牦牛曲拉中益生菌多样性及其功能特性研究进展

曲拉是一种高原藏区传统发酵乳制品,在藏语中意为“奶渣”,是藏族牧民的传统主食之一。曲拉以牦牛奶为单一原料,经脱脂、自然发酵、脱水、后熟及干制等传统工艺制作而成,具有营养价值丰富、便于长期保存的特点。牦牛曲拉作为一种传统发酵乳制品,以往研究多集中于其富含的各种生物活性肽。然而,近年来研究表明,牦牛曲拉还具有丰富而独特的微生物资源,这些微生物不仅能通过产酸、水解蛋白等代谢活动影响发酵进程,还可通过分泌抗菌肽、短链脂肪酸等生物活性物质调节肠道菌群平衡、改善肠道炎症等。随着对这些益生菌功能特性研究的不断深入,曲拉中富含的益生菌在食品、生物、医药等领域的应用前景愈发广阔,本文系统总结了牦牛曲拉中益生菌的多样性及其功能特性方面的研究进展,包括牦牛曲拉的营养成分、发酵工艺、主要微生物组成以及健康效益,以期为深入探索牦牛曲拉的益生菌资源应用提供理论支持,助力民族特色食品的现代化开发。

1 牦牛乳及牦牛曲拉

牦牛曲拉是一种源自青藏高原的传统发酵乳制品,以牦牛乳为单一原料,经加工制作后呈现出白色或淡黄色的固态质地。牦牛乳因其显著的营养优势被称为“天然浓缩乳”,其蛋白质、脂肪、乳糖等成分的含量高于普通牛乳。具体而言,牦牛乳中蛋白质含量约为5 g/dL,远高于普通牛乳(3 g/dL)及人乳(1.1～1.3 g/dL)。此外,牦牛乳中氨基酸组成接近人体所需氨基酸的比例,其必需氨基酸/总氨基酸比值约为47%,必需氨基酸/非必需氨基酸比值约为93%。牦牛乳还富含多种维生素和矿物质,与普通牛乳相比,其维生素A含量高出约6%,钙含量高出约15%[1-2]。除常规营养成分外,牦牛乳也含有丰富的免疫球蛋白和乳铁蛋白等免疫活性物质,进一步提升了牦牛乳的健康价值。

由于牦牛饲养相对分散,鲜牦牛乳的贮藏和运输较为困难,因此当地牧民通常会将采集到的牦牛乳制成曲拉等奶制品。与新鲜牦牛乳相比,曲拉具有更好的耐储存性和便于运输的特性。据统计数据显示,我国每年牦牛乳产量约为113.57万t,其中约75%的牦牛乳被用于发酵制作曲拉[3]。在中国乃至全球范围内,只有青藏高原地区的牧民有将牦牛乳制成曲拉的独特习俗,这使得牦牛曲拉成为我国极具民族特色和地域代表性的食品资源[4]。源自牦牛乳的曲拉营养成分丰富,具有高蛋白、低脂肪、高钙的特点,其蛋白质含量高达75%,脂肪含量较低,一般在4%～7%。此外,牦牛曲拉的钙含量十分丰富,每1 000 g曲拉中钙含量可达15.7 g[5]。随着现代经济水平及科学技术的快速发展,当地农牧民通常会直接食用曲拉,或者将其添加到糌粑中以提升口感和营养价值。目前曲拉除了作为牧民的日常食品,还被作为我国干酪素生产的主要原料,进一步作为食品添加剂或品质改良剂广泛应用于食品、医药、轻工等领域[6-7]。

