12c4.19±0.15c3.62±0.05cTTA/°TSY2.547.95±0.01c60.50±0.14c63.85±0.02c64.75±0.01c66.72±0.02cSY3.050.45±0.02b62.60±0.15b65.20±0.05b66.50±0.05b68.05±0.42bSY3.552.90±0.05a64.70±0.02a66.15±0.01a67.70±0.02a70.04±0.50a活菌总数/(lg CFU/mL)SY2.58.28±0.14c8.33±0.15c8.19±0.05c7.62±0.08c7.16±0.01bSY3.08.31±0.42b8.35±0.14b8.28±0.35b7.67±0.21b7.19±0.05bSY3.58.38±0.57a8.40±0.42a8.34±0.14a7.74±0.14a7.31±0.03a持水力/%SY2.595.97±0.42b95.78±0.11b95.53±0.45c95.37±0.04b95.29±0.05bSY3.097.13±0.81b97.02±0.02b96.93±0.07b96.79±0.05b96.54±0.16bSY3.599.64±0.15b99.54±0.05a99.35±0.38a99.38±0.21a99.27±0.04a
3 结论
本研究通过融合魏斯氏菌发酵的手段,在不添加任何稳定剂的工艺条件下,制备了耐剪切、稳定性好、无乳清析出的凝固型大豆酸奶,实现了大豆酸奶的清洁生产。研究发现融合魏斯氏菌SY628在发酵大豆酸奶过程中产生的胞外多糖不仅能与大豆蛋白紧密结合,而且显著提高其表观黏度、弹性和抗变形性,降低凝固型大豆酸奶乳清分离的敏感性,提高凝胶的稳定性和持水性。另外,更高的豆浆蛋白浓度(SY3.5)使大豆酸奶的凝聚力、弹性、硬度等质地特性增强,持水性提高,蛋白质-多糖作用也更强。这表明融合魏斯氏菌SY628产生的原位多糖代替稳定剂或增稠剂在改善发酵大豆和其他植物基乳制品的质地方面具有潜在的应用价值,这在降低生产成本的同时还能满足消费者对“清洁标签”植物基酸奶的需求。这一研究结果为“清洁标签”的植物基酸奶开发提供新的策略和数据理论参考。
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