2 牦牛曲拉的发酵制作工艺

2.1 传统牦牛曲拉制作工艺

西藏传统牦牛曲拉的生产工艺主要包括以下几个步骤,首先是将生牦牛乳通过纱布进行过滤;随后,借助手摇式奶油分离机脱离乳脂,得到脱脂乳。将脱脂乳倒入专用木桶中,并加入少量含发酵菌种的曲拉成品,使其在自然条件下进行发酵。此后将发酵混合乳加热,再用纱布过滤取凝固乳。最后,采用吊挂的方式,利用重力去除乳块中的乳清液,然后摊开晾晒干燥即获得曲拉成品(图1)[5]。然而,这种传统生产工艺存在一些局限性。由于生产方式较为粗放,产量较低,难以满足大规模需求。此外发酵过程中容易出现杂菌交叉污染,导致发酵优势菌生长慢,酪蛋白凝固差等。同时,杂菌还容易产生不良风味物质,从而影响曲拉整体品质。

2.2 现代改良牦牛曲拉发酵制作工艺

牦牛曲拉作为一种发酵乳制品,其发酵阶段对于整个曲拉的品质具有不可忽视的影响。为了克服传统发酵工艺的不足,现代制作工艺常采用商业发酵剂代替传统乳清发酵。文鹏程等[8]利用响应面Box-Behnken 中心组合试验优化曲拉发酵菌种方案,得到效果较优的组合式发酵剂方案为德氏乳杆菌保加利亚亚种(MGD1-3)3.06%、唾液链球菌嗜热亚种(MGB39-5)0.64%、唾液链球菌嗜热亚种(G81-1)0.55%、植物乳植杆菌(BM5152)2.04%;为了便于实际操作,确定最终接种体积比为:MGD1-3∶MGB39-5∶G81-1∶BM5152=30∶6∶5∶20,接种量体积分数为6.0%。在此菌种复配组合条件下,得到滴定酸度为74.21°T、脱脂牦牛乳达到酸凝所需时间是传统发酵时间的1/3、发酵凝固物风味物质双乙酰和乙醛含量分别显著增加了3.53 mg/L和1.29 mg/L;硬度和咀嚼性均显著增大,胶黏性显著降低,凝固效果较好[9]。此外,为实现牦牛曲拉标准化、规模化和机械化生产,杨飞艳等[5]制定了西藏牦牛曲拉加工技术规程,将脱脂牦牛乳采用巴氏杀菌(85 ℃,12 min)进行灭菌和钝化脂肪氧化酶及过氧化物酶。待杀菌结束,冷却至30～35 ℃,接种乳球菌和乳杆菌复配菌种冻干粉0.2%～0.4%,发酵时间10～15 h。当发酵脱脂牦牛乳pH值接近4.6时,终止发酵,即将发酵脱脂牦牛乳加热100 ℃,杀菌时间5 min,接着迅速冷却至常温,获得牦牛乳发酵凝固物。

3 牦牛曲拉中微生物的鉴定

传统牦牛曲拉中微生物的鉴定方法包括形态学观察和生化分析[10]。其中,形态学观察包括菌落形态、革兰氏染色以及显微镜检形态;生化分析则包括检测是否产H2S以及酶活性测试(如过氧化氢酶、氧化酶、脲酶)等。传统鉴定乳制品中微生物的方法多以形态学为主,结合生理生化特性研究,这些表型结果常因培养条件、种间菌株生化特征相似等因素而出现偏差和错误,对同种内菌株之间的鉴定较困难,也难以获得培养困难或痕量微生物,也无法全面展现环境中微生物种群结构的完整结构及生态关系等[11]。

高通量技术作为一种非培养手段,能够在不偏向优势菌群的情况下,全面检测微生物群落的整体组成,更加真实、客观地揭示微生态系统中的细菌群落结构特征,近年来已逐渐成为研究微生物组成及结构的重要手段[12-13]。其中,16S rRNA基因测序能够对菌株进行初步的分类鉴定及系统发育分析[14],宏基因组测序可进一步揭示曲拉中微生物群落的组成结构(包括优势菌群种类及其相对丰度)。针对单一分离菌株的全基因组测序,则可进一步注释其携带的抗生素耐药基因和毒力因子基因,为菌株的安全性评估提供关键分子依据[15-16]。在此基础上,比较基因组学可通过多菌株基因组的共线性比对,识别耐药性相关功能基因的保守性区域,有助于筛选潜在的靶向抑制剂[17]。通过转录组学和液相色谱-质谱分析在内的多组学技术进行功能表达验证,可进一步深化对其菌群结构的理解[18]。此外,基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术因快速准确的特点,正逐步应用于乳源微生物的鉴定[19]。

4 牦牛曲拉中微生物组成

4.1 牦牛曲拉中主要细菌群落组成

多项研究对曲拉的细菌群落组成结构进行了深入分析[20-23]。在门水平上,厚壁菌门(Firmicutes)和变形菌门(Proteobacteria)是曲拉微生物群落中的主要优势细菌门,二者约占曲拉样品中细菌菌落总数的90%以上。此外,放线菌门(Actinobacteria)和拟杆菌门(Bacteroidota)等也存在于曲拉样品中,但相对丰度较低。在科水平上,Lactobacillaceae(乳杆菌科)、Acetobacteraceae(醋酸杆菌科)、Streptococcaceae(链球菌科)和Enterococcae(肠球菌科)是曲拉的优势科。在属水平上,乳球菌属(Lactococcus)或乳杆菌属(Lactobacillus)是多数产地曲拉样品中的优势菌属,这2种菌均属于乳酸菌,广泛存在于发酵乳制品中。除此之外,曲拉样品中还检测到明串珠菌属(Leuconostoc)、醋酸杆菌属(Acetobacter)、链球菌属(Streptococcus)、肠球菌属(Enterococcus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、沙雷氏菌属(Serratia)等其他菌属[24]。不同的微生物组成可能会影响其代谢产物的种类和含量,进而导致曲拉的营养成分和风味差异。例如,乳杆菌属(Lactobacillus)表达的酶能够分解苯丙氨酸和酪氨酸,生成芳香化合物,赋予曲拉独特的香气[25]。

4.2 牦牛曲拉中主要真菌群落组成

在传统乳制品发酵过程中,真菌特别是酵母菌常作为重要的附属发酵剂,在自然发酵阶段或后熟过程中对乳制品风味产生显著影响。因此,曲拉的真菌群落组成结构也受到了广泛关注。在门水平上,子囊菌门(Ascomycota)和担子菌门(Basidiomycota)是曲拉真菌群落中的主要优势真菌门[26]。然而,在属水平上,不同的研究结果存在一定差异。卿蔓君等[27]通过分离纯化曲拉中的微生物,发现毕赤酵母属(Pichia)和酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)是其优势菌属。马江[28]对9份曲拉样品进行真菌分类鉴定后,发现毕赤酵母属(Pichia)和双足囊菌属(Dipodascus)为共有优势属,其平均相对丰度分别为26.64%和11.40%。此外,薛蓓等[29]研究了不同海拔地区曲拉样品的真菌群落,发现地霉属(Geotrichum)是不同海拔样品中共有的优势属,占比约33.8%,除此之外,低海拔组优势菌属为曲霉属(Aspergillus)和青霉属(Penicillium),中海拔地区优势菌属为毕赤酵母属(Pichia),而高海拔组为青霉菌(Penicillium)。与其他传统牦牛发酵乳制品(如酥油、酸奶)相比,曲拉中细菌及真菌群落多样性最高,且群落分布均匀[22,30],这一特点可能与曲拉独特的发酵工艺和环境因素密切相关。

4.3 影响曲拉中微生物菌群的主要因素

传统曲拉多采用天然发酵方式,其菌群构成容易受到多种因素影响,包括牦牛乳的质量、环境温度、湿度及发酵时间等。这些因素的差异导致不同产区的曲拉呈现出独特的微生物菌群特征[20,23]。此外,储藏时间和工艺也是影响菌群多样性的重要因素,研究表明西藏新鲜(软)曲拉的细菌多样性通常高于西藏干燥(硬)曲拉[12];然而另一项研究发现,云南曲拉在存储2周时细菌丰富度低于储存1个月的样本[20],这种差异可能和地域环境与制作工艺的综合影响有关。此外,薛蓓等[29]的研究还发现,随着海拔升高,曲拉中细菌的多样性与丰富度指数都呈现下降趋势。

4.4 曲拉制作过程中微生物的动态变化

张蓓[31]对曲拉制作过程中的微生物群落变化进行了探究,覆盖了从原料乳到乳清液、酸化后的乳清液、煮沸后的湿曲拉以及干曲拉等各个制作阶段。研究结果表明,在整个曲拉制作过程中,总体上酵母菌始终为优势菌群,尤其在酸化阶段,其数量达到峰值。与此同时,乳酸菌数量显著增加,而丝状真菌在整个加工过程中基本保持稳定,大肠杆菌和好氧性细菌的数量则显著减少。具体而言,肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteriodes)在整个曲拉制作过程中始终为优势菌种。此外,植物乳植杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)和清酒广布乳杆菌(Lactobacillus sakei)是原料乳中固生的乳酸菌种类,在曲拉的制作过程中,这3种乳酸菌起主导作用,在推动发酵进程和塑造曲拉的独特风味和质地方面具有重要作用[31]。

5 牦牛曲拉中益生菌的健康效益

随着微生物学与发酵技术的不断发展,多种功能性菌株已从牦牛曲拉中被成功分离并鉴定出来,这些菌株被证明具有潜在健康效益。表1总结了从牦牛曲拉中分离出的功能性菌株及其主要特性,这些菌株包括乳酸菌、酵母菌等菌群,它们在抑菌作用、抗氧化能力、改善肠道炎症、抗肥胖等多个方面展现出功能特性。这些功能性菌株的发现,不仅为深入研究牦牛曲拉中益生菌的功能特性提供了重要基础,也为开发功能性食品及相关应用提供了丰富的菌种资源。

5.1 抑菌作用

抑菌作用是益生菌为生物体提供保护的重要能力之一,特别在塑造肠道生态系统中的主要细菌群落方面发挥着关键作用[32]。牦牛曲拉作为一种传统发酵乳制品,富含多种乳酸菌,包括乳杆菌属和乳球菌属等。近年来多项研究揭示了牦牛曲拉中乳酸菌的抗菌潜力。ZHANG等[33]从牦牛曲拉中分离出69种乳杆菌,通过抗菌性筛选试验,发现其中20种菌株对多种病原菌表现出不同程度的抑制作用,包括黄体分枝杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特菌、大肠杆菌、肠道葡萄球菌和铜绿假单胞菌等。另一项研究进一步发现,牦牛曲拉中有12株乳酸菌具有抗菌活性,特别是L. plantarum QZ50菌株表现出广谱抗菌活性,能够有效抑制金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和大肠杆菌等致病菌的生长[34]。此外,肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)QZ1178也被从牦牛曲拉中分离、鉴定出来,该菌株通过降低环境pH值,使鸭源鸡杆菌(Gallibacterium anatis)的细胞膜受损并导致胞质泄漏,从而发挥显著的抗菌活性[35]。余金凤等[36]从牦牛曲拉中分离出一株短乳杆菌(Lactobacillus brevis)NWMCC0322,发现其对金黄色葡萄球菌的抑菌效果最好,对甲型副伤寒沙门氏菌和大肠杆菌也具有抑菌能力。上述研究表明,牦牛曲拉中的乳酸菌不仅种类丰富,而且具有广泛的抗菌谱,能够有效抑制多种病原菌的生长,这些特性使得牦牛曲拉中的乳酸菌在病原菌的生物防治、替代抗生素等方面具有重要的应用价值。

5.2 改善肠道炎症

溃疡性结肠炎是一种炎症性肠病,其发病率和患病率逐年递增[37]。研究表明肠道微生物在溃疡性结肠炎中起到重要作用,这可能与共生微生物和潜在病原微生物之间的平衡破坏以及肠道微生物群代谢的变化有关。因此,通过补充益生菌来调节肠道微生物群逐渐成为治疗溃疡性结肠炎的一个重要方向[38]。近年来,牦牛曲拉中筛选出的多种特定益生菌株被证明具有显著的抗肠炎作用,如L. plantarum HF05和L. plantarum HF06。LIU等[39-40]研究显示在葡聚糖硫酸钠(dextran sulfate sodium,DSS)诱导的溃疡性结肠炎小鼠模型中,连续7 d摄入L. plantarum HF05(1×109 CFU)或连续24 d摄入L. plantarum HF06(1×109 CFU)均能够显著减轻小鼠的肠道炎症和氧化损伤,具体表现为降低促炎细胞因子(TNF-α、IL-6、IL-1β)表达,同时增强抗氧化酶活性和肠道屏障相关基因表达。进一步的研究表明,植物乳植杆菌HF05和HF06的后生元也具有显著的改善溃疡性结肠炎小鼠的体重减轻和结肠缩短症状的作用[40-41]。此外,乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)HF08及其后生元也被证明具有改善D-半乳糖联合DSS诱导的衰老小鼠结肠炎,且补充HF08的效果优于补充HF08的后生元,这可能归因于HF08具有调节肠道微生物群的能力[42]。

5.3 抗氧化作用

氧化应激是多种疾病的致病因素之一,而具有抗氧化能力的益生菌可作为天然抗氧化剂。刘亚东等[43]对牦牛曲拉中的乳酸菌进行了分离、筛选和鉴定,发现其中的23株乳酸菌对DPPH自由基和羟自由基均具有不同程度的清除能力。具体而言,德式乳杆菌雅各布森亚种(Lactobacillus delbrueckii subsp.Jakobsenii)的菌悬液对DPPH自由基的清除率最高,达到86.97%;而格氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)的菌悬液对羟自由基的清除率最高,为27.62%。进一步研究表明试验菌株清除DPPH自由基的物质主要存在于细胞外,而清除羟自由基的物质则主要分布于细胞内。此外,马江[28]对牦牛曲拉中的真菌进行了研究,发现白地霉(Geotrichum candidum)悬浮液对DPPH自由基和羟自由基的清除率最高,分别为69.24%和72.54%,毕赤酵母(Pichia kudriavzevii)悬浮液对超氧阴离子自由基的清除率最高,达到11.5%。上述研究结果表明,牦牛曲拉中的细菌和真菌均具有显著的抗氧化能力。

5.4 抗肥胖作用

肥胖是一种慢性疾病,不仅会降低患者的生活质量,还会增加患高脂血症、心血管疾病和2型糖尿病等多种代谢综合征的风险[44]。近年来的研究表明,肠道菌群在调节宿主能量代谢方面发挥着关键作用。因此,改善肠道微生物群的益生菌干预是改善肥胖的一种有前途的策略。CHEN等[45]从牦牛曲拉中分离出一株L. plantarum LP-HF02,发现连续给予LP-HF02菌株8周的肥胖小鼠体重显著降低,同时血脂异常和肝脂积累也得到显著改善,提示LP-HF02可以作为预防肥胖的益生菌制剂。此外,SUN等[46]也从牦牛曲拉中分离出一株鼠李糖乳酪杆菌(Lacticaseibacillus rhamnosus)HF01,将该菌(5×107 CFU)接种到200 mL牛奶中制作发酵酸奶(HF01-Y),其中含2.5×109 CFU HF01,发现连续补充HF01-Y 的12周后小鼠肥胖相关表型得到显著改善,具体表现为体重减轻、血脂和肝脂滴降低。

5.5 抗衰老作用

衰老是机体随着年龄增长而逐渐发生的不可逆生理过程,其特征是机体各功能的衰退,并常伴随肌肉衰减、阿尔茨海默病等与年龄相关的疾病[47]。在D-半乳糖诱导的小鼠加速衰老模型中,研究发现,连续8周补充从牦牛曲拉中分离的L. lactis HF08及其后生元,能够显著减轻衰老相关的肠道屏障功能障碍、炎症状态和肠道菌群紊乱[42]。进一步研究表明,牦牛曲拉中的唾液链球菌嗜热亚种(Streptococcus salivarius subsp.thermophilus)CCFM1095也对衰老小鼠的肌肉质量和功能具有改善作用,具体表现为该菌株能够显著增加D-半乳糖诱导的衰老小鼠肌肉握力和肌纤维横截面积,调节衰老小鼠的肠道菌群;此外,CCFM1095还可上调与线粒体生物合成相关的基因表达,改善氨基酸代谢和脂质代谢通路[48]。这一发现表明,CCFM1095可能通过肠-肌肉轴干预衰老相关的肌肉质量丧失和功能下降,为抗衰老治疗提供了新的益生菌策略。

5.6 抗抑郁作用

抑郁症是一种以显著且持续的心情低落为主要特征的精神障碍。氟西汀等抗抑郁药物属于选择性5-HT再摄取抑制剂,可通过阻断5-HT的再摄取发挥抗抑郁作用[49]。然而患者在缓解抑郁症状之前往往需要长期服用抗抑郁药物,且使用过程中常伴随不良副作用。近年来,使用5-HTP水平来调节5-HT代谢,从而发挥抗抑郁作用[50]。ZENG等[51]从3种发酵食品(牦牛曲拉、泡菜和酸奶)中分离出10株乳酸菌,并对它们的促5-HTP分泌能力进行了研究。结果显示,来自牦牛曲拉的戊糖乳杆菌LPQ1(Lactobacillus pentosus LPQ1)表现出最强的促5-HTP分泌作用;进一步转录组测序结果表明,戊糖乳杆菌LPQ1对5-HT分泌的促进作用与其调节肿瘤坏死因子和氧化磷酸化信号通路相关基因表达有关。此外,从牦牛曲拉中分离出的一株唾液链球菌嗜热亚种(Streptococcus thermophilus),能够显著提升小鼠血清中的5-HT水平,且对胃肠道具有良好的耐受性,提示该菌可能对和5-HT变化密切相关抑郁、焦虑症状有改善效果[52]。

6 展望

尽管现有研究已经初步探索了曲拉中益生菌资源的功能特性,但曲拉源益生菌的产品化应用尚处于起步阶段,其相关生产工艺和质量控制体系也尚未完全成熟。因此,未来需要进一步探索更加高效、稳定的生产和应用技术。此外,需深入探索曲拉源益生菌的代谢特性、临床疗效以及在不同人群中的应用效果,为优化产品配方提供科学依据,从而开发出更具针对性和有效性的益生菌产品。

目前,随着科技的不断进步,新的技术手段也为曲拉中益生菌的优化和产品化提供了新的思路和手段。例如,通过基因组学和代谢组学技术,可以深入解析曲拉中益生菌的代谢路径和功能特性。结合合成生物学技术对菌株进行改造,则有望进一步提升益生菌的功能性。除了技术层面的优化,益生菌产品的适口性、风味和营养价值也是未来产品优化的重要方向。利用现代食品加工技术,如微胶囊化技术、流化床包衣等,以及发酵技术,如深层发酵、超低温保存等,不仅可以提高益生菌的稳定性和生物活性,还能改善产品的风味和口感,从而提升相关产品的性价比。

综上所述,尽管曲拉源益生菌的研究和应用仍面临一定的挑战,但其具有多种功能特性的潜力不容忽视。随着相关技术的发展和产业化进程的推进,深入挖掘曲拉中的益生菌资源在未来将有望成为食品和健康产业中的重要组成部分。

